PCR技术及其应用.ppt

PCR技术及其应用 生物化学实验技术 1 目录 PCR的反应原理PCR的类型和应用PCR示例 2 多聚酶链式反应 PCR PolymeraseChainReaction KaryB Mullis PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法 此技术获得1993年诺贝尔化学奖 3 体内DNA的复制体系 DNA聚合酶 IIIIII 拓扑异构酶解旋酶类SSB 引物dNTPMg2 4 Mullis的PCR构思 5 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 酶活性 温度 405060708090100 10080604020 耐热DNA聚合酶 Saiki 1988 将耐热DNA聚合酶引入PCR 使利用热变性解链DNA模板可行 6 PCR反应循环 7 PCR的指数扩增 2n 引物 延伸 延伸 5 5 3 3 变性 退火 变性 退火 变性 退火 延伸 8 Taq P1 P2 PCR反应体系 dATP dTTP dGTP dCTP Mg2 模板 DNA引物 P1 P2DNA聚合酶 TaqE原料 dNTP反应缓冲液10 xBuffer辅助因子 Mg2 9 1 PCR反应成分 1 模板单 双链DNA均可 不能混有蛋白酶 核酸酶 DNA聚合酶抑制剂 DNA结合蛋白类 DNA模板一般100ng 100 L 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 PCR反应条件 10 2 引物浓度0 1 0 5 mol L浓度过高易导致模板与引物错配 反应特异性下降 3 TaqDNA聚合酶0 5 2 5U 50 l酶量增加使反应特异性下降 酶量过少影响反应产量 11 4 dNTP 10mMor2 5mM 含四种核苷酸dATP dGTP dCTP dTTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度过高易产生错误碱基的掺入 浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2 结合 使游离的Mg2 浓度下降 影响DNA聚合酶的活性 12 5 Mg2 Mg2 是DNA聚合酶的激活剂 浓度为0 5 2 5mmol L Mg2 浓度过低会使Taq酶活性丧失 PCR产量下降 Mg2 过高影响反应特异性 Mg2 可与负离子结合 所以反应体系中dNTP EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2 浓度 13 2 循环参数变性使双链DNA解链为单链94 30 60秒 2 退火温度由引物长度和GC含量决定 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合 降低温度可增加反应的灵敏性 14 引物设计 1 序列应位于高度保守区 与非扩增区无同源序列 2 引物长度以15 40bp为宜 3 碱基尽可能随机分布 G C占40 60 4 引物内部避免形成二级结构 5 两引物间避免有互补序列 6 引物3 端为关键碱基 5 端无严格限制 Tm G C x4 A T x2 15 3 延伸70 75 一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定 4 循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25 35次次数过多 扩增效率降低错误掺入率增加 16 PCR的应用1 特定DNA片段 基因 调控序列 的鉴定 分离或制备 A DNAB cDNA2 基因表达分析 原位 离体 A 基因是否表达B 基因表达水平高低3 基因突变 17 基因克隆 逆转录酶 聚合酶 mRNA cDNA 杂交双链 PCR扩增 18 1 细胞或组织固定 细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂 包括引物和Taq酶 进入2 PCR扩增细胞内目的片段3 原位杂交检测扩增产物 A 阳性对照 B 阴性对照 C 原位检测mRNA表达 原位 分析基因表达的组织特异性 19 荧光定量PCR real timePCR 分析基因表达水平通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针 对PCR产物进行标记跟踪 实时在线监控反应过程 结合相应的软件可以对结果进行分析 计算待测样品的初始模板量 内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes FRET 引物特异性探针Amplifluor Intergen 20 SYBR GreenI 21 反向PCR reversePCR 扩增已知序列两侧的未知序列 用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段 对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增 未知序列 未知序列 已知序列 22 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 23 实时荧光定量PCR仪 梯度PCR仪 普通PCR仪 24 25 1 材料 含0 3Kb插入片段的克隆载体2 仪器 微量移液器及吸头 PCR仪及PCR管琼脂糖凝胶电泳设备3 试剂 10XPCR反应缓冲液25mmol LMgCl210mmol LdNTP10 mol L引物1和引物2 二 实验材料 仪器和试剂 26 1 反应体系 50 l体系 10XPCR反应缓冲液25mmol LMgCl210mmol LdNTP10 mol L引物110 mol L引物2模板DNATaqE补充水 三 操作步骤 27 2 按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂并混匀 三 操作步骤 10XBuffer2 5 L 10XP12 5 L 10XT2 5 L 10XE2 5 L 25 L 水12 5 L 10XP22 5 L 28 3 PCR扩增程序 94 5 10min 预变性 94 30S55 30S72 30S72 5 10min 后延伸 4 保温 30Cycles 29 屏幕显示方式 30 31 Enter 32 循环内第一步温度和时间 33 34 不需要拓展功能 设置循环数 后延伸保温 后延伸温度