现代细胞分子生物学研究方法考试-YYY.doc

陈瑞川1.P-TEFb: physiological functions （P-TEFb的生理功能） Phosphorylates RNA pol II CTD at Ser2(在Ser2位磷酸化RNA聚合酶IICTD) A global transcriptional elongation factor(通用转录因子） Essential for more than 80% mRNA transcription (超过80%的mRNA转录都需要0 Essential for embryo development(胚胎发育必需)2.P-TEFb: pathological functions（ P-TEFb的病理功能） Exquisitely required for HIV-1 gene expression（ HIV-1基因表达所必需） Abnormally high P-TEFb activity direct link to cardiac hypertrophy（异常高的P TEFb活性和心肌肥大直接相关） May also relate to tumor progression（可能和肿瘤发展有关）3.Gene transfer-to get stable cell line(基因转移-获得稳定的细胞株)A. Transient transfection（瞬时转染）1. Liposome-mediated gene transfer: Lipofectamine transfection（脂质体介导的基因转移：脂质体转染）2.Ca3(PO4)2 mediated gene transfer（.Ca3（PO4）2的介导的基因转移）3. PEI-mediated gene transfer（PEI介导的基因转移）4. Electroporation（电穿孔）B. Stable transfection（稳定转染）1. Adenovirus infection（腺病毒感染）2. .Retrovirus infection（逆转录病毒感染）3. Lentivirus infection（慢病毒感染）4. Co-transfection.（共转染）4.How to get Stable cell line? （如何获得稳定的细胞株？）1. Infection or co-transfection(感染或共转染)2. Antibiotics selection（抗生素的选择）3. Colonies growth（菌落生长）4. Expression detection（表达检测）5. Cell line storage。(细胞系存储)5.How is activity of P-TEFb regulated?（如何调控P-TEFb的活性？） Identification of P-TEFb-associated nuclear factors and elucidation of their control of P-TEFb activity。（P-TEFb相关核因子的鉴定和P-TEFb活性控制的阐述）6.Where does 7SK located in cell? Fluorescent In Situ Hybridization荧光原位杂交Confocal laser-scanning microscopy。共焦激光扫描显微镜。7.Is 7SK snRNP a transcriptional inactive complex?A. In vitro transcription assay(体外转录分析)Step1: Setup transcription(设置转录)Step2: Transcription (转录)Step3: DNase I degrade DNA templates (DNA酶I降解DNA模板)Step4: Purify and run gel(纯化和跑胶)B. In vivo luciferase assay（体内荧光素酶检测）Confocal laser-scanning microscopy(共焦激光扫描显微镜)Confocal laser-scanning microscopy combined with sophisticated image processing techniques allow the biologist to explore the subcellular structure of the cell. Normally, it consists of optical microscopy, laser lighting sources and image capture and process system. （共焦激光扫描显微镜与先进的图像处理技术结合在一起，使生物学家探索细胞亚细胞结构。通常情况下，它由光学显微镜，激光光源和图像采集和处理系统组成。）8.HEXIM1是什么？ A 359-amino-acid nuclear protein with homologues present in higher eukaryotes.（和高等真核生物同源的359个氨基酸组成的的核蛋白质。） The mRNA and protein levels of HEXIM1 are rapidly induced when human smooth muscle cells are treated with hexamethylene bisacetamide (HMBA), a potent inducer of cell differentiation (Kusuhara et al. 1999).（当人类平滑肌细胞用六亚甲基二乙酰胺（细胞分化的有效的诱导子）处理时，HEXIM1的mRNA和蛋白质水平被快速诱导。）9.What are the functions of each domain of HEXIM1? （HEXIM1的每个结构域的功能是什么？）调控区，富含精氨酸的核定位序列，P-TEFb抑制区10.Where is the 7SK snRNA binding motif on HEXIM1?（ 在HEXIM1上7SK snRNA结合基序在哪里？）NLS is necessary for HEXIM1 kinase inhibitory function。NLS is necessary for HEXIM1 transcription inhibitory function。NLS is essential for HEXIM1 interaction with 7SK snRNA。NLS can not inhibit kinase activity of P-TEFb.（核定位序列对HEXIM1激酶抑制功能是必需的。对HEXIM1转录抑制功能是必需的。对HEXIM1和7SK snRNA的相互作用是必需的。核定位序列不能抑制P-TEFb的激酶活性。）11.How is active P-TEFb recruited to cellular promoters?(活性P-TEFb如何成为细胞启动子？)Tat, a HIV-1 encoded protein, recruits P-TEFb to the HIV-1 promoter. (Tat, HIV-1编码蛋白使P-TEFb成为HIV-1的启动子。)余春东实验动物（Laboratory Animal）是指经人工繁育、对其携带微生物实行控制，遗传背景明确或者来源清楚的用于科学研究、教学、生产、鉴定以及其他科学实验的动物。实验用动物（Experimental Animals）是指一切用于各种实验的动物，其中除了符合严格要求的实验动物外，还包括经济动物、野生动物和观赏动物。品种是人们根据不同需要而对动物进行改良、选择，即定向培育，并具有某种特定外形和生物学特性的动物群体，其特性能较稳定地遗传。如根据小鼠的毛色划分为白化小鼠和其他毛色小鼠。品系即“株”，为实验动物学的专用名词，指来源明确，并采用某种交配方法繁殖，而具有相似的外貌、独特的生物学特征和稳定的遗传特性，可用于不同实验目的的动物群体。如近交系、杂交群、封闭群等。近交系（Inbred strain）：1. 定义：是经连续20代（或以上）的全同胞兄妹交配（或亲代与子代交配）培育而成的动物，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。1909年，C.C. Little首先采用近亲繁殖，培育了DBA近交系小鼠，成为实验动物发展史上第一个近交系动物。2. 命名：根据动物的来源、历史和培育经过，以一系列字母和数字作为品系代码（strain code）来表示。3. 特性 基因位点的纯合性（Homozygosity）近交系动物中任何一个基因位点上纯合子的概率高达99，因而也能繁殖出完全一致的纯合子后代。遗传组成的同源性（Isogenicity）品系内所有动物个体都可追溯到一对共同祖先，个体在遗传上是同源的，基因型完全一致表型的一致性（Uniformity）由于基因型的一致，近交系个体的表型也是相同的，在实验中用较少的近交系动物就可获得具有统计意义的结果。对外界因素的敏感性（Sensitivity）由于近交系某些生理功能的稳定性降低，对外界环境因素变化的反应更为敏感，这使近交系更容易被制备成疾病模型动物。供研究使用。遗传特征的可辨性（Identifiability）每个近交系都有自己的标准遗传概貌，选择适当的遗传监测方法，即可分辨各个近交系。遗传组成的独特性（Individuality）每个近交系都具有独特的遗传组成和独特的生物学特性。由于这一特点，采用某近交系所作的实验结果往往不直接代表整个种属的反应，而必须在多个近交系作动物实验，以增加其代表性。分布的广泛性（Extensity）同一品系在不同地区不同国家都广泛存在，引种方便并利于研究结果的交流。背景资料的可查性（Accessibility）具有一份完整的研究背景资料，便于实验设计和结果分析。4.应用优点（1）遗传组成和遗传性状一致，对实验反应一致，因此，只需用少量的动物就可得到非常规律的实验结果。（2）组织相容性抗原一致，异体移植不产生排斥反应，是组织细胞和肿瘤移植实验中最为理想的材料。（3）明显的生物学特征，如先天畸形，高肿瘤发病率，对某些因子敏感和耐受等，这些特点在医学研究中是天然模型。（4）多个近交系同时使用不仅可分析不同遗传组成对某项实验的不同反应与影响，还可观察实验结果是否具有普遍意义。杂交群（Hybrids）1. 定义：由不同品系或种群间杂交产生的后代。一般是在两个近交系动物间进行交配所繁殖的第一代动物（F1），在第二代就产生性状分离。2. 命名：雌性亲代名称在前，雄性亲代名称局后，两者间以大写英文字母“X”相连表示杂交，将以上部分用括号括起来，在其后标明杂交代数。如，（C57BL/6 X DBA/2）F1=B6D2F13. 特点及应用（1）遗传和表型上的一致性，广泛用于营养、药物、病原体和激素的生物评估。（2）杂交优势，具有较强的生命力，对疾病的抵抗力强，适合于携带保存某些有害基因和长期慢性致死实验等等。（3）杂合的遗传组成，同时具备两个亲本品系的特点，可接受两个亲本品系的细胞、组织、器官和肿瘤移植，适用于免疫学和发育学等领域研究。（4）用于单克隆抗体的研究，目前多采用BALB/c和其他近交系F1代小鼠作单克隆抗体研究，其脾脏较同龄BALB/c小鼠大并且效果好。（5）可以作为某些疾病研究的模型。封闭群（Closed colony）1. 定义：又称远交群（Out stock）指一个与外界隔离的动物群体, 以非近亲交配方式进行繁殖产生的一个种群。不从外部引入新的个体，即不引入新基因，同时避免近亲交配，不让群体内基因丢失。至少连续繁殖4代以上的动物。2. 命名：有24个大写英文字母命名，种群名称前标明保持者的英文缩写名称，第一个字母须大写，后面的字母小写，一般不超过4个字母，保持者与种群名称间用冒号分开。如，N:NIH表示由美国国立卫生院（N）保持的NIH封闭群小鼠。3. 特点及应用（1）封闭群动物的遗传组成具有很高的杂合性，在人类遗传研究、药物筛选和毒性实验等方面有着不可代替的作用。（2）封闭群动物具有较强的繁殖力和生命力，广泛应用于实验，教学等实验中。（3）突变种所携带的突变基因通常导致动物在某些方面的异常，从而可成为生理学、胚胎学及医学研究的模型。动物福利（Animal Welfare）即维持动物生理与心理的健康与正常生长所需之一切事情。其实质指保障实验动物不受虐待并得到合理的照料。近年来越来越多的人提倡“3R”，即代替、减少和优化原则代替（Replacement）原则 要求尽可能采用低等实验动物或非实验动物，以代替高等实验动物进行实验。减少（Reduction）原则 要求尽可能较少实验动物的用量，甚至可以降低统计学要求。优化（Refinement）原则 要求优化实验设计和操作，以减轻动物的痛苦。实验小鼠的解剖学特点1. 在啮齿类实验动物中体型最小，出生时仅1.5g，11.5月龄达1822g，可供实验使用。2. 共有牙齿16个，门齿终生不断生长。3. 小鼠下颌骨的喙状突较小，髁状突发达，运用下颌 骨形态的分析技术，可进行近交系小鼠遗传监测。4. 小鼠无汗腺。5. 骨髓为红骨髓而无黄骨髓，终生造血。 6. 淋巴系统发达，外界刺激可使淋巴系统增生，因此易患淋巴系统疾病。国内外常用近交系小鼠:1. BALB/c系 2. C57BL系 3. 129sv 系4.FVB系突变系动物（mutant strain animal）是由自然变异或人工致畸，使正常染色体上的基因发生突变，而具有某种遗传缺陷或某种独特遗传特点的动物。裸小鼠,SCID小鼠, 快速老化模型小鼠.转基因小鼠（Transgenic Mice, TGM）是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的小鼠。嵌合体动物（chimeric animal）只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因。 逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法制备的动物第一代均为嵌合体。雄原核显微注射法制备的动物第一代中1-10%为嵌合体（延迟整合）。显微注射法实验程序 供体受精卵的取得 外源基因的准备 假孕母鼠（养母）的准备 显微注射导入外源基因 受精卵的移植 幼鼠的鉴定Screening Strategies(筛选策略) DNA level PCR Southern blotting RNA level RT-PCR Northern blotting RNase 保护法分析 Protein level ELISA Western blotting 优点l 外源DNA大小基本不受限制（50250kb）l 实验过程简化、直观l 相对整合率高（110）l 转基因小鼠为非嵌合体，可直接用于基因表达研究 缺点l 导入的外源基因通常是以多拷贝串联的形式随机整合l 设备昂贵l 对操作人员有较高的技术要求l 对卵子伤害大，胚胎存活率低ES细胞法 优点l 外源基因整合情况的可控性高l 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性l 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便 缺点l ES细胞系建立及培养困难l 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易l 所得个体为嵌合体基因敲除（knock-out）是20世纪80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术，指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除或用其他顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。基因敲除小鼠的建立构建打靶载体（含有一段与欲敲除的基因具有高度同源性外源基因并插入一带有启动子的选择标记基因）含有修饰后外源基因的载体利用转染的方法，如磷酸钙共沉淀、电转移和逆转录病毒介导等方法导入ES 细胞中外源基因与染色体上的靶基因发生同源重组，把修饰的外源基因置换到ES 细胞，通过筛选标记基因而检出发生同源重组的ES 细胞并在体外扩增此ES 细胞注入供体囊胚,再将带有此ES 细胞的囊胚胎移植到假孕鼠的子宫内，发育成一个嵌合体经过进一步杂交传代的方法，使外源基因纯合，即建立成基因敲除动物模型构建重组基因载体 为了提高同源重组效率，减少后阶段的工作，常用的方法是正负双向选择法( PNS) 法 用电穿孔等方法把重组DNA转入受体细胞核内用选择培养基筛选已击中的细胞 将击中的细胞转入胚胎中使其生长成转基因动物 双重基因敲除是指在一动物体内，两种基因被敲除。多用不同基因分别被敲除的动物杂交而成的。传统性(Conventional ) 敲除的缺点：1.动物过早死亡或太虚弱,无法分析基因的某些功能2.基因在某些组织器官中的功能受到其它基因缺失组织器官的影响条件性(conditional )敲除可解决这些问题王亚梅The Characteristics of Model Organisms(模式生物的特征) 1. rapid development with short life cycles, 生命周期短，生长快2. small adult size, 个体小3. ready availability,易获得4. tractability (Bolker, 1995).易处理 生命周期：雌雄同体个体产卵孵化后，经历四个幼虫期(L1-L4)。当族群拥挤或食物不足时，C. elegans会进入另一种幼虫期，叫做dauer幼虫。Dauer能对抗逆境，而且不会老化。How to choose a model organism?如何选择模式生物？ Each model organism has its own advantages and disadvantages. Choosing an appropriate model depends on the question being asked.( 每个模式生物都有自己的优点和缺点。选择一个合适的模型取决于所要解决的问题。) When studying fundamental issues of molecular biology, simpler unicellular organisms or viruses are convenient. For developmental questions, more complicated organisms should be used.（当研究分子生物学的基本问题时，简单的单细胞生物体或病毒更方便。对于发育问题，应使用较复杂的生物体。） Many laboratories find it useful to perform parallel experiments in two or more model systems to understand different aspects of a biochemical process.（许多实验室认为应该履行两个或两个以上的模型系统平行试验，以了解一个生化过程的不同方面。）WHY C.elegans? Easy and cheap to maintain in the lab(在实验室培养既简单又便宜) Rapid generation time (3-4 days)(代时短) Transparent (so that development could be followed directly)(透明，可以直接观察发育过程) Hermaphroditic (雌雄同体的) lifestyle, reproduction producing large numbers of “self-progeny” (雌雄同体的生活方式，复制产生大量的“自我后代” Males available for crossing（雄性通过杂交可以获得） Long term storage of C.elegans in liquid nitrogen (or -80C) is possible through the use of glycerol containing media在甘油介质中C.elegans可以在液氮中长期保存。） 19.000 genes: very little genes redundancy（19000个基因:很低的基因丰度） Low complexity but with organs and tissue specifications（低复杂性，但有组织和器官的分化） Genome completely sequenced (100Mbps)（基因完全被测序） A lot of information is available in the web and large amount of resources are shared within the worm community（大量的信息可以在网络中获得，蠕虫的很多资源可以共享。）秀丽隐杆线虫已经成为现代发育生物学、遗传学和基因组学研究的重要模式材料.其成体长仅1mm ，全身透明， 以细菌为食，居住在土壤中，全身共有959个细胞，性别为雌雄同体或雄性。整个的生命周期仅3天。野生型线虫胚胎发育中细胞分裂和细胞系的形成具有高度的程序性，这样就便于对其发育进行遗传学分析。一个成体的蠕虫仅由959个细胞组成。由一个受精卵发育成为成熟的成体只要二天多一点（25时需52小时）。从卵到成体每个细胞的命运以及它们沿着一定的程序，在特定时间的分裂和迁移都已搞得十分清楚。 Disadvantages（缺点） Biochemistry difficult（生化困难） No cell lines available yet（尚不能获得细胞系） Dissection of specific tissues is very difficult（特定组织的解剖比较困难）Genetics in C. elegans线虫遗传学Forward Genetics前进遗传学Random Mutagenesis 随机诱变Phenotypes genes 表型基因型Reverse Genetics反向遗传学1) RNAi 2) PCR identification of rearrangements基因重组的PCR鉴别Gene phenotypes基因型表型The Mechanism of RNA interference (RNAi)（RNA干扰的的机制）1. Double-stranded RNAs (dsRNAs; 200 nt) get processed into 20-25 nt small interfering RNAs (siRNAs) by Dicer. (双链RNA可以用Dicer加工成20-25nt的SiRNA.)2. The siRNAs assemble into endoribonuclease- containing complexes known as RNA-induced silencing complexes (RISCs).（ siRNAs聚集成含有内切核糖核酸酶的复合体，已知其是诱导RNA沉默复合体。）3. The siRNA strands are then unwound to form activated RISCs. （siRNA链变松散形成有活性的RISCs。）4. The siRNA strands subsequently guide the RISCs to complementary RNA molecules, where they cleave and destroy the cognate RNA. （siRNA随后指导RISCs结合到互补RNA分子上，在那里它们切割并破坏和其同源的RNA。）5. Cleavage of cognate RNA takes place near the middle of the region bound by the siRNA strand. （同源RNA的断裂片段取代了和siRNA链相邻的区域的中间位置。）RNAi is significant in two respects:RNAi appears to be universal.（RNAi普遍存在）RNAi could become a molecular tool for potential therapeutics .（RNAi可以成为潜在疗法的一种分子工具。）RNAi in C. elegans线虫中几种RNAi方法：by1. injecting dsRNA (tedious, effective)向线虫中注射dsRNA（单调的，有效的）DNA被注射到线虫性腺的合胞体细胞质之中。DNA可以以染色体外阵列跨越种系，将染色体外阵列以各种形式整合到线虫基因组中构成稳定的转基因系。2. soaking dsRNA (relatively easy)使线虫浸泡在dsRNA中（相对简单）3. feeding E.coli HT115 expressing dsRNA 饲喂线虫可以表达dsRNA 的E.coli HT115 (easy, can be used at genome scale)由于线虫可以大肠杆菌为食（简单，可以应用在基因组规模）几种RNAi方法的比较：Transformation by microinjection（微注射） ：Microinjection is one way of transformation to put DNA into living cells. It has been successfully used with large frog eggs, C. elegans, cultured mammalian cells, mammalian embryos, and plant protoplasts and tissues. DNA is injected into the syncytial cytoplasm of the gonads. The DNA can pass through the germ line in the form of extra chromosomal array, which can be integrated into the genome by various methods to create stable transgenic lines. DNA被注射到线虫性腺的合胞体细胞质之中。DNA可以以染色体外阵列跨越种系，将染色体外阵列以各种形式整合到线虫基因组中构成稳定的转基因系。)Purposes:1) identification of genes by rescuing a mutant phenotype using a WT copy of the gene2) Expression pattern using the gene of interest with reporter3) Interference of a biological process by over expression of WT or mutated geneTransformation by Particle Bombardment （离子攻击法转化）Physically introducing DNA into cells with a gene gun. Very tiny DN