基因工程复习材料.doc

名词解释-互补：是指-半乳糖苷酶基因（LacZ）上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的LacZ基因的突变体之间实现互补，从而产生具有-半乳糖苷酶学活性蛋白的现象。 基因芯片技术：就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。 限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。 电穿孔法：是指在一个较大的电脉冲短暂破坏细胞膜的脂质双层，允许DNA等分子通过细胞膜进入细胞，而后细胞膜快速复原，保持细胞的完整。这种方法称为电穿孔法。穿梭载体：能够在两类不同宿主细胞中复制、增殖和选择的质载体，装有针对两种不同受体的复制子和遗传标记基因，便于基因克隆。反向PCR：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,即对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 人工染色体载体：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。 芯片实验室：是将纳米技术引入生物芯片，在微小的硅材料表面，制造出能够对微量样品进行变性、分离、纯化、电泳、PCR扩增、加样及检测等微小结构，使过去一个实验的各个实验步骤微缩于一个芯片上,这种技术称为芯片实验室。 核酸分子杂交：核酸分子杂交是指核酸分子(DNA或RNA)在变性以后，在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。 同尾酶:有一些来源不同的限制性核酸内切酶识别的靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。融合蛋白：是指通过将两个或多个基因的开放阅读框按一定顺序连接在一起并通过表达而形成的杂合蛋白。 基因芯片：就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。 同裂酶：不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。 基因表达: 从DNA分子有序地将其所承载的遗传信息,通过密码子和反密码子系统,转变由特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋白质分子过程，从而决定生物有机体遗传表型。 实时荧光定量PCR：实时定量PCR在检测过程中通过检测标记的荧光信号的累积来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，故称为实时荧光定量PCR。 开放阅读框架（ORF）：起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。质粒的不亲和性：在没有压力下,两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。 转化：指将质粒DNA或以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过程。 融合基因：是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。目的基因：指那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段。 限制性核酸内切酶的星活性：限制性核酸内切酶在非标准反应条件下，能切割一些与其特异识别顺序类似的序列，降低酶切反应特异性的现象。 基因组是指某种特定生物全部染色体的遗传物质的总和，其大小通常以其全部的DNA碱基对总数来表示。 基因载体:是指运载目的基因进入宿主细胞，使之能得到复制和进行表达的工具, 化学本质是DNA分子。 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 受体细胞：是指能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。 共转化：基因工程中将两个以上的基因同时导入感受态真核细胞的方法，又称共转染。 复合PCR:在一个反应体系加入多对不同的PCR引物同时扩增，获得多个PCR产物，这种PCR称为复合PCR。 cDNA文库:是指将某种生物体某一发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 基因打靶技术：基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术。 基因枪法：用高压气体加速把粘有DNA的细微金粉(或钨粉颗粒)打向细胞，穿过细胞壁、细胞膜、细胞质等层层构造到达细胞核，完成基因转移的方法。DNA的物理图谱：是指某些限制酶的特异识别序列在DNA链上的出现频率和它们之间的相对位置，表现出一些部位的线性序列，它是DNA分子结构特性的反映。 基因亚克隆：是指将较大的克隆片段经酶切后，再将所有的小DNA片段与另一个载体连接转化的过程。 报告基因：基因载体上引入的一些可证明载体已经进入宿主细胞并可将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来的具有特殊标志意义的基因。 RT-PCR:是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 表达载体：在克隆载体基础上，为使插入的外源DNA片段有效转录翻译成多肽，装有强化外源基因表达的强启动子以及利于表达产物分泌、分离和纯化的元件，这种载体称为表达载体。 基因是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 反义技术：是指根据碱基互补原理，用人工合成（或生物体合成）的特定互补RNA或DNA片段（或其化学修饰产物）抑制或封闭基因表达的技术。 转基因动物：是指在其基因组内稳定地整合有外源基因，并能遗传给后代的动物。简答题1、简述PCR引物的设计一般原则。答：引物长度一般以1830bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。 G/C和A/T碱基均匀分布， G+C含量在4060%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。 要避免两个引物间特别是3末端碱基序列互补以及同一引物自身3末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。 引物3末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3末端为G、C或T时引发效率较高。 引物5末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。 引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。 2、试述原核生物细胞表达的特点以及外源基因在原核细胞中表达具备条件。 答：原核生物细胞表达的特点：(1)只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 (2)原核生物的表达是以操纵子为单位的。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位。(3)原核生物的转录与翻译是偶联和连续进行的。 (4)原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。 (5)其基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物直接控制要慢。 (6)在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个翻译起始密码子及同16S RNA 3末端碱基互补的序列，即SD序列。条件：(1)通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。(2)外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA。 (3)必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因表达。 (4)外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(ORF)。 (5)利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。3、简述琼脂糖凝胶电泳的基本原理。 答：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。 在琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。质粒DNA样品用单一切点的酶切后与已知相对分子质量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知该样品的相对分子质量大小。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的DNA分子。 另外在制备琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭指示剂，溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍。荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描仪检测，只需要5lOng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如用肉眼观察，可检测到0.010.1g的DNA。4、简述基因文库的概念及构建基因文库的基本程序。 答：基因文库是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。基本程序：1)提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；2) DNA片段或cDNA片段与经特殊处理的载体连接形成重组DNA；3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；4)阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 另cDNA：cDNA文库是指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。操作步骤：细胞总RNA的提取和mRNA的分离；第一条cDNA合成；第二条cDNA合成；双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。另与基因组文库相比，cDNA文库（cDNA克隆）的主要优点与缺点有哪些？ 答：优点: cDNA克隆以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。cDNA基因文库的筛选比较简单易行。每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。cDNA克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，直接应用于基因工程操作。cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。 缺点：cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。cDNA基因文库不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外大量的调控序列的结构与功能方面的信息。在cDNA基因文库中，对于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，且分离也就比较困难。5、简述Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列的基本原理。 答：在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3-OH末端使引物延长合成出新的互补的DNA链。如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP),由于双脱氧核糖的3位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5-引物端和以ddNMP残基为3端结尾的一系列长短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。 6、简述实时荧光定量PCR的概念及其工作原理。 答：实时荧光定量PCR：通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积数量，可以很好的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时定量PCR。实时定量PCR在检测过程中通过检测标记的荧光信号的累积来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，故称为实时荧光定量PCR。 工作原理：利用Taq酶的53外切酶活性。在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针，该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5端标以荧光发射基因FAM（荧光发射峰值在518nm处），靠近3端标以荧光淬灭基团TAMRA（荧光发射峰值在582nm处），探针的3端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当Taq酶移动到探针切断,淬灭作用被解除，荧光信号释放出来.模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系,因此用该技术可对模板进行准确定量。基本原理简述：类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。7、氯化钙转化法的基本原理。答：细菌处于0和低渗氯化钙溶液中，细菌细胞壁和膜通透性增加,菌体膨胀成球形，此时转化混合物中DNA形成抗DNA酶的羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面,经短暂热休克(42)后，细胞膜形成许多间隙，DNA进入细胞内。 8、在大肠杆菌中高效表达外源基因必须考虑哪些基本原则？答：优化表达载体的设计。提高稀有密码子tRNA的表达作用。 提高外源基因mRNA的稳定性。提高外源基因表达产物的稳定性。 优化发酵过程。10、简述克隆载体DNA分子具备的条件。 答：载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制。 载体都具有合适的筛选遗传标记。 载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。 载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。 载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。 载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。 载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。 载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。11、碱变性抽提法提取质粒DNA的基本原理是什么？答：碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。12、简述型限制性内切核酸酶的特点及影响其活性的因素。答：特点：识别位点的DNA序列具有回文结构特点。切割DNA 均产生5-磷酸和 3-羟基的末端。错位切割产生具有5-或 3-突出的粘端，而沿对称轴切割双链DNA产生平端。少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，在一定条件下可选择用这些同尾酶。影响因素：DNA的纯度 DNA的甲基化程度 酶切消化反应的温度 DNA的分子结构 溶液中离子浓度、种类 缓冲液的pH13、T4 DNA连接酶的作用机制。 答：ATP+DNA ligase(E) E-AMP+PpiE-AMP上的AMP转移到DNA的5磷酸根上，使其活化，释放出酶。活化的5磷酸根与相邻的3羟基形成3，5磷酸二酯键，并释放出AMP。 14、简述基因载体致死效应的概念及克服基因载体致死效应的对策。 答：基因载体致死效应：利用基因载体进行基因克隆时，有时大量的克隆基因及其基因表达产物对宿主细胞是有害的，不利于宿主细胞的生长繁殖，甚至可使宿主细胞中毒死亡的现象。克服基因载体致死效应的对策： 使用严密型质粒来分离、纯化多拷贝的松弛型质粒上大量表达时可呈现致死效应的功能性基因,即用松弛型质粒与严密型质粒杂交改良。 使用温度敏感型载体。在较低温度下，目的基因不表达,宿主菌可自由生长；当宿主菌增殖达到一定数量后,提高培养温度,使目的基因大量表达。 15、简述定向克隆的优点。 答：外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒，以便目的基因的正确转录和表达。 质粒载体与外源DNA结合处的限制性内切酶位点仍然保留，可随时从重组载体中通过相应的限制性内切酶切割后分离和获得目的基因。由于不会发生自身环化,转化率高,转化后细菌克隆大多数携带有目的基因重组质粒。 16、简术Southern杂交的操作步骤。 答：酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。 通过显影检查目的DNA所在的位置。17、简述pUC质粒的结构组成。 答：含有pBR322质粒的复制起点(ori)。含有氨苄青霉素抗性基因(ampr)基因。 含有大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)启动子及其编码-肽链DNA序列(即lacZ基因)。位于lacZ基因中靠近5端引入了一段有多克隆位点(MCS)区段,但它不会引起编码肽链功能的改变。18、简述DNA体外重组的特点。 答：DNA体外连接减少了DNA分子进入宿主细胞后遭受降解的危险，增加了转化效率。 由于限制性内切酶产生的粘性末端在体外连接，使原来酶的识别序列在整个DNA维持完整性，有利于在重组子转化扩增以后再对外源基因的分离。 连接时可以控制连接反应条件，有利于形成环状分子或者几个DNA片段头尾相连接的直线多联体。 19、用噬菌体载体构建基因组文库的步骤。 答：准备载体DNA(如置换型噬菌体载体)，用适当的限制性内切核酸酶消化并分离得到载体的左右两臂；纯化真核细胞高分子质量DNA，并用适当的限制性内切核酸酶部分消化；分离适当大小的基因组DNA片段(20-24kb)； 连接载体与外源DNA；连接产物体外包装及感染；基因组文库的扩增。综合分析题1、如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆一个编码动物激素的基因，并使之在大肠杆菌中进行表达? 简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。 答：要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达，通常遇到的问题有：(1)细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子。(2)大多数真核基因有内含子，这些内含子在转录后从前体mRNA中被切除而形成熟mRNA。细菌细胞没有这样的机制来去除内含子。(3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分子加工而来的，例如胰岛素就是通过加工去除前体分子内部的33个氨基酸残基而来，剩下的两段肽链分别形成胰岛素的、链。(4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解。措施：应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子ATG的细菌强启动子的附近(含有这种序列的载体称表达载体)。可以以激素的mRNA为模板用反转录酶合成激素的基因。这种DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆。此外，如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因。合成的基因应含起始密码ATG、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列，以及12个终止密码： ATG编码序列TGA TAG。 现在，这个合成基因可被插入载体中。有时加工过程可以在离体条件下进行。如果加工有困难，可以用合成基因，从而免除加工过程。选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解。如果用酵母作为宿主上述许多问题都可以较容易地解决，尤其是现在有既能在大肠杆菌中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体。说明：1)ATG,TAG和TGA是对应mRNA中的转录起始信号AUG和终止信号UAG,UGA的DNA序列。 2)克隆生长素释放抑制因子基因时采用化学合成基因的方法。生长素释放抑制因子是一种由下丘脑分泌的激素，长14个氨基酸残基，因此人工合成的基因，包括在宿主菌中表达所需的转录的起始和终止信号，仅51bp长。2、试述表达载体pET-28a主要构成元件和pET表达载体的工作原理。 答：载体pET-28a主要构成元件：T7噬菌体启动子、乳糖操纵子、核糖体结合位点、His6标签序列、凝血酶切割位点、多克隆位点、 T7噬菌体终止子及乳糖阻遏子序列(lacI)、pBR322复制子、f1噬菌体复制子、卡那霉素筛选标记序列等。 pET-28a主要构成元件的功能：乳糖操纵子和乳糖阻遏子序列(lacI)的功能：当目的蛋白对大肠杆菌有毒性时，可能通过添加阻遏物，控制目的蛋白以较低水平表达。His6标签序列和凝血酶切割位点的功能：方便利用针对His6的螯合层析分离纯化蛋白，然后利用凝血酶切割去除标签蛋白。多克隆位点处的限制性核酸内切酶在该载体上只有单一切点,方便目的基因的插入位点。pET系列表达载体的工作原理：T7噬菌体启动子只能由T7噬菌体的RNA聚合酶识别并启动转录，因此宿主细胞必须能表达T7噬菌体的RNA聚合酶的。大肠杆菌BL21(DE3)菌株染色体BL21区整合一个噬菌体DNA，在噬菌体的DE3有一个T7 RNA聚合酶基因(T7基因1)，该基因受lacUV5启动子控制。当pET载体进入BL21(DE3)细胞后，由于宿主细胞的lacI基因表达产生阻制物，从而抑制T7 RNA聚合酶基因的表达，在载体上的目的基因也无法启动。当存在IPTG诱导物后，使阻制物失去阻制作用， T7 RNA聚合酶基因得以表达，产生T7 RNA聚合酶，从而启动T7启动子控制的外源基因的表达。 在没有诱导物存在的情况下，lac启动子控制的外源基因仍会有渗漏表达。如果外源基因对宿主细胞有害作用，就可能导致表达系统崩溃。 现有2套系统可控制外源基因的严紧表达：一套是通过宿主控制T7 RNA聚合酶的量来实现，即在宿主细胞中引入一个带有T7噬菌体的溶菌酶编码基因的质粒，如plysS或plysE，它们分别低量和高量表达T7噬菌体的溶菌酶。该溶菌酶可抑制T7 RNA聚合酶的活性，从而减少在未诱导情况下外源基因的表达。（5分）另一套是使启动子的控制效应更严紧。在pET载体上装载lacI基因，提高阻制物的浓度，同时也可利用T7-lac启动子(在T7启动子序列下游装入一个由25bp组成的lacO操纵子序列)，当阻制物结合在lacO位点时，即使存在T7 RNA聚合酶，外源基因也无法表达。只有当诱导物IPTG存在时，才能解开 T7 RNA聚合酶基因和外源基因表达的双重阻遇。3、在基因工程操作过程中，使用的克隆载体需要具备哪些条件？选择受体细胞时需要具备哪些基本原则？答：克隆载体需要具备条件： 载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制。 载体都具有合适的筛选遗传标记。 载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。 载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。 载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。 载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。 受体细胞的选择应具备的基本原则： 便于重组DNA分子的导入。 便于重组体的筛选。根据所用的表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因是否相匹配，从而易于对重组体进行筛选。 遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密度发酵而不影响外源基因的表达效率。对动物细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。 受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达。 安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。一般选用致病缺陷型的细胞或营养缺陷型细胞作为受体细胞。 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。从受体细胞的角度出发，通常的做法是是对其作适当的修饰改造，如选用某些限制性核酸内切酶缺陷型的受体细胞就可以避免其对重组DNA分子的降解破坏作用。 受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。 具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基因的高效表达。 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。 鉴定一个携带目的基因的克隆方法：带有某一细菌基因的克隆通常可以直接看出来，因为基因表达引起了宿主胞表型的可见变化。然而，真核生物的基因不都表达，则需用相应的方法来找出带有所需基因特定克隆。一个常用方法是杂交（southern杂交或菌落原位杂交）： 一、核酸杂交法利用标记的核酸做探针与转化细胞的dna进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法是将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维膜上，用碱裂菌，菌落释放的dna就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落dna上而不被洗脱。核酸探针可以用放射性核素标记，结合了放射性核酸探针的菌落集团可用放射性自显影（auroradiography）法指示出来，核酸探针也可以用非放射性物质标记，通常是经颜色呈现指示位置，这样就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。 或pcr法：pcr技术的出现给克隆的筛选增加了一个新手段。如果已知目的序列的长度和两端的序列，则可以设计合成一对引物，以转化细胞所得的dna为模板进行扩增，若能得到预期长度的pcr产物，则该转化细胞就可能含有目的的序列。 或dna限制性内切酶图谱分析：这是在上述筛选后的进一步分析。目的序列插入载体会使载体dna限制性酶图谱（restriction map）发生变化，提取转化细菌的质粒dna作酶切后做电泳观察其酶切图谱，就能分析得结果；如插入的目的序列中有其它限制性内切酶位点，也能在酶切电泳图谱上观察到。这就可以进一步鉴定重组体是不是所要的目的克隆。 二、核苷酸序列测定所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列测定来最后鉴定。已知序列的核酸克隆要经序列测定确证所获得的克隆准确无误；未知序列的核酸克隆要测定序列才能确知其结构、推测其功能，用进一步的研究。因此核酸序列测定是分子克隆中必不可少的鉴定步骤。核酸序列测定的原理和方法在实验教材中有详细的叙述。4、试述提高克隆基因在大肠杆菌中表达效率途径有哪些？答：1、优化表达载体的设计：(1)提高启动子的转录效率，选择强的可调控启动子及相关的调控序列。(2)保证核糖体结合位点的有效性，一般SD序列至少含AGGAGG序列中4个碱基。(3)提供有效的转录终止区，可防止外源基因干扰载体系统的稳定性。 2、增加表达质粒的拷贝数和稳定性：高拷贝数和稳定性高的质粒组建的表达载体，可获得较高水平的表达。 3、提高翻译水平的效率：(1)SD序列与起始密码子之间距离以93碱基为适宜。(2)尽量避免使用罕用密码子，使用高频率的密码子。(3)增加mRNA的稳定性。在外源基因的下游插入具有反转重复顺序的DNA片段可起到稳定mRNA，提高表达水平作用。 4、减轻细胞的代谢负荷：(1)诱导表达，使细菌的生长与外源基因的表达分开成2个阶