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通过膜电解萃取方法极限萃取多肽Chuixiu Huang, Astrid Gjelstad , Stig Pedersen-Bjergaard摘要:这个基本的研究第一次阐明了在低电流系统条件下(50 m A)使用膜电解萃取方法(EME)极限萃取多肽的可能性,缓激肽,醋酸醋酸,血管紧张素抗肽,效价血管紧张素,神经降压素、血管紧张素三氟醋酸盐以及亮氨酸脑啡肽都可以通过一个含有di-(2-乙基己基)-磷酸盐 (DEHP)（溶解在有机溶剂中）的支持性液膜(SLM)从600 m L ,25 mM 磷酸盐缓冲剂(pH 3.5)中萃取，同时也可以使用薄平板膜高速设备从600 uL的酸化水受体溶液中萃取。通过SLM的多肽质量转移可以用带有负电荷的DEHP得以加强，SLM的构成和萃取电压都是影响EME中回收率和电流的重要因素。1-壬醇通过含有15%(v/v) DEHP2-癸酮稀释(1:1 v/v) 作为一个合适的支持性液膜用于低电流系统条件下多肽的极限萃取。非常有趣的是从5 到 10 m L增加SLM的量对于EME的稳定和高效是非常有利的。样品的pH也会极大地影响EME过程，pH 3.5是最优的条件，EME的高效性取决于受体溶液的结构组成，萃取的时间对于极限萃取来说也是一个很重要的因素，当EME采用15 V电压萃取15分钟时，通过SLM的系统电压低于50 m A，并且模型蛋白的萃取回收率在7794%范围内，此时，RSD不到10%。1.引言样品的预处理在分析化学上受到越来越多的关注，尤其是分析生物体液样品。没有预处理的生物体液样品被认为是一个用于直接分析复杂的基质，因为基质可能影响结果的质量和分析仪器的寿命。通常，分析物存在于低浓度的生物流体中。分析的预富集对一个可靠的定量和定性分析是必要的，此外，随着高度敏感和选择性探测器的发展，在一个简单的工作流程中，小型化和绿色的样品制备技术近年来吸引了大量的关注。微萃取技术如固定相微萃取(SPME)和液相微萃取(LPME)都是在1990年被引入，固定相微萃取被认为是一个开放的，下游范围的固定相萃取(SPE)。固定相微萃取的观点是固体支持物上的萃取剂涂布暴露在示例所需的时间，所需的时间是非常长的，已经足够萃取剂去吸附分析剂，建立平衡。同样的，液相微萃取也是一个下游范围内的液液萃取技术(LLE)，在液相微萃取中，液相微萃取。单滴微萃取(SDME)在1996首先被引入，基于分布常数，分析物提取从样品到单滴微提取阶段，这个阶段包含纳米材料，随后三相中空纤维液相微萃取(HF-LPME)被提出作为SDME的方法之一。在HF-LPME中，支持性液膜(SLM) 包含少量的中空纤维膜的微孔隙有机溶剂，用于作为水样本和液体受体溶液之间的障碍。因为萃取由被动扩散控制，它需要一个长时间提取才能达到平衡，缓慢扩散穿过SLM。基于HF-LPME系统，膜电解萃取(EME)在2006年开发的，旨在克服引入电场的HF-LPME长时间萃取的局限性。在几个小型样品制备技术中，EME是一个快速、绿色、样品制备简单、廉价的样品制备技术。在EME非极性物质中，样品中通过SLM的电离分析物包含一个纯粹的有机溶剂，并随后转移到受体溶液。同样的，EME被用于分离生物液体或水样本中的酸性药物，基本药物，有机污染物。然而EME的极性物质中如小肽,金属离子，或氨基酸，需要一个SLM中的离子对试剂，同时di-(2)-乙基己酯磷酸(DEHP) 已成为最受欢迎的载体。最近EME已经完成与多孔中空纤维契合能够支撑液膜，提供一个200um典型的膜厚度。在这个系统中，EME可以快速的对目标分析物进行分析,质量优秀的样品进行清理和高浓缩。然而，在某些情况下，由于过度电流系统(当前运行的电路)和电解，气体泡沫会产生。因此，在多数情况下，极限萃取不会实现。最近，一个基于有大容量的能力的EME设备薄膜被开发，使用新的EME配置，一些基本的药物的极限萃取得以实现。高萃取效率是由于相对较大的受体体积(600升)和薄的SLM(100um)。 据我们所知，只有几篇文章的分析报告过使用EME进行多肽分析，这些文章都是基于使用多孔中空纤维的EME作为SLM的支持体。并且萃取回收率的报告都是在1050%范围内，此外，由于DEHP和SLM中相关载体的使用，EME系统在某种程度上倾向于过度的电流系统。多肽的EME一直在初始阶段，为了将来应用，更高的提取回收率是必须的。因此，当前的基本工作重点是首先采用EME进行多肽的极限萃取，使用基于薄膜的EME设备发展。使用这个设备，样品的pH值，SLM,成分，SLM和受体溶液都用于优化以用于极限萃取，随着提取的电压和时间，除了提取回收率，这项工作也关注系统电流的水平，为了在未来开发稳定的萃取系统，后者是非常重要的。2.实验2.1试剂与材料醋酸缓激肽(BK)，血管紧张素抗肽(AT2 AP)，血管紧张素醋酸(AT2)，神经降压素(NT)，血管紧张素，三氟醋酸盐(AT1)和亮内啡呔(L-Enke)都是由瑞士巴亨公司提供。三氟乙酸(TFA)，1-辛醇，1-壬醇，正癸醇同分异构体混合物，1-十一醇、2-癸酮、 2-十一烷酮,di -(2) -乙基己酯磷酸(DEHP)购买于SigmaAldrich (St. Louis, MO,USA)。一个Milli-Q水净化系统(Molsheim, France)用于纯化水，甲酸、乙酸、硼酸、磷酸、盐酸、磷酸二氢钠、一水化物、甲醇从默克公司(Darmstadt, Germany)获得。厚度为100um的Accurel PP 1E (R/P)聚丙烯平板膜由Membrana (Wuppertal,Germany)提供。艾本德安全锁2.0毫升PP管由德国艾本德股份公司 (Hamburg, Germany)提供，标准的10- 1000uL由Sartorius Biohit Liquid Handling Oy (Helsinki, Finland)提供。白金电线(0.5毫米直径)由K.A. Rasmussen (Hamar, Norway)提供。2.2样品溶液的制备单个模型多肽的库存溶液通过溶解模型多肽到浓度为12 mg mL-1的去离子水来制备。所有这些库存溶液都存储在-32下，避免光照。样品溶液在萃取之前通过25 mM磷酸缓冲液稀释。2.3高速设置和程序原理图说明和实际设置情况如图1所示，国产的基于平板膜EME设备的制造在其他方面也有描述。简单地说，接收器部分是一个广泛的101000 m L有一块平板膜的微量移液器。因此在185下使用一个Cotech Soldering iron station (Clas Ohlson AB, Insjon, Sweden)密封在微量移液器中5s。600 m L的样品被填充在供应舱，供应舱为2.0毫升埃普多夫PP管。在应用外膜上5 m L的SLM时，另一个5 m L的SLM在填满受体溶液之前被添加到内膜上。受体溶液是600 m L，50 mM的磷酸，二个“L- shaped”电极(白金电线直径0.5毫米)分别被引入样品和受体溶液，随后，基于受体舱的膜被插入2.0毫升的埃普多夫PP管，在样品和SLM之间大约有1 mm的距离。电极与一个ES 03000.45电源相连(Delta Elektronika BV, Zierikzee, Netherlands)，这个电源与一个国产的电流监控相连接。国产的电流监控与一台电脑相连使用LabVIEW 8.2 软件(National Instruments, Austin, TX, USA)记录系统电流。EME可以通过应用电压启动，使用一个Vibramax 100 (Heidolph Instruments, Kelheim, Germany)使EME设备以900 rpm搅动，在指定萃取时间后，搅拌器能手动关闭以终止萃取。受体溶液可以立即收集，并用HPLC-UV进行分析。图一：多肽的EME解析图和EME设置真实图片2.4高效液相色谱高效液相色谱主要采用装备一个脱气器(SRD-3200)，一个泵(HPG-3200 M)，一个自动进样器(WPS-3000SL)，一个柱温箱(FLM-3100)，以及一个在214 nm下操作 VWD-3400 UV/vis检测器 (所有都来源于美国公司,桑尼维尔) 的Dionex Ultimate3000系统进行分析。数据采用来源于戴安公司的Chromeleon软件(v. 6.80 SP2 Build 2212)进行收集和处理，分离在60下，一个C18柱 (150 2.00 mm, 4mm,90 ) (Phenomenex, Torrance, CA, USA)中进行。其进样的容量为20 m L，流动相A是20 mM含有5%甲醇(v/v)的甲酸，流动相B是含有5% 甲酸的20 mM(v/v)甲醇。流动相B在十分钟内以0.4 mL min -1的速度由0增加到32%，随后流动相B进一步在0.1min内增加到80%，在达到平衡前这个条件要保持2 min。2.5计算萃取回收率(Rec)可以根据下列每个多肽的方程式进行计算：这里的i代表实际的肽，CAi(t)是多肽在受体溶液中的时间依赖性浓度，CDi (0)是样品中模型蛋白的上升浓度，V A 和 V D分别是受体和样品溶液的体积。在EME后，样品中预留的多肽(Rem)定义为最终浓度的比率及样品中最终的多肽浓度。这里C Di (t)是样品中多肽时间相关的浓度，根据质量平衡，SLM中多肽浓度被定义为(Tra)，并可以从下列方程式获得：平均系统电流(I)在EME系统中产生，可以通过以下方程式计算：这儿，I(t)可以通过即时的电流系统( m A)在时间 t下计算，n是收集的数据点的总数。3.结果与讨论3.1基于膜的EME设备的多肽评估在基本的EME研究中，有六个肽选择作为用于模型肽(BK, AT2 AP, AT2, NT, AT1 以及 L-Enke如表格一所示)，代表物理化学性质方面相对宽的跨度，基于EME设备扁平的膜在工作中被测试。当前一些基本药物的萃取可以通过一个V A 到V D 比例获取，因此，最初，六种膜多肽可以从pH 3.5，600 m的磷酸缓冲液萃取，600m L，100 mM的盐酸作为受体。EME在15 V电压下维持15min，SLM是5uL含有15% (v/v) of DEHP的1-辛醇，1-辛醇可以应用于外模的表面。BK的回收率，AT2 AP, AT2, NT, AT1 and L-Enke 分别为 49%, 57%,48%, 24%, 44%, and 54%。这些回收率在同样的水平下可以EME获得，使用多孔中空纤维作为SLM的支持。在对样品溶液和受体溶液进行分析后，SLM中肽的捕获可以使用Eq计算，并且表明多肽绑定在SLM内。系统电流的记录曲线是不稳定的，系统电流在15分钟内从100增加超过了300uA。然而，平均系统电流(大约160 m A)与先前使用多孔中空纤维作为支持的EME 和相似的SLM电流系统水平相比，然而，最初结果表明基于EME设备的平板模具有萃取多肽的潜力。3.2 提高膜电解萃取多肽的性能3.2.1不同SLM容量的实验在接下来一系列试验中，SLM的体积是变化的以检测系统电流的影响以及萃取回收率。SLM测试的体积为5, 7.5, 10, 12.5,和15uL。在所有情况下，5uL应用于SLM的外部。余下的体积数应用于SLM的内部。不同SLM容量有记录的电流系统对抗时间,以及相对于SLM容量的萃取回复分别如图2a和2b所示。如图所示，稳定的，相对低系统电流由大于7.5 u L的SLM容量记录。然而，采用5 u L的SLM容量，增加的电流也能被观察到，这可能是由于膜的穿刺作用。估计的平均电流是(Eq.) 从大约160 u A ，5 u L 的 SLM减少到大约70 uA，10 u L 的 SLM。随着SLM容量的增加，EME补偿阶段会有较小的SLM损失，系统也会变得更稳定。非常有趣，不可思议的是尽管萃取并不完全，但萃取回复随着SLM容量增加到10 m L而显著增加。相应的，10 m L的SLM用来做进一步研究。图二：不同的SLM容量以及相对于SLM容量的回复情况的电流系统曲线，EME是从600u L标准的25mM磷酸盐缓冲剂(pH值3.5)到600 uL标准的100mM盐溶液，15 V下作用 15分钟,并且SLM是含有15%可变体积DEHP的1-辛醇。N = 3, RSD 10%。3.2.2样品在不同的pH值下的实验样品的pH对于样品中模型肽的离子化以及DEHP 在供体界面的离子化是一个重要的参数，同样的，pH对于EME的高效性有很大的影响。为了研究pH对于EME的高效性，pH从2.5到4,5的25mM磷酸缓冲液添加模型肽。DEHP的pKa值大约是3.5，因此，在pH为2.5，DEHP在SLM供体表面被去离子化到10%的水平与pH为4.5，去离子化到90%的水平一致。样品中对应的pH萃取回复情况呈现在图3中，在pH 为2.5, 3.5 和4.5时，样品中剩余的多肽和SLM中捕获的多肽总结在表格2中。表格描述了许多多肽的回复情况随着样品中PH增加到3.5而增加。这也表明在SLM供体表面的DEHP离子化对于多肽的传质起着重要的作用。PH高于3.5时，四种多肽的回复速度大幅下降，这种情况的原因尚不清楚，最可能的情况是涉及到DEHP负电荷增加及随着pH增加多肽净电荷减少的复杂机制。基于已有的报道经验，pH为3.5的25 mM磷酸缓冲液可用来作为样品背景。如表格2所示，SLM中捕获的多肽一直十分显著，这也限制了萃取回复。 图三：样品中pH值对回复的影响，EME在600u L，25mM磷酸盐缓冲液到600 uL盐酸100mM磷酸盐缓冲液条件下进行,15 V下作用15分钟，并且SLM是10ul含有15%可变体积DEHP的1-辛醇。N=3,RSD10%。表格二：pH对样品中剩余的多肽和SLM中捕获的多肽的影响3.2.3不同受体溶液的实验为了检验受体溶液对EME高效性的影响，进行了二个步骤的实验，首先，三氟乙酸,盐酸、磷酸、甲酸、醋酸和硼酸在受体溶液中进行了测试，在不同的情况下，浓度都是100 mM。所有的受体溶液中，EME被测定后，样品中剩余的多肽被发现处于相同的水平。SLM中萃取回复和捕获的多肽呈现在表格3中。所有模型高的回复都可以通过受体溶液中三氟乙酸，盐酸和磷酸获得，但是硼酸和醋酸却不高效。通常情况下，比起DEHP，受体溶液含有低pKa的强酸，从而导致SLM中捕获较少的多肽。而弱酸（高pKa）能导致显著的捕获。使用三氟乙酸，SLM中多肽的捕获是2-23%，然而，三氟乙酸的系统电流超过100 m A,且被认为非常高。因此，磷酸被选为受体溶液进行余下的实验。第二, EME在不同浓度的磷酸作为受体溶液条件下进行,分别包括50, 100, 150,200, and 250 mM的磷酸溶液。在不同磷酸溶液浓度条件下，回复上没有明显的不同。但是高浓度的磷酸溶液会有稍高的系统电流。基于这个结果，50mM的磷酸溶液用于本研究接下来的实验。表格三：受体溶液组分对萃取回复和SLM中捕获的多肽的影响3.2.4不同SLM的组分的实验使用1-辛醇可能会造成生物样品的稳定性问题，因此，为了用低水溶性替换1-辛醇，其他醇类和酮类被测试。即1-壬醇、正癸醇同分异构体、1-undercanol 、2-癸酮、2-十一烷酮,混合物。正壬醇和1-壬醇一样的高效，但正癸醇,1-undercanol是低效的。有趣的是，2-癸酮、2-十一烷酮对于AT2 AP和 L-Enke也是低效的。但是他们作用于其他多肽和低系统电流时却和1-壬醇一样高效，不利的是在EME系统条件下，1-壬醇会比正辛醇产生稍高的系统电流。因此，1-壬醇用酮(癸酮)稀释1 到 1 (v/v)被用来作为有机溶剂减少系统电流。因为大量在SLM供体界面质子化的DEHP是一个影响EME效率的重要因素。对SLM中DEHP的量进一步优化，SLM中DEHP的测试量分别是5, 10, 15, 20, 和25% (v/v)。相对于DEHP量的回复情况以及系统电流的曲线呈现在图四中。AT2 AP 和 NT的回复随着DEHP量的增加而增加，然而对于其他多肽他们的回复没有明显的区别。在EME系统中，高的DEHP量会产生稍高的系统电流，基于这个结果，1-辛醇用含有15% DEHP 的2-癸酮(1:1 v/v)稀释被选择用于本研究最后的实验。图四： DEHP对回复以及系统电流的影响3.2.5用不同萃取电压实验在以上报告的实验条件下，在某种程度上，多肽一直在SLM系统中被捕获。因此，采取不同的电压进行额外的实验。测验电压从5 to 25 V。相对于萃取电压曲线和相应系统电流曲线的萃取回复展现在图五中。通常情况下由于SLM中捕获多肽的减少，所有多肽的回复随着萃取电压而增加。然而，高的电压也会产生高的电流，因此必须考虑EME的高效性和稳定性。15 V的电压是最合适的电压。图五:萃取电压对回复和系统电流的影响3.2.6不同萃取时间的实验最后，EME实验进行5, 10, 15, 20, 25, 30 and 45 min，EME后对样品和受体溶液进行分析。在受体溶液和样品种建立了分析物分布配置文件分别如图6a和6b所示，多种带点多肽BK, AT2, NT, 和 AT1比起单个或非带点多肽AT2 AP和L-Enke的损耗更快。这表明SLM受体界面质子化的DEHP和带正电的多肽复杂组分对于多肽损耗率是十分重要的的因素。在EME十分钟后，所有多肽在样品中（除了AT2 AP 和 L-Enke）都无法检测。L-Enke是pH 3.5的非电荷并且L-Enke的传质主要由被动扩散决定。