siRNA的制备方法及各种方法优缺点分析

siRNA 的制备方法及各种方法优缺点分析的制备方法及各种方法优缺点分析 越来越多的研究人员开始采用小分子干扰 RNA small interfering RNAs siRNAs 来抑制特 定的哺乳动物基因表达 siRNA 是一种短片断双链 RNA 分子 能够以同源互补序列的 mRNA 为靶目标降解特定的 mRNA 这个过程就是 RNA 干扰途径 RNA interference pathway RNAi 的应用包括功能基因组学 药物靶筛选 细胞信号传导通路分析等等 目前为止较为常用的目前为止较为常用的 5 种制备种制备 siRNAs 的方法包括的方法包括 化学合成 体外转录 长片断 dsRNAs 经 RNase III 类降解 e g Dicer E coli RNase III siRNA 表达载体或者病毒载体在细胞中表达 siRNAs PCR 制备的 siRNA 表达框在细胞中表达 前面 3 种方法包括体外制备 siRNAs 然后经过转染或者电转导入哺乳动物细胞后面两种 方法则依赖能够表达 siRNAs 的 DNA 载体或者表达框转染到细胞中 每种方法都有自己的 优点和缺点 哪种是最好的方法 其实取决于实验目的 这里简单介绍这 5 种方法 优点 和缺点 以及它们最适合的应用 siRNA 的设计的设计 除了方法 3 以外 其他的方法都在制备 siRNA 前都需要单独设计 siRNA 序列 关于 怎样设计 siRNA 以及 siRNA 设计对 siRNA 功能的影响 尽管我们不断掌握越来越多有关 设计原则的信息 但这仍然不是精确的 通常来说 每个目标序列设计 3 4 对 siRNAs 在后面的实验中选择最有效的那个 网上有提供免费的 siRNA 设计工具 体外制备体外制备 1 化学合成化学合成 尽管化学合成是最贵的方法 但是却是最方便的 研究人员几乎不需要做什么工作 包括 Ambion 和 Qiagen 公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成 siRNA 主要的缺 点包括价格高 定制周期长 特别是有特殊需求的 由于价格比其他方法高 为一个基因 合成 3 4 对 siRNAs 的成本就更高了 比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列 再进行化学合成 最适用于 已经找到最有效的 siRNA 的情况下 需要大量 siRNA 进行研究 不适用于 筛选 siRNA 等长时间的研究 主要原因是价格因素 2 体外转录体外转录 通过体外转录的方法可以合成 siRNAs 这样的成本相对化学合成法而言比较低 是一 种性价比高的筛选 siRNAs 的好方法 更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的 得到 siRNAs 以 Silencer siRNA Construction Kit 为例 一旦得到 DNA Oligo 模版 这个 还是需要 DNA 合成的 不过 DNA 合成的成本就比较低了 只要 24 小时就可以 不需要 等很久 这个方法的不足之处是实验的规模受到限制 虽然一次体外转录合成能提供足够 做数百次转染的 siRNAs 但是反应规模和量始终有一定的限制 而且和化学合成相比 还 是需要占用研究人员相当的时间 毕竟 化学合成只需要定购就可以了 值得一提的是 体外转录得到的 siRNAs 只要较低的浓度就可以达到化学合成 siRNAs 较高浓度得到的效果 0 5 20 nM vs 50 100 nM per transfection 图 2 最适用于 筛选 siRNAs 特别是需要制备多种 siRNAs 化学合成的价格成为障碍时 不适用于 实验需要大量的 一个特定的 siRNA 长期研究 Figure 1 Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRN As to Induce Gene Silencing siRNAs targeting Actin were prepared b y chemical synthesis Ambion or by in vitro transcription using Ambi on s Silencer siRNA Construction Kit HeLa cells were plated at 30 0 00 cells per well in a 24 well tissue culture plate containing glass slides The cells were transfected 24 hours after plating using 2 l siPORT Lipid Ambion according to the manufacturer s protocol at a final siRNA concentration of 75 nM Immunofluorescence analysis was p erformed 96 hr post transfection using mouse anti Human Actin prima ry antibody and a FITC conjugated anti mouse IgG secondary antibody Photographs were taken using the appropriate fluorescent filters and quantified using MetaMorph software Note that both siRNA preparation methods resulted in 95 reduction in actin protein levels 3 用用 RNase III 消化长片断双链消化长片断双链 RNA 制备制备 siRNA 其他制备 siRNA 的方法的缺陷是需要设计和检验多个 siRNA 序列以便找到一个有效的 siR NA 而用这种方法 制备一份混合有各种 siRNAs 混合鸡尾酒 就可以避免这个缺陷 这个 方法是选择通常是 200 1000 碱基的靶 mRNA 模版 用体外转录的方法制备长片断双链 dsR NA 然后用 RNase III or Dicer 在体外消化 得到一众 siRNAs 混合鸡尾酒 在除掉没有 被消化的 dsRNA 后 这个 siRNA 混合物就可以直接转染细胞 方法和单一的 siRNA 转染一样 由于 siRNA 混合物中有许多不同的 siRNAs 通常能够保证目的基因被有效地抑制 dsRNA 消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效 siRNA 序列的步骤 为研究人员 节省时间和金钱 注意 通常用 RNAse III 通常比用 Dicer 要便宜 不过这种方法的缺点也很 明显 就是有可能引发非特异的基因沉默 特别是同源或者是密切相关的基因 现在多数的研 究显示这种情况通常不会造成影响 1 4 Ambion 公司曾经用它的 Silencer siRNA Cocktail K it RNase III 试剂盒成功关闭几个基因 包括 c fos GAPDH La actin 和 Ku 70 最适用于 快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 不适用于 长时间的研究项目 或者是需要一个特定的 siRNA 进行研究 特别是基因治疗 Figure 2 Gene Silencing with the Silencer siRNA Cocktail Kit A population of siRNAs targeting 200 nt of the Ku 70 mRNA was prepared with the Silencer si RNA Cocktail Kit RNase III and transfected into HeLa cells at a final concentr ation of 100 nM Cells were analyzed 48 hours later by immunofluorescence K u 70 levels were reduced 86 in cells transfected with the siRNA cocktail co mpared to non transfected controls 体内表达体内表达 前面的 3 种方法主要都是体外制备 siRNAs 并且需要专门的 RNA 转染试剂将 siRNAs 转 到细胞内 而采用 siRNA 表达载体和基于 PCR 的表达框架则属于 从转染到细胞的 DNA 模 版中在体内转录得到 siRNAs 这两种方法的优点在于不需要直接操作 RNA 4 siRNA 表达载体表达载体 多数的 siRNA 表达载体依赖 3 种 RNA 聚合酶 III 启动子 pol III 中的一种 操纵一段小的 发夹 siRNA 在哺乳动物细胞中的表达 1 4 这 3 类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的 U6 启 动子和人 H1 启动子 之所以采用 RNA pol III 启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更 多的小分子 RNA 而且它是通过添加一串 3 到 6 个 U 来终止转录的 要使用这类载体 需 要订购 2 段编码短发夹 RNA 序列的 DNA 单链 退火 克隆到相应载体的 pol III 启动子下游 由于涉及到克隆 这个过程需要几天的时间 同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确 的 不过幸好载体容易大量扩增 这个优点足以弥补所有缺陷 特别是当载体在实验中确实有 效的时候 毫无疑问 siRNA 表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法 带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达 持续数星期甚至更久 即使是对 转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选 也有助于富集带质粒的细胞 这也可以帮助解决 一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题 最近多个厂家开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于 siRNA 表达 其优势在于可以直接 高效率感染细胞进行基因沉默的研究 避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便 最适用于 已知一个有效的 siRNA 序列 需要维持较长时间的基因沉默 或者需要用抗生素筛 选能表达 siRNA 的细胞 长期研究 不适用于 筛选 siRNA 序列 其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时 繁琐的工作 Figure 3 Long Term Silencing of GFP with pSilencer 2 1 U6 hygro HeLa cell s expressing cycle 3 GFP were transfected with pSilencer 2 1 U6 hygro contain ing an insert encoding an siRNA targeting cycle 3 GFP or pSilencer 2 1 U6 hyg ro without an siRNA encoding insert Following transfection the cells were sele cted with hygromycin Three weeks following selection the cells were analyzed for GFP expression by fluorescence microscopy Green GFP Blue DAPI staine d nuclei GFP levels were remarkably reduced 94 in cells transfected with t he GFP siRNA encoding pSilencer 2 1 U6 hygro siRNA Expression Vector as co mpared to those transfected with an empty siRNA expression vector 5 siRNA 表达框架表达框架 siRNA 表达框架 siRNA expression cassettes SECs 是一种由 PCR 得到的 siRNA 表达 模版 能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中 这个方法最早是由 Castanotto 和 其同事 5 采用 包括一个 RNA pol III 启动子 一段发夹结构 siRNA 一个 RNA pol III 终止 位点 和 siRNA 表达载体不同的是 SECs 不需要载体克隆 测序等颇为费时的步骤 可以直 接由 PCR 得到 不用一天的时间 因此 SECs 成为筛选 siRNA 的最有效工具 甚至可以用 来筛选在特定的研究体系中启动子和 siRNA 的最适搭配 如果在 PCR 两端添加酶切位点 那 么通过 SECs 筛选出的最有效的 siRNA 后 可以直接克隆到载体中构建 siRNA 表达载体 构 建好的载体可以用于稳定表达 siRNA 和长效抑制的研究 这个方法的主要缺点是 PCR 产物很难转染到细胞中 如果有适合的新型转染试剂能提高 S EC 的转染效率的话 那问题就可以解决了 另外 没有克隆到载体中的 PCR 片断并不适于大 规模制备 Silencer Express siRNA Expression Cassette Kits 提供人源和鼠源的 U6 启动子或者人 源 H1 启动子元件可供选择 并已经过 c fos 基因抑制的检验 最适用于 筛选 siRNA 序列 在克隆到载体前筛选最佳启动子 不适用于 长期抑制研究 如果克隆到载体后就可以了 Figure 4 Variable Reduction in Target Gene Expression Using SECs with Differ ent Promoters siRNA Expression Cassettes featuring the mouse U6 Mo U6 h uman U6 Hu U6 and human H1 Hu H1 promoters and encoding a c fos sp ecific hairpin siRNA were transfected into HeLa cells 72 hours post transfectio n the cells were assessed using nuclear staining with DAPI and immunofluores cence using a c FOS antibody Non transfected cells NT as well as cells trans fected with an SEC expressing a negative control siRNA scramble demonstrat e wild type levels of c FOS The relative level of reduction in gene expression was q