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ELISA实验基础知识培训 2016 1 2 1 酶联免疫吸附实验 ELISA 基本原理及概念 2 酶联免疫吸附实验 ELISA 定量检测应用 3 ELISA实验主要设备 移液器基本使用 主要内容 第一部分酶联免疫吸附实验 ELISA 基本原理及概念 酶标抗原或酶标抗体 酶联免疫吸附试验 5 什么是抗原 能刺激机体免疫系统并启动机体的免疫应答 且能与其免疫应答产物 抗体或免疫效应细胞 特异性结合 引起一系列生物学效应的物质 免疫系统 抗原 特异性抗体 6 抗原的特点 免疫原性和抗原性 免疫原性指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答 产生特异性抗体及免疫效应细胞 的性质 记忆细胞 对抗原有记忆功能 浆细胞 特异性抗体 效应B细胞 活化分裂 7 抗原性指抗原分子与免疫应答产物 抗体或免疫效应细胞 发生特异性结合的性质 抗原失去致病能力 8 抗原决定簇大多存在于抗原物质的表面 有些存在于抗原物质的内部 须经酶或其他方式处理后才暴露出来 一个天然抗原物质可有多种和多个决定簇 抗原分子越大 决定簇的数目越多 抗原决定簇 抗原决定簇 抗原决定簇 9 哪些物质可以称之为抗原呢 常引起严重腹泻和败血症 10 病毒呈球形 衣壳由60个壳微粒组成 呈20面体立体对称 有HAV的特异性抗原 HAVAg 每一壳微粒由4种不同的多肽 蛋白质 即VP1 VP2 VP3和VP4所组成 甲肝病毒 1973年Feinslone首先用免疫电镜技术在急性期患者的粪便中拍摄的甲型肝炎病毒 HapatitisAvirus HAV 11 甲肝病毒表面的VP蛋白是具有免疫原性的蛋白 能刺激免疫系统产生特异性的抗体 甲肝病毒 12 什么是抗体 抗体是在机体对抗原刺激的免疫应答中 效应B细胞产生的一类糖蛋白 能够与相应抗原特异结合 产生各种具有免疫效应的球蛋白 免疫球蛋白 在甲型肝炎的感染过程中 机体都可产生抗HAV的lgM和lgG抗体 前者在急性期和恢复期出现 后者在恢复后期出现 并可维持多年 IgG抗体使得机体对同型病毒的再感染有免疫力 13 什么是抗原抗体反应 抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应 抗原抗体反应的特点 1 特异性 14 3 阶段性 我可找到你了 15 抗原抗体反应的特点 只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应 形成的免疫复合物沉淀最多 最大 而当抗原抗体比例超过此范围时 反应速度和沉淀物量都会迅速降低甚至不出现抗原抗体可见沉淀反应 沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系 16 如何更加灵敏的检测抗原或抗体呢 你们都看不见我 17 放射性免疫标记技术 18 放射性免疫标记技术 用放射性核素等标记物 标记抗体或抗原 进行的抗原抗体检测技术 既有抗原抗体反应的特异性 又有标记物的灵敏度 通过放射强度的改变 测定未标记抗原或抗体的含量 放射性标记物对抗原抗体反应起到了放大的作用 缺点 放射性物质对人体会产生危害 1959年由Yalow和Berson开创了放射免疫技术 radioimmunoassay RIA 这项技术开辟了医学检验史上的一个新纪元 它使得那些原先认为是无法测定的极微量而又具有重要生物学意义的物质得以精确定量 具有可与抗原 抗体共价结合的基团 用酶标记抗体 或抗原 建立免疫测定法 可以使免疫结果得以放大 保证了测定方法的灵敏度 酶可以取代放射性核素 作为一种更安全的信号 检测抗原抗体 20 Nakene和Pierce共同研究发现的酶标抗原或抗体的方法 他们共同发表了 酶标抗体 制备和抗原定位中的应用 首先提出了免疫酶技术的基本原理 酶标记抗原或抗体 酶标抗原或抗体的原理及方法 目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶 HRP 和碱性磷酸酶 AP 其次还有葡萄糖氧化酶 半乳糖苷酶 溶菌酶和苹果酸脱氢酶等 采用辣根过氧化物酶的原因 分子量小 这使得它很容易结合到抗体分子上 且结合量大大增加 有助于信号的产生 辣根过氧化物酶的底物比较宽泛 且比碱性磷酸酶敏感 酶标抗体或抗原的原理 辣根过氧化物酶中与酶活性无关的糖蛋白组分 在过碘酸钠作用下 其中的多糖羟基被氧化成活泼的醛基 后者即可与抗体蛋白中的氨基形成的Schiff s碱而交联 再经硼氢化钠还原终止反应 即得到稳定的酶标结合物 糖蛋白 过碘酸钠 抗体蛋白 氨基 羟基 醛基 Schiff s碱 22 呀 我没结合上 固相载体 23 塑料制品 抗体或蛋白质抗原可以通过非共价键或物理吸附机制结合到固相载体表面 迄今用的聚苯乙烯制成的小试管 小珠和微量反应板仍是最常用的固相载体 Wide和JerkerPorath研究并公开发表了抗原或抗体和固相载体结合的技术 测定过程中固相抗体 抗原 脱吸附率较高且不均一 从而影响测定的灵敏度和精确性由于制作时配料及生产工艺的差别 各种聚苯乙烯ELISA板的质量差异大 会影响检测结果 材料经济方法简便操作及测定易于自动化 24 ELISAHistory ELISA的分类 ELISA方法的适用范围 间接法 捕获法 主要用于血清中某种抗体亚型成分 如 IgM的测定 当抗原材料中的干扰物质不易除去 或不易得到足够的纯化抗原时 可用此法检测特异性抗体 竞争法 可用于小分子的抗原和半抗原的定量测定 以及抗体测定 小分子激素 药物等的测定多用此法 双抗体夹心法 最常用于抗原检测 且为多价抗原检测 但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原 因其不能形成两位点夹心 此法是检测抗体最常用的方法 ELISA方法的特点 28 双抗体夹心法 原理 利用连接于固相载体上的和可分别于样品中被检测抗原分子上两个不同抗原决定簇结合 形成免疫复合物 由于反应系统和相对于待检测抗原是过量的 因此复合物形成的量和待检抗原的含量成正比 测定复合物酶中加入的底物后生成的有色物质 OD值 即可确定待测抗原的含量 成正比 ELISA原理 抗体 酶标抗体 过量 过量 固相抗体 抗原 酶标抗体 固相抗体 抗原 酶标抗体 固相抗体 酶标抗体的量 29 将抗体包被在固相载体上 将抗体固定在固相载体上抗体作为一种蛋白质可以与聚苯乙烯制成的固相载体以非共价键和物理吸附的机制相结合 洗去未结合的抗原 洗去未与抗原结合的酶标抗体 TMB 底物 终止液 2mol LH2SO4 酶和底物作用后生成的物质在终止剂作用下呈现黄色 黄色的深浅和抗原含量成正比 双抗体夹心法操作 甲肝疫苗抗原检测的方法 双抗体夹心法 第二部分酶联免疫吸附实验 ELISA 定量检测应用 目录 国际法规对生物分析方法验证的要求双抗夹心ELISA检验方法实例和验证介绍ELISA分析模型的选择 GuidanceforIndustryBioanalyticalMethodValidation U S DepartmentofHealthandHumanServicesFoodandDrugAdministration FDA CenterforDrugEvaluationandResearch CDER CenterforVeterinaryMedicine CVM May2001 FDA对生物分析方法验证的要求 Typicalmethoddevelopmentandestablishmentforabioanalyticalmethodincludedeterminationof 1 selectivity 2 accuracy precision recovery 3 calibrationcurve and 4 stabilityofanalyteinspikedsamples 生物学分析方法的验证项目包括 1 专属性 2 准确度 精密度 回收率 3 标准曲线 4 稳定性 34 精密度的概念 Theprecisionofananalyticalmethoddescribestheclosenessofindividualmeasuresofananalytewhentheprocedureisappliedrepeatedlytomultiplealiquotsofasinglehomogeneousvolumeofbiologicalmatrix 精密度是指在规定的测试条件下 同一个均匀样品 经多次取样测定所得结果之间的接近程度 精密度一般用偏差 标准偏差 SD 或变异系数 或称相对标准偏差 来表示 偏差 标准偏差 SD 或变异系数越小 说明测定结果越集中 精密度越好 精密度的验证结果表明了这个检验系统检验供试品结果的波动幅度 Precisionshouldbemeasuredusingaminimumoffivedeterminationsperconcentration Aminimumofthreeconcentrationsintherangeofexpectedconcentrationsisrecommended Theprecisiondeterminedateachconcentrationlevelshouldnotexceed15 ofthecoefficientofvariation CV exceptfortheLLOQ whereitshouldnotexceed20 oftheCV whichmeasuresprecisionwithtime andmayinvolvedifferentanalysts equipment reagents andlaboratories 生物分析方法精密度评价的规定 对生物分析方法进行精密度检测实验时 检测范围内最少设置3个不同浓度 每个浓度最少进行5次重复试验 考察因素 时间 人员 设备 试剂和实验室 导致结果的因素验证结果 在相同浓度下 试验结果变异系数CV应小于15 最低检出限的要求是CV小于20 FDA对生物分析方法验证的要求 Oncetheanalyticalmethodhasbeenvalidatedforroutineuse itsaccuracyandprecisionshouldbemonitoredregularlytoensurethatthemethodcontinuestoperformsatisfactorily Toachievethisobjective anumberofQCsamplespreparedseparatelyshouldbeanalyzedwithprocessedtestsamplesatintervalbasedonthetotalnumberofsamples TheresultsoftheQCsamplesprovidethebasisofacceptingorrejectingtherun AtleastfourofeverysixQCsamplesshouldbewithin15 oftheirrespectivenominalvalue TwoofthesixQCsamplesmaybeoutsidethe15 oftheirrespectivenominalvalue butnotbothatthesameconcentration Applicationofvalidatedmethodtoroutinedruganalysis 已验证方法在常规检验中的应用 FDA 当生物分析方法建立并开始用于常规检定后 需要定期监控该生物分析方法的精密度和准确性 以确保分析方法的运行是可靠的 采取的方法是 在检验过程中 定期设置质控品 根据质控品的结果来判定实验是否成立 要求 至少4 6的质控品的测定结果在真实结果的 15 范围内 2 6的质控品测定结果超出真实结果真实结果的 15 间接证明 生物分析方法的波动还是很大的 质控品 甲型肝炎灭活疫苗内控参比品 内参 内参设置频次每块酶标板设置1个内参内参成立要求体外效力检验值在1 04 1 28之间 试验成立内参均值1 16 其 15 范围为0 99 1 33内参实际应用情况2013年6 7月间 内参共检验124次 其中10次不符合要求 合格率92 4 6 北京科兴甲肝体外相对效力检验 FDA所列的生物分析方法之一 举例说明 表明 甲肝体外内参设立标准严格于FDA法规要求目前的甲肝体外效力检验系统是稳定 可靠 目录 国际法规对生物分析方法验证的要求双抗夹心ELISA检验方法实例和验证介绍ELISA分析模型的选择 双抗夹心ELISA抗原定量检测应用举例 不同ELISA试剂盒验证的变异系数 Intra assay板内 Inter assay板间 卵清蛋白的ELISA定量试剂盒 幽门螺旋杆菌抗原 不同ELISA试剂盒验证的变异系数 Vero宿主细胞蛋白 不同的定量检测试剂盒的变异系数可接受范围有所不同 前列腺特异性抗原 目录 国际法规对生物分析方法验证的要求双抗夹心ELISA检验方法实例和验证介绍ELISA分析模型的选择 分析模型的选择根据不同ELISA检验方法的属性与要求 适用模型不同 为什么选择量反应平行线法进行有效抗原含量定量检验 在生物分析方法中 目标物的定量不能像化学和物理分析方法一样直接测量获得 质量 长度 温度 发光强度等 绝大部分的定量生物分析方法 需要依靠标准品 将待检样品的生物反应值与标准品的反应值进行比较 所得结果为相对值 所以含量单位人为命名unit u 但是 有时候待检样品和标准品的组分或性质有区别 导致待检样品中有效组分不能通