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文档简介
CTAB法提取白桦RNA方法 实验原理:LiCl最终浓度为2 mol/L 0.8 mol/L直接沉淀大分子RNA(包括rRNA和mRNA)需要注意的是Li离子对反转录酶有抑制作用,而Cl离子能抑制蛋白质合成的起始步骤,所以在mRNA反转录和体外翻译实验前不要使用LiCl沉淀DNA和RNANaAc最终浓度为0.3mol/L(Ph5.0)所用所有试剂:Tris- CTAB:与RNA结合-巯基乙醇:防止被氧化Tris饱和酚、氯仿:去蛋白质5L LiCl、无水乙醇、70%乙醇、3 mol/L NaAc:使RNA沉淀1TAE、 BW:配制凝胶Gol-rad或gold-view和6loading buffer :前沿指示剂ddH2O 所有材料 用具试剂瓶 、250烧杯 玻璃棒 250容量瓶 记号笔 天平 一次性手套 钥匙、液氮 研钵、冰、线手套、枪、枪头、高压锅、电泳照相系统离心机 、混摇机、恒温水浴、电泳仪、电泳槽实验准备:1、CTAB 5g 直接加入试剂瓶(防止起泡)2、NaCl 20.44g + 0.5M EDTA 12.5ml 用ddH2O 定容至225ml3、空瓶贴标签加适量(100或50ml)的ddH2O LiCl NaAc 70%乙醇 氯仿 ddH2O 4、6个瓶 + 0.1%DEPC 在通风橱里戴双层手套,充分摇匀,气泡不很快消失5、37度保温过夜注意事项:1、 试剂瓶用洗洁精水浸泡一个小时,然后清水冲到不起泡,壁上不挂水珠,再用ddH2O冲两次,量筒等量器清洗后都用ddH2O冲洗两次2、 Tris 不可用0.1%DEPC处理,等其他组分处理完再加到CTAB中3、 所有瓶子用0.1%DEPC处理,除了-巯基乙醇,Tris饱和酚(购买时小瓶装,直接用即可)所有水溶试剂用ddH2O配置4、 加样器100-1000规格的,小于100则不准确灭菌1、将25ml Tris-HCl加入CTAB中,2、瓶留一个缝,灭菌锅的桶中加适量水3、枪头一层袋,离心管两层袋4、共八个瓶5、时间大概为一个半到两个小时实验前准备小研钵,杵,小钥匙中倒适量酒精,点燃,自灭后凉透(大概得30min)。准备:液氮、材料(负40度)、垫纸(研钵下用)、手套(里外一层一次性手套,中间线手套)、冰(252)、恒温机(65度)、桌上多放一只一次性手套(放钥匙和杵)、将叶片放在手可触的地方开始实验1、 3-5倍体积(650ul Tris-CTAB提取缓冲液,50ul-巯基乙醇)的65度预热的提取缓冲液,混匀2、 根据实验需要,取每管0.1-0.5g叶片置液氮中冷冻,研磨成粉末。首先将研钵、杵和钥匙充分冷冻(浇3-4次),加入叶片,加液氮,不超过五次。液氮多的时候轻磨,快没时用劲快磨,至白色为止。3、 粉末加入准备好的离心管中,大概2匙柄,充分混匀,放在65度恒温浴中15min,每隔2-3min摇一次,研钵和杵放水下冲,氯仿瓶放在冰中。4、 加入一倍体积(700ul)的氯仿,用混摇机摇匀,12000rpm,离心10min,取上清。5、 在冰中准备好离心管和氯仿,重复两次。6、 准备好500+60ul 5mol/L LiCl,200+150 ul冷无水乙醇,60ul 3 mol/L NaAc, 加入430ul上清液,静置15-30min,沉淀RNA7、 12000 rpm离心10min,注意放的方向,抽去上清,RNA沉淀为无色胶体状8、 用70%乙醇漂洗两次,切忌快速抽打,开口在通风橱里风干(大概15min),再加入20ul的ddH2O,反复抽打混匀,置于冰中备用。电泳检测 多准备一只一次性手套,带小枪1、 配胶,1TAE20 ml(稍多一点)、BW 0.8-1.0% g/ml(0.2g)于小锥形瓶中,轻摇(防止气泡)加热完全融化,待降到60度(手摸不烫)时加6-10ul gold-view即可,倒在插好梳子的胶盒中,待凝(大概15min)2、 电泳 恒压 60V左右(66) 或横流 45mA左右 30min 负极跑向正极 将电泳盒放入电泳槽中,加1TAE没过胶面,将样品(1-4ul)和6Loading buffer(2 ul)在一次性手套上混匀加入到胶孔中,盖好盖电泳。3、 将胶盒拿出到252,把胶放到检测室中检测照相。样品保存 -40摄氏度或与无水乙醇以3:1充分混合后-40摄氏度保存注:1、或者前沿指示剂只用gol-rad最后只与样品混匀即可2、70%乙醇配置无水酒精按纯酒精即可。3、整个实验过程禁止说话,即在没有条件的情况下,尽量创造一个无RNA酶的环境4、实验提取过程尽量缩短时间,尽可能放在冰上5、RNA沉淀为无色胶体状,白色明显沉淀是蛋白质等杂质6、清洗RNA沉淀时确保沉淀不被冲走,确定其溶解在水中7、电泳点样一定要迅速,准确,均匀6、实验中遇到的问题:1、只有一条带跑出来,且很清晰? 2、有拖尾或者是向前延伸? 降解,应对方法是:实验中样品尽量放在冰上进行3、降解与震荡有无关系? 没有太大关系4、电泳结果只在相对点样孔的一侧或是两侧有RNA显示? 点样不均匀5、电泳结果显示点样孔处有明斑? 样品中存在杂质,应对方法:实验步骤加氯仿去杂时应注意两点1、混合充分2、离心后取上清应缓慢,尽量避免蛋白层上的胶状杂质6、电泳结果在28S和18S之后还有一条不太明显的条带? 是DNA或者是5SRNA,应对方法:7、电泳结果显示,两条带都有但是不明显? 点样量少,一般为4ul,或者是样品浓度低,注意取叶大小和各步骤中的损失 8、电泳结果,没有条带? 实验过程中RNA已经降解,应注意保持实验的低温和无RNA酶环境;或者是叶片储存条件不够9、电泳中有融胶现象? 调节电压或者电流,不可太大 10、样品第一次
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