肥胖易感基因交互生殖与环境因素对XX乳腺癌易感的相关性研.doc

肥胖易感基因交互生殖与环境因素对XX乳腺癌易感的相关性研 肥胖易感基因交互生殖与环境因素对女性乳腺癌易感的相关性研究 一、立项的背景和意义乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，已成为严重的公共卫生问题。 国际癌症研究组织最新数据表明，xx年世界新发乳腺癌病例约138万，占所有新发癌症的23%1。 近年来，中国女性乳腺癌的发病率呈逐年上升的趋势，尤其在京沪津及沿海地区更为明显。 流行病学研究表明，许多生殖及环境因素（比如月经初潮年龄、是否生育、首次生育年龄、是否有哺乳经历、自然绝经年龄、雌激素替代治疗、高脂饮食、吸烟、饮酒和肥胖等）是乳腺癌的重要影响因素2。 随着候选基因研究和全基因组关联研究方法的不断完善，越来越多的乳腺癌易感基因被发现。 遗传因素在乳腺癌的发病中的重要意义也日益受到关注。 而且，多数研究支持遗传-环境因素交互作用可能是乳腺癌的发病机制2,3。 因此，从基因和环境因素综合探讨乳腺癌的发病和进展，对于乳腺癌的预防、干预及治疗具有重要的科学意义。 肥胖与乳腺癌的关系一直是国内外学者研究热点，但是肥胖引起乳腺癌的机制至今尚未明确。 研究发现绝经前和绝经后女性在肥胖和乳腺癌危险性关系方面存在显著差异绝经后肥胖女性患乳腺癌的危险性升高，而绝经前肥胖女性患乳腺癌的危险性降低。 但无论是绝经前还是绝经后肥胖都会对乳腺癌的预后产生不良影响4。 近年来，脂肪组织内分泌功能的研究及肥胖易感基因的发现，为肥胖影响女性乳腺癌的发生机制研究提供了新的线索。 二、国内外研究现状和发展趋势瘦素是肥胖基因所编码的蛋白产物，包含166或167个氨基酸。 瘦素主要由白色脂肪组织分泌，但其他许多组织如胃黏膜上皮细胞、乳腺上皮细胞及肝星状细胞等也能检测到。 瘦素与其受体结合后，作用于下丘脑、胰腺、甲状腺、肾上腺和性腺等部位，同时又接受这些神经内分泌器官的负反馈调节，可以降低食欲，增加能量的消耗，从而减轻体重。 瘦素的复杂生物学作用也包括参与肿瘤的发生及发展。 大量的研究发现瘦素在体外可以促进乳腺癌细胞生长和转化5。 关于血清中瘦素与乳腺癌的关系，多数学者认为存在相关性，但也有研究表明不相关。 乳腺癌组织中的瘦素及其受体表达研究表明，在乳腺癌中瘦素可能通过自分泌促进了致癌作用和远处转移6。 另外，对于瘦素与雌激素关系的研究表明，瘦素促使脂肪组织将雄性激素前体雄二烯酮通过芳香化作用向雌酮转化，从而使体内雌激素水平升高，促使乳腺癌发病率增加，这一点在绝经后女性表现尤为突出7。 瘦素基因（LEP）位于7号染色体q31.3，参与体重调控、细胞分化、存活、转移、血管生成和免疫应答8。 瘦素受体基因（LEPR）位于1号染色体p21位置。 目前，一些研究报道了位于LEP基因的G2548A(rs7799039)和LEPR基因的Q223R(rs1137101)位点与乳腺癌的关系。 但研究结果存在矛盾。 本课题组的一项Meta分析表明，LEPR基因的Q223R位点与乳腺癌在亚洲人群中存在负性关联，但在非洲和欧洲人群中无关联9。 值得注意的是，亚洲人群的结论仅仅2项研究（1项韩国人群10和1项中国人群11）。 而且，2项研究的样本量也不大（合计乳腺癌病例人数为285例）。 因此，目前的研究结论有待于较大样本量的研究进一步进行验证。 而对于LEP基因的G2548A与乳腺癌关系的研究，目前仅有3项欧洲人群的报道，而无亚洲人群的报道。 Meta分析表明，该位点与乳腺癌在欧洲人群中无关联9。 因此，尚需在亚洲人群中进行研究。 脂联素也是脂肪细胞分泌的细胞因子，由244个氨基酸组成。 脂联素参与多种生理过程的调节,调节糖、脂肪酸代谢,改善胰岛素抵抗,对2型糖尿病,动脉粥样硬化有保护作用。 最近研究表明，绝经后妇女具有较高脂联素水平可以显著降低乳腺癌的风险12-14。 而且，Dieudonne等15通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测乳腺癌细胞系，发现在MDA-MB-231和T47-D细胞系中AdipoRl和R2的mRNA表达，在细胞系MCF-7中检测到AdipoRl表达。 人脂联素基因（ADIPOQ）全长约17kb，位于染色体3q27，由3个外显子和2个内含子组成。 目前关于脂联素基因多态性与乳腺癌关系的研究较少，仅2项混合人群、1项欧洲人群和1项中国人群的研究，但结果也存在分歧。 最早的1项欧洲人群表明，ADIPOQ基因+45T/G(rs2241766)和+276G/T(rs1501299)位点与乳腺癌存在关联16。 但后续的3项研究，未发现ADIPOQ基因位点与乳腺癌的关联性17-19。 值得注意的是，关于中国人群的研究，仅有68名乳腺癌病例和62名健康对照19。 因此需要增加样本量进一步研究脂联素基因多态性与中国女性乳腺癌的关系。 全基因组关联研究表明，位于第16号染色体上的体脂和肥胖相关基因（FTO）可能是欧洲人群肥胖和2型糖尿病的易感基因20，后续的其它人种的研究也印证了该结论21。 尽管FTO基因的功能还不清楚，有研究表明FTO基因编码2-氧化戊二酸-核酸脱甲基酶22。 FTO在许多组织中表达，比如胰腺、肝脏和脂肪组织等，尤其在下丘脑中高度表达。 而下丘脑是调节能量代谢的重要中枢。 人群研究表明，FTO基因主要参与食物的选择和摄入，而不是参与调节能量消耗。 即该基因变异导致食欲旺盛或者更偏爱高能量食物23。 最近的一项研究表明，FTO RNA在也在乳房组织中表达24。 同时，该研究表明，FTO基因rs 9939609、rs 1477196、rs7206790和rs8047395四个位点均与乳腺癌显著相关，尤其以rs1477196位点关联性最强。 而另一项研究，却发现FTO基因rs9939609和rs9930506位点与波兰人群的乳腺癌无关联性25。 黑皮质素受体-4基因（MC4R）基因位于第18号染色体q22，由322个氨基酸蛋白质组成。 与FTO基因类似，MC4R基因在下丘脑以及中枢神经系统其他部位表达较高。 MC4R基因具有调节增进和减退食欲的信号，进而达到调节饮食摄入和能量消耗的作用。 最初的研究表明，MC4R基因突变与儿童期严重肥胖存在显著相关。 对欧洲人群的全基因组关联研究发现，MC4R rs17782313位点危险等位基因可以增加BMI和体脂量，从而引起肥胖26。 目前，仅有1篇波兰人群的研究报道MC4R rs17782313位点与乳腺癌之间不存在关联。 值得注意的是，该研究仅纳入134名乳腺癌病例。 同时，关于亚洲人群尚未见报道。 本课题拟采用病例-对照研究设计方法，选取进行外科手术治疗的女性乳腺癌患者500例。 同时从体检中心选择500例健康女性作为对照组。 在收集生殖及环境因素的基础上，进一步检测6个易感基因SNP，分别为LEP rs 7799039、LEPR rs 1137101、ADIPOQ rs 2241766、ADIPOQ rs 1501299、FTO rs1477196和MC4R rs17782313。 通过本次研究， (1)探讨基因单个位点多态性与女性乳腺癌的关系，为乳腺癌的早期预测、预防、诊断和治疗奠定基础。 (2)探讨基因-基因交互作用对女性乳腺癌的影响，从而更深入了解乳腺癌的遗传机制。 (3)探讨基因-环境交互作用对女性乳腺癌的影响，从而阐明女性乳腺癌基因多态性对环境因素的易感性差异。 对于携带乳腺癌易感基因的个体，通过鼓励他们减少环境危险因素的暴露，养成健康的生活方式，从而降低乳腺癌患病风险。 参考文献1Ferlay J,Shin HR,Bray F,Forman D,Mathers C,Parkin DM.Estimates ofworldwide burdenof cancer inxx:GLOBOCANxx.Int JCancer.xx;127 (12):2893-2917.2Song M,Lee KM,Kang D.Breast cancerprevention basedon gene-environment interaction.Mol Carcinog.xx;50 (4):280-290.3Narod SA.Genes,the environment,and breast cancer.Lancetxx;375 (9732):2123-2124.4Loi S,Milne RL,Friedlander ML,McCredie MR,Giles GG,Hopper JL,Phillips KA.Obesity andoutes inpremenopausal and postmenopausal breast cancer.Cancer EpidemiolBiomarkers Prev.xx;14 (7):1686-1691.5Hu X,Juneja SC,Maihle NJ,Cleary MP.Leptin-a growthfactor innormal andmalignant breastcells andfor normalmammary glanddevelopment.J NatlCancer Inst.xx;94 (22):1704-1711.6Ishikawa M,Kitayama J,Nagawa H.Enhanced expressionof leptinand leptin receptor(OB-R)in humanbreast cancer.Clin Cancer Res.xx;10 (13):4325-4331.7Catalano S,Mauro L,Marsico S,Giordano C,Rizza P,Rago V,Montanaro D,Maggiolini M,Panno ML,AndS.Leptin induces,via ERK1/ERK2signal,functional activationof estrogenreceptor alphain MCF-7cells.J BiolChem.xx;279 (19):19908-19915.8Jarde T,Perrier S,Vasson MP,Caldefie-Chezet F.Molecular mechanismsof leptinand adiponectinin breast cancer.Eur JCancer.xx;47:33-43.9Chibo Liu,Liu Liu.Polymorphisms inthree obesity-related genes(LEP,LEPR andPON1)and breast cancer risk:a meta-analysis.xx;32 (6):1233-40.10Woo HY,Park H,Ki CS,Park YL,Bae WG.Relationships amongserum leptin,leptinreceptor gene polymorphisms,and breast cancer inKorea.Cancer Lett.xx;237:137-142.11Han CZ,Du LL,Jing JX,Zhao XW,Tian FG,Shi J,et al.Associations amonglipids,leptin,and leptinreceptorgeneGin223Arg polymorphisms and breastcancerinChina.Biol TraceElem Res.xx;126:38-48.12Tworoger SS,Eliassen AH,Kelesidis T,Colditz GA,Willett WC,Mantzoros CS,Hankinson SE.Plasma adiponectinconcentrations andrisk ofincident breastcancer.J ClinEndocrinol Metab.xx;92 (4):1510-1516.13Korner A,Pazaitou-Panayiotou K,Kelesidis T,et al.Total andhigh-molecular-weight adiponectinin breastcancer:in vitroand invivo studies.J ClinEndocrinol Metabxx;92:1041-1048.14Chen DC,Chung YF,Yeh YT,et al.Serum adiponectinand leptinlevels inTaiwanese breastcancer patients.Cancer Lettxx;237:109-114.15Dieudonne MN,Bussiere M,Dos SantosE,Leneveu MC,Giudicelli Y,Pecquery R.Adiponectin mediatesantiproliferative andapoptotic responsesin humanMCF7breastcancercells.Biochem BiophysRes Commun.xx;345 (1):271-279.16Kaklamani VG,Sadim M,Hsi A,Offit K,Oddoux C,Ostrer H,Ahsan H,Pasche B,Mantzoros C.Variants of the adiponectinand adiponectinreceptor1genes andbreastcancer risk.CancerRes.xx;68 (9):3178-3184.17Teras LR,Goodman M,Patel AV,Bouzyk M,Tang W,Diver WR,Feigelson HS.No associationbetween polymorphismsin LEP,LEPR,ADIPOQ,ADIPOR1,or ADIPOR2andpostmenopausalbreastcancerrisk.Cancer EpidemiolBiomarkers Prev.xx;18 (9):2553-2557.18Nyante SJ,Gammon MD,Kaufman JS,Bensen JT,Lin DY,Barnholtz-Sloan JS,Hu Y,He Q,Luo J,Millikan RC.Common geicvariation inadiponectin,leptin,and leptinreceptor andassociation withbreastcancersubtypes.Breast CancerRes Treat.xx;129 (2):593-606.19崔红霞.脂联素及脂联素基因多态性与乳腺癌发病风险的相关性研究.山西医科大学硕士学位论文,xx,1-35.20Frayling TM,Timpson NJ,Weedon MN,Zeggini E,Freathy RM,Lindgren CM,Perry JR,Elliott KS,Lango H,Rayner NW,et al.A monvariant inthe FTO gene isassociated withbody massindex andpredisposes tochildhood andadult obesity.Science.xx;316 (5826):889-894.21Peng SH,Zhu YM,Xu FY,Ren XB,Li XB,Lai MD.FTOgenepolymorphismsand obesity risk:a meta-analysis.BMC Medicine,xx,9:71.22Gerken T,Girard CA,Tung YC,Webby CJ,Saudek V,Hewitson KS,et al.The obesity-associated FTOgene encodesa2-oxoglutarate-dependent nucleicacid demethylase.Sciencexx,318:1469-1472.23Cecil JE,Tavendale R,Watt P,et al.An obesity-associated FTOgene variantand increasedenergy intakein children.N EnglJ Med,xx,359 (24):2558-2566.24Kaklamani V,Yi N,Sadim M,Siziopikou K,Zhang K,Xu Y,Tofilon S,Agarwal S,Pasche B,Mantzoros C.The roleofthefat massandobesityassociated gene(FTO)in breastcancerrisk.BMC MedGe.xx;12:52.25Kusinska R,Grniak P,Pastorczak A,Fendler W,Potemski P,Mlynarski W,Kordek R.Influence ofgenomic variationin FTOat16q12.2,MC4R at18q22and NRXN3at14q31genes onbreastcancerrisk.Mol BiolRep.xxJun19.Epub aheadof print26Loos RJ,Lindgren CM,Li S,Wheeler E,Zhao JH,Prokopenko I,Inouye M,Freathy RM,Attwood AP,Beckmann JS,et al.Common variantsnear MC4R areassociated withfat mass,weight andrisk ofobesity.Nat Ge.xx;40 (6):768-775. 三、研究开发内容和技术关键研究内容本课题拟采用病例-对照研究设计方法，选取进行外科手术治疗的女性乳腺癌患者500例（所有患者经组织病理学确诊，术前未经放射和抗癌药物治疗）。 同时从体检中心选择500例健康女性作为对照组（地区、年龄与病例组进行匹配）。 所有入选研究对象均有由本人和其父母/监护人签署书面知情同意书。 本课题获得医院伦理委员会的同意。 研究内容包括 (1)提取DNA及基因型检测采集空腹12小时静脉血5ml，采用盐析法从外周白细胞提取DNA，并进行DNA鉴定和定量。 根据测定的原液DNA浓度（ng/?l），加入TE液，稀释DNA终浓度为50ng/?l。 使用ABI实时荧光定量PCR仪对LEP rs 7799039、LEPR rs 1137101、ADIPOQ rs 2241766、ADIPOQ rs 1501299、FTO rs1477196和MC4R rs17782313进行基因型检测。 (2)体格检测包括身高、体重和腰围。 身高采用立式身高计测定，身高(身长)精确度为0.1cm。 体重采用最大称重140kg的杠杆秤测定，精确度为0.1kg。 测量时调查对象只穿一层轻薄的短衫和短裤，脱鞋。 根据身高、体重测量值计算体重指数(BMI)=体重/身高(kg/m2)。 腰围测量时要求受试者直立，双足分开30度，将围度尺放在右侧以腋中线髂前上嵴与第十二肋骨下缘连线中点的水平位置为测量点。 在双侧测量点做标记，使围尺下缘通过双侧测量点，在正常呼气末测量腰围，读数精确至0.1cm。 (3)生殖、环境因素的收集包括研究对象的肿瘤家族史、月经史、怀孕史、哺乳史、流产史、口服避孕药史、绝经状态、绝经方式、雌激素替代治疗史、吸烟、饮酒、饮茶、食用蔬菜、水果、腌制食品和动物油等。 变量的赋值方法见表1。 表1变量的定义及赋值变量名肿瘤家族史（直系亲属）“无”=0；“有”=1初潮年龄怀孕史哺乳史流产史口服避孕药史绝经状态绝经方式雌激素替代治疗史吸烟饮酒饮茶食用蔬菜食用水果食用腌制食品食用动物油赋值“13岁”=0；“13岁”=1“无”=0；“有”=1“无”=0；“有”=1“无”=0；“有”=1“无”=0；“有”=1“绝经前”=0；“绝经后”=1“自然”=0；“非自然”=1“无”=0；“有”=1“无”=0；“1-2次/周”=1；“3-4次/周”=2；“5次/周”=3“无”=0；“1-2次/周”=1；“3-4次/周”=2；“5次/周”=3“无”=0；“1-2次/周”=1；“3-4次/周”=2；“5次/周”=3“无”=0；“1-2次/周”=1；“3-4次/周”=2；“5次/周”=3“无”=0；“1-2次/周”=1；“3-4次/周”=2；“5次/周”=3“无”=0；“1-2次/周”=1；“3-4次/周”=2；“5次/周”=3“无”=0；“1-2次/周”=1；“3-4次/周”=2；“5次/周”=3关键技术1病例选择应严格执行入选和排除标准并达到足够多的样本量，各组之间应遵循均衡、对照设计原则。 合理应用各种统计学方法对不同参数进行组合分析，充分利用实验数据得出客观结论。 2合理设计引物酶，熟练应用诸如PCR等分子生物学实验技术，由专人负责检测。 四、预期目标（主要技术经济指标、应用或产业化前景）预期研究结果 (1)探讨基因单个位点即LEP rs 7799039、LEPR rs 1137101、ADIPOQ rs 2241766、ADIPOQ rs 1501299、FTO rs1477196和MC4R rs17782313多态性与女性乳腺癌的关系，为乳腺癌的早期预测、预防、诊断和治疗奠定基础。 (2)探讨基因-基因交互作用即LEP rs 7799039、LEPR rs 1137101、ADIPOQ rs 2241766、ADIPOQ rs 1501299、FTO rs1477196和MC4R rs17782313多态性之间交互作用对女性乳腺癌的影响，从而更深入了解乳腺癌的遗传机制。 (3)探讨基因-环境交互作用即LEP rs 7799039、LEPR rs 1137101、ADIPOQ rs 2241766、ADIPOQ rs 1501299、FTO rs1477196和MC4R rs17782313多态性与肿瘤家族史、月经史、怀孕史、哺乳史、流产史、口服避孕药史、绝经状态、绝经方式、雌激素替代治疗史、吸烟、饮酒、食用蔬菜、水果、腌制食品、动物油以及肥胖等因素之间交互作用，从而阐明女性乳腺癌基因多态性对环境因素的易感性差异。 对于携带乳腺癌易感基因的个体，通过鼓励他们减少环境危险因素的暴露，养成健康的生活方式，从而降低乳腺癌患病风险。 五、项目实施方案、技术路线、组织方式与课题分解研究方法 (1)病例对照研究方法，本课题拟采用病例-对照研究设计方法，选取进行外科手术治疗的女性乳腺癌患者500例（所有患者经组织病理学确诊，术前未经放射和抗癌药物治疗）。 同时从体检中心选择500例健康女性作为对照组（地区、年龄与病例组进行匹配）。 通过比较病例组和对照组LEP rs 7799039、LEPR rs 1137101、ADIPOQ rs 2241766、ADIPOQ rs 1501299、FTO rs1477196和MC4R rs17782313位点多态性频率的差异，以及各种环境因素的差异，探讨遗传及环境因素对女性乳腺癌患病的影响。 (2)遗传流行病学关联研究方法，即选择6个易感基因位点，探讨单个位点及多个位点交互作用与女性乳腺癌的关系。 在不同人种中验证是保证基因与疾病真实和普遍关联的必要条件。 通过本研究可以深入了解女性乳腺癌的遗传易感性，为乳腺癌的早期预测、预防、诊断和治疗奠定基础。 (3)实验室检测方法，采集空腹12小时静脉血5ml，从外周白细胞提取DNA。 使用ABI实时荧光定量PCR仪对6个易感基因位点进行基因型检测。 (4)问卷调查方法，即采用问卷工具，收集各种生殖及环境因素。 包括研究对象的肿瘤家族史、月经史、怀孕史、哺乳史、流产史、口服避孕药史、绝经状态、绝经方式、雌激素替代治疗史、吸烟、饮酒、饮茶、蔬菜、水果、腌制食品和动物油等。 (5)统计学分析，采用Epidata3.1进行数据录入和逻辑纠错，采用SPSS13.0或SAS9.1进行统计学分析。 首先采用Fisher精确检验分析位点基因型在各组的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，并借此考察样本的代表性及分型实验的质量控制。 采用2检验比较病例组和对照组中6个易感基因位点基因型频率及环境因素频率。 关于基因基因以及基因环境因素（包括生殖因素及生活环境因素等）的交互作用对乳腺癌的影响，采用Logistic回归模型进行分析，纳入主效应项和交互项，同时控制相应的混杂变量。 实验手段抽取5ml空腹静脉血以EDTA抗凝，分离外周白细胞提取DNA，使用ABI实时荧光定量PCR仪进行基因型检测。 DNA提取 (1)白细胞溶解后，加入4.5ml SE，混匀打散，再加入0.5mL10%SDS，50ul10mg/mL蛋白酶K，轻微混匀，37恒温箱消化18-20小时。 (2)取出消化好的白细胞，加入5mL Tris-Cl饱和酚，轻摇颠倒混匀10分钟，43000rpm离心15分钟。 (3)取出离心管，小心吸取上清，转移到新离心管。 下层的沉淀弃去。 (4)重复步骤2)和3)。 (5)在含有上清液的新离心管中加入与上清液等体积氯仿，轻摇颠倒混匀10分钟，43000rpm离心15分钟。 (6)取出离心管，小心吸取上清，转移到新离心管。 (7)重复步骤 (5)和 (6)。 (8)在新离心管内加入2倍体积的预冷无水乙醇。 (9)将沉淀出的DNA挑出，用75%乙醇冲洗2次，置入1.5mL EP管中，待乙醇蒸发后，加入TE，4过夜溶解。 基因型检测使用ABI实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）对LEP rs 7799039、LEPR rs 1137101、ADIPOQ rs 2241766、ADIPOQ rs 1501299、FTO rs1477196和MC4R rs17782313进行基因型检测。 (1)样本要求用于SNP检测的样本浓度不低于10ng/?l。 (2)试剂2TaqMan UniversalPCR MasterMix（购于ABI公司）。 (3)引物序列ABI公司设计探针和配套引物（使用软件为ABI PrimerExpress2.0）。 技术路线 六、计划进度安排1.xx.06xx.12研究内容通过病例-对照研究选取确诊的女性乳腺癌患者500例和500例健康女性（按地区、年龄与病例组进行匹配）。 包括采集5ml静脉血并于-80冻存。 体格检查身高、体重等；问卷调查包括年龄、生殖相关因素及环境因素等。 研究目标完成病例和对照的选择、血样采集和问卷调查。 2.xx.01xx.12研究内容 1、采用盐析法从外周白细胞提取DNA。 2、对乳腺癌病例和健康对照进行6个基因SNP的基因型检测，建立包括体格检查、问卷信息和SNP基因型等的完整数据库。 研究目标完成6个SNP基因型检测，建立完整数据库。 3.xx.01xx.12研究内容完成研究工作的总结、数据分析、论著的撰写发表。 研究目标发表相关论著3篇，按时结题。 七、现有工作基础和条件 (1)本课题组长期从事肿瘤早期诊断及肿瘤的基因多态性研究，对于肿瘤遗传易感性的研究积累了一定经验，已经发表相关论文多篇，因此，本课题组能够胜任本课题的研究。 (2)本院普外科和检验科建有完备的乳腺癌血样标本库（已有血清标本400例），并储存乳腺癌患者的联络方式。 因此可以对其进行预约，收集生殖及环境相关因素。 前期我们从标本库中选择了50例乳腺癌病例，并且从体检中心选择50例健康对照，对于6个基因位点进行了初步研究