兽医生物制品学实验教学讲义.doc

7兽医生物制品学实验教学讲义实习一、弗氏佐剂的制备目的及要求掌握弗氏佐剂的制备方法及检验方法。内容与方法弗氏佐剂是目前最常用的油乳佐剂，根据佐剂中加入或不加入死结核杆菌可分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。在灭活疫菌苗的制备过程中常用油乳佐剂，即“弗氏不完全佐剂”。下面我们主要介绍弗氏不完全佐剂的制备方法。一、材料和设备：1、 材料：7#白油、硬脂酸铝、司班80、吐温80、蒸馏水等。2、 设备：乳化泵、分析天平、离心机（4000r/min）、恒温培养箱、粘度计、高压灭菌锅、量杯、量筒、烧杯、试管、吸管（出液口径2mm）等。二、方法：使用不同乳化剂和不同的配合比例及乳化方法，决定了制备乳剂的性状和稳定性。疫苗生产中主要有两种基本方法。1、剂在水中法 此法将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生成O/W乳剂。若欲得W/O型，可继续加入油，直到发生变型。该法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅拌而得到较好的乳剂。2、剂在油中法 此法将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，继续加入至变型。该法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在0.5um左右，比较稳定。3、油乳剂配方 免疫实验动物用的佐剂配方：7#白油 85ml，司班80 15ml混合后经除菌过滤而成为弗氏不完全佐剂（FIA）；如向其中加入0.5mg/ml死结核杆菌即为弗氏完全佐剂（FCA）。使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂等量混合，用力振摇即可成为均匀的乳剂。疫苗生产用乳剂配方：7#白油 90ml，司班80 10ml，混合后加2ml的吐温80和1.5g的硬脂酸铝，经高压灭菌后备用，使用前将配好的油佐剂与抗原水相11混合，强力振摇，或通过胶体磨搅拌即可制成性状良好的乳剂疫苗。大量生产乳剂疫苗时，可将94%白油与6%司班80混合后加入2%的硬脂酸铝，经灭菌后为油相；抗原液加入2%的吐温80为水相。乳化时，按容量计算，油相与水相11配制，先缓速混合，再通过乳化泵或胶体磨充分乳化，可获得稳定的油包水乳剂苗。但这种配方制的乳剂苗一般较粘稠，而且必须充分掌握混入抗原时的速度，在慢速搅拌油相的同时，缓慢倾入水相混合，然后再高速通过胶体磨或乳化泵充分乳化，否则易于分层。如欲降低乳剂的粘稠度，可以增加油相的比例，例如以水与油之比达12或13，最高可达14时，亦可获得良好的W/O乳剂疫苗。或者将粘稠的W/O乳剂疫苗，再加2%吐温80生理盐水，通过搅拌或乳化泵乳化，可制成双向乳剂疫苗（水油水乳剂）也可直接制备双向乳剂苗（或称多型乳剂Multiple emulsion abjuvant）。双向乳剂苗的优点是：粘稠度低、在注射部位易分散、局部反应轻微及佐剂效应良好等。三、油乳剂的检验：油乳剂检验项目包括乳剂类型检查、黏度测定、稳定性测定、粒度大小及分布的检测等，生产实际中以黏度测定和稳定性测定为主。1、乳剂类型的测定：测定方法有多种。Robertson的染料法。用“Sudan油溶性染料”和“亮蓝FCF”水溶性染料，分别加入两份乳剂中，轻轻摇动，若是整个乳剂染油溶性染料即外相为油（W/O），若整个乳剂染水溶性染料即外相为水（O/W）。冲淡或滴于冷水表面。此法是根据乳状液是为其外相所冲淡，将两滴乳状液放在一玻片上，于一滴中加入水，另一滴加入油，轻轻搅拌，按照易与乳状液搀合的物质（油或水）来确定外相的性质。电导法。因为多数的油皆是不良导体，而水则是良导体，用万用表（10K1/2W）把两级分开插入乳剂中，能导电者外相为水，为水包油乳剂；不能导电者外相为油，为油包水乳剂。2、黏度测定：不同黏度的佐剂有不同的测定装置，低黏度佐剂可用毛细管粘度计测定。黏度大的乳剂测定方法有堕球法和转筒法等。适于测乳剂苗用的是流出法，用Saybolt粘度计。此型粘度计基本结构是一个有套层的管子，上面有溢流的坑道，底下有流出的小孔，小孔长1.225cm，孔径0.1765cm，管中容纳60ml液体，在地心重力场中流入一个特别的小瓶所需时间，以秒计数表示之。为了简便，可用1ml吸管，出口内径1.2mm，在室温下吸满1ml乳剂，垂直放出0.4ml所需时间作为黏度单位，适宜于注射用乳剂的黏度以26s左右为宜，如超过1015s，注射时就比较困难。3、乳剂稳定性的测定：加速老化法。高温37贮存1030天不破乳，离心加速分层法。可通过离心乳剂的方式测定。将乳剂放入试管中，以3000r/min离心15min，不分层的乳剂苗，保存1年以上无破乳现象。4、粒度大小及分布的测定：用显微镜直接观察，或用光散射法和透射法或以测微尺测定之。以直径10um均匀颗粒的乳剂为较好。四、对油乳剂苗安全性的评价：1975年在WHO免疫学会上，一个科学工作小组对使用油乳剂苗进行了讨论，认为用矿物油佐剂会引起全身性病状，诱发各种自身免疫紊乱及促进变态反应。但缺乏充足资料加以证实，尤其缺乏佐剂成分的代谢过程和在动物体内长期毒性及病理学的研究。现有结果还不能说明他们的推论。实际在人们接种油苗后的长期观察过程中，尚未发现不良副作用，只有偶然发生局部无菌脓肿的例子。因而，学者们认为，动物抗体对外来物质总是要发生反应的，注入佐剂也不例外，只是应对反应时间的长短、有害或有利、反应的严重程度等加以分析。实际上减轻局部反应，还可通过选择更好的材料和最佳乳剂配方来实现。 如前所述，一些学者用精制花生油与化学纯试剂，研制成功“佐剂65”。经实验证明，这种佐剂具有矿物油所没有的优点，注射“佐剂65”两个月后，几乎能完全被代谢，从而可以减少过度刺激，排除了因长期贮留可能产生的有害作用，产生的抗体水平与矿物油佐剂相似。佐剂65注射于豚鼠、小鼠及猴，没有发现短期（急性）和长期（慢性）毒性，在家兔体内也没有发现有致畸作用。虽然曾有人报告皮下注射佐剂65及矿物油佐剂于小鼠，尤其对雄鼠，长期观察有增生赘生物（瘤），但大量病理学研究表明，这些物质都非致瘤原，而是由于一种已被充分认识的理化改变作用，常见于某些啮齿类动物，与人无关，因为注射蒸馏水，甚至反复穿刺小鼠皮肤，也会发生这种致赘生物作用。报告还说人体注射矿物油佐剂后18年，注射花生油佐剂10年，随访调查表明，对赘生物的发生并无增加，也没有其他临床上重大的不良反应。此外，近年来在研究乳剂中还应注意一个问题，即制乳剂苗无论是用矿物油或用花生油，均不能含有脂酶和酯酶，因为，这些酶能使二缩甘露醇及花生油降解，从而释放出脂肪酸。脂肪酸是有毒性的，会引起注射部位的严重反应，导致形成硬结或脓肿。应特别注意在用花生油时，必须精制以除去花生蛋白，决不允许含有黄曲霉毒素。矿物油佐剂的缺点是：矿物油在组织中因不能代谢而长期存在，造成局部组织损伤；有污染致癌性多芳香烃化合物的危险，限制了弗氏佐剂只应用于实验动物及一些兽用疫苗。对乳化佐剂，即水油水（W/O/W）乳剂，是将水油剂疫苗再乳化到一种生物学安全的去污剂中（Tween 80）。双乳化佐剂与一次乳化佐剂具有同等抗原性而易于吸收，更为稳定，粘性较小，只是在注射部位引起小硬结。应用甘油、卵磷脂佐剂，由于这种佐剂成分是机体的正常代谢物质，且比佐剂65更易于乳化，安全有效。因此，使用花生油、甘油、卵磷脂佐剂对组织无反应性。一种好的乳剂苗，应该是W/O或O/W型，黏度较低，颗粒大小均匀，稳定性良好，呈乳白色。作业：试述油乳剂的检验方法。 实习二、仔猪大肠杆菌灭活疫苗的制备目的及要求掌握大肠杆菌灭活疫苗的制备方法；学会对灭活疫苗的检验方法。内容与方法一、菌种的选择致病性强大的菌种，常常是在疾病流行时自患病动物体内分离的，一般具有良好的抗原性。当从患病动物分离到病原后，首先须进行纯粹性检验，证明分离物确实不杂有其他微生物，而后进行致病性测定。如果这种病原能感染实验动物，则应首先在实验动物体上检测其致病力及抗原性，是为初选。初选入选者在用原宿主动物测试。在测定病原的致病力时，常常以能致死一半实验动物所需的细菌数来表示，即所谓半数致死量（LD50）。进行测定时，应当同时设有只接种无菌培养基或生理盐水的阴性对照动物，同时还应设有接种已知致病力的同种微生物的阳性对照动物。设立阴性对照的目的是为了要阐明所用实验动物是否正常健康，饲养管理是否得当。设立阳性对照的目的是要阐明被接种动物对接种物的敏感性，以免因实验条件不完善而得到错误的结论。如果阴性对照发病或死亡，实验不能成立。如果阳性对照不病不死，说明所用的实验动物不适宜，或存在其他意外干扰因素。在测定时，将培养物连续递进十倍稀释，将不同稀释度的培养物定量接种一定数量的动物，按被接种动物在规定日期内发病或死亡数计算LD50，以判断接种物的致病力，数字愈小说明致病力愈强。LD50的计算方法，细菌或病毒培养物进行不同稀释后，各接种小鼠5只，每只接种量0.1ml，在规定日期内死亡、生存及其积累数见下表。细菌（病毒）稀释结 果积 累 数死亡率（%）生存死亡生存死亡总数10-7050111110010-8141678610-9324263310-10509090上表积累数中低稀释度的死亡数是将几个高稀释度组的实际死亡数迭加而成。表中10-7组的积累死亡数=0+2+4+5=11。而高稀释度的积累生存数是几个低稀释度组的生存数迭加而成。表中10-10组的积累生存数=0+1+3+5=9。接种10-8稀释液死亡率为86%，接种10-9稀释液时死亡率为33%，可以想到50%的死亡终点应在10-810-9之间，只要将此终点与10-8间的距离比算出即可得到。所以先计算出此距离比而后计算出LD50的对数，即可求出LD50值，下面是常用的Reed-Muench计算方法。 高于50%死亡率的死亡率-50%距离比= 高于50%死亡率的死亡率-低于50%死亡率的死亡率 86%-50% = =0.68 86%-33%LD50值的对数之负数=死亡率高于50%的稀释度的对数之负数+距离比（稀释系数之间的距离）=8+0.681即LD50=-8.68即每0.1ml中含有108.7个LD50，或每1ml中含有109.7个LD50，也就是LD50=10-9.7ml。通常以对数表示时，仅用小数点后一位数，如本例中LD50=10-9.7，不用LD50=10-9.68。计算LD50终点时也可以应用Karber氏方法，同样得到准确的结果。 连续稀释系数 各稀释度组死亡率之和LD50值的对数=1/2之间的距离+最低稀释系数之对数- 100+86+33 100 =1/21+（-7）- =-6.5-2.19=-8.69 100即每0.1ml中含有108.7个LD50，或每1ml中含有109.7个LD50，也就是LD50=-10-9.7ml。在测定时如果不是用10倍系列稀释，则稀释系数之间的距离也必须随之改变，乘以倍数的10的系数。在2倍系列稀释时这个字为0.301，在5倍系列稀释时为0.699。由上可以想到微生物的致病力愈强大，其半数致死量就愈小。经致病力检测入选的微生物株，如果是用于制造灭活苗或抗血清，则应按设计制成疫苗，接种免疫实验室动物，经过一个时期后，一般23周，以有致病力的同种微生物攻击接种，同时接种未经过疫苗免疫的对照动物。在兽医生物制品中，攻击接种所用的剂量的大小因病原种属不同而异，至少都是致死量的，使得未免疫的对照动物全部死亡。根据疫苗组动物得到保护的数目多少，判定入选微生物株保护性能的优劣。一般应重复几次始可作出结论。待在实验室动物体上得到满意结果后，用原宿主动物进行疫苗保护测定，根据结果作出取舍。微生物一旦入选，即应冻干保存。冻干保存的细菌保存于4中，冻干的病毒保存在-20以下的温度中。冻干微生物可以保存多年性状不变。入选的微生物株不应再通过动物传代，如果经过动物传代，对分离物必须如同对待新分离的菌株或病毒株一样，重新进行一整套检测鉴定，证明合格后始可保存备用。二、大肠杆菌灭活苗制备的工艺流程鉴定 37细菌分离 菌种 活化种子 Minca氏培养基 培养 菌液 菌苗原液 灭活菌液 乳化、配苗 分装 检验 灭活苗 灭活 佐剂三、制造要点a) 种子繁殖：将入选的菌种接种于改良Minca肉汤培养后，用改良Minca琼脂平板划线分离，选取典型菌落若干个，分别用相应的K99、K88和987P因子血清逐个做平板凝集反应，选取阳性菌落，接种改良Minca肉汤三角瓶培养，平板凝集反应，纯粹检验合格，作为一级种子。取一级种子按上述同样方法繁殖，革兰氏染色镜检无杂菌后，即可作为二级种子。b) 菌液制备：三种纤毛抗原菌株分别进行连续通气培养，搅拌速度为600r/min，通气量大于11，第一代通气培养7h，取样检验合格，即收获，并按加入培养基的3%5%留有种子，然后加入培养基，通气培养67h，如此循环，连续通气培养，但最多不超过10代。培养温度为3637，消泡剂为0.1%花生油。c) 配苗与分装：将油乳佐剂与抗原水相11混合，先缓速搅拌，在通过乳化泵或胶体磨充分乳化，或制成双向油乳苗。每1ml成品苗中应含有K99100个抗原单位、K8850个抗原单位、987P50个抗原单位、菌数200亿。经无菌检验合格后，进行组批、分装。四、质量检验d) 无菌检验或纯粹性检验：抽样：500L以下者每批抽样5瓶，5001000L者抽样10瓶，1000L 以上者抽样15瓶。检验方法：用硫乙醇酸盐培养基（T.G）50ml，接种供试品1ml，置37培养，3d后从小平中吸取培养物，分别接种T.G小管和酪胨琼脂培养基（G.A）斜面各2支，每支0.2ml。1支置37，1支置25；另取0.2ml接种1支葡萄糖蛋白胨水培养基（G.P）小管，25培养5d，应无菌生长。e) 安全性检验：一是用体重1822g小鼠5只，各皮下注射疫苗0.5ml，观察10d，应全部健活。二是用体重40kg以上健康易感猪4头，各肌肉注射疫苗10ml，观察7d，应无明显不良反应。f) 效力检验：用反向间接血凝（RIHA）试验测定疫苗中的三种纤毛抗原的RIHA效价，K88及K99均40倍、987P160倍时合格。抗原单位测定法 本方法用于测定K88、K99、987P抗原物质的含量，原理是根据抗原能吸收标准血清中对应抗体的能力来计算，将抗体的剩余量与指示抗原作凝集反应，进行滴定，得出抗原能吸收标准血清的最低浓度，即为一个抗原单位。 现以K88抗原单位的测定为例简要说明具体方法。1、 指示抗原：将具有K88抗原结构菌株的普通琼脂斜面培养物用生理盐水洗下，稀释到麦氏比浊管第三管，备用。2、 标准血清及其测定：K88因子血清必须具有严格的特异性，与K88阳性菌株活菌悬液作玻板凝集反应，必须呈“#”凝集；与K88阳性菌株煮沸菌悬液作玻板凝集反应，必须呈“-”不凝集。K88因子血清的单位测定方法管号123456789血清稀释20408016032064012802560盐水生理盐水0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃0.5 -K88血清指示抗原0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5感作 38水浴2小时，4过夜，观察结果结果#+-以出现“+”凝集的判为一个血清单位，在测定培养物中K88抗原单位时，使用4个单位的阳性血清。以上表为例，一个血清单位是320，即将K88因子血清稀释为80使用。3、 测定培养物中K88抗原含量：将被检培养物进行稀释，稀释时