IFU-12TAB检测方法.doc

果汁中环脂芽孢腐败菌的检测A. 前言自从20世纪80年代发现嗜酸耐热芽胞菌会使果汁酸败以来，环脂芽孢杆菌种便成为果汁工业界可使食品败坏的主要生物体。腐败一般表现为风味的丧失和臭味的产生（愈疮木酚和苯酚盐等化合物生成）。此类事件对经济影响较大，但迄今为止，还未发现食用含有环脂芽孢杆菌的果汁或其它食品对人类健康造成危险。果汁产品中的环脂芽孢杆菌较难控制因为其芽孢在巴氏杀菌温度下仍可存活，并在加工后适宜条件下可继续生长繁殖。环脂芽孢腐败菌群生长于pH 2.56，20以上，其芽孢在浓缩果汁和类似环境下可存活很长时间，而生长繁殖却需要更好的稀释环境。A.环脂芽孢杆菌是果汁和类似产品腐败的最常见菌种，而其它菌种也可产生腐败，特别是低果汁含量或富含矿物质的产品。工业界面临的关注和争论是原料中环脂芽孢杆菌种的重要性, 产品中不同菌种行为，合适控制方法的必要性，可检测出不同种环脂芽孢杆菌甚至其它耐热耐酸菌的各种方法。 IFU方法目录揭示了工业界和各研究机构之间检测方法的巨大差异。因此IFU微生物工作组开始研究一种国际认可的环脂芽孢腐败菌检测方法以便制定微生物标准和规范。这种方法就是用来检测果汁中环脂芽孢腐败菌的IFU方法12。本方法是IFU方法12第一版。B原则1. 环脂芽孢杆菌的数量较少因此就需要过滤和富集等灵敏技术来检测其在原料和终产品中的含量2. 环脂芽孢杆菌可在产品和原料中形成存活良好的芽孢3. 一般来说热振是降低环脂芽孢杆菌芽孢存活和繁殖的必要过程，未经热振处理的检测会使值偏小。4. 环脂芽孢杆菌需要在酸化环境（肉汤和琼脂）下生长。目前已知的各类环脂芽孢杆菌都可在YSG和BAT培养基上生长。K板（45培养时），主要生长A.耐热耐酸菌，也有其它菌类的限量生长如A.嗜酸菌。因此K板可用来检测A.耐热耐酸菌种。这些培养基的制备说明见附录1。5. 假定意义上环脂芽胞杆菌的确认需要证明其在pH3.8时可产生芽孢，并且在pH值为中性时不能生长。6. 现知的产生愈创木酚味的环脂芽孢杆菌在过氧化酶检测中呈阳性并在低于65生长。在65或65以上生长的环脂芽孢杆菌菌种不会引起果汁酸败。7. 由于芽孢可在酒精中存活，所以检测环脂芽孢杆菌时不推荐使用酒精浸渍或灼烧取样工具、接种环、平皿和容器。在此类分析检测中只能使用高温灭菌或类似高压灭菌的用具。8. 有三种检测方法可供选用：方法的选择根据样品组成和加工后时间 用方法C1来检测原料（浓缩汁、糖浆、茶等），在这些材料中环脂芽孢杆菌以芽孢的形式存在。在直接平镀（可选择），过滤或富集后热振 用方法C2测定终产品（果汁、饮料、酱油、和其他可直接饮用品）直接在（热）加工后取样，不需再进行热振，只需预培养。 用方法C3测定市场终产品。样品的预培养可选择进行，热振也是一样。若怀疑有腐败物，并且直接平镀后未发现环脂芽孢杆菌，建议进行热振和富集。对于加工水和类似样品，按照C1.3和C1.5热振后过滤样品（未稀释）。如果样品不可过滤，按照C1.3和C1.6热振后在YSG和BAT肉汤富集培养。C.方法1. 浓缩果汁和其他原料的检测程序1.1 取样无菌取样，使用合适的灭菌工具和容器 样品必须具有代表性，最少10克1.2 样品预处理 把样品用灭菌蒸馏水、YSG肉汤或BAT肉汤以1：10的比例稀释，并完全搅匀注：检测浓缩汁时一般选用灭菌蒸馏水，它可以提供和终产品相似的环境。检测糖水等时需要外加氮源和碳源来支持微生物生长，YSG和BAT肉汤不但可以提供这些营养成分，还会提供大多数果汁中含有的矿物质。1.3 热振将稀释后的样品在801 的水浴中热振10分钟，并确保水面高于样品。样品温度上升至79-80所用时间不能超过5分钟。热振后，取出样品，并冷却至40-45。在冷却水中可以加冰。注：热振处理的目的是激活细菌芽孢，抑制植物细胞。也可见IFU方法6“嗜温&耐热芽孢菌计数”1.4 过滤（可选用）如果稀释加热的果汁可以过滤，则用0.45微米孔径的膜过滤。通过这一过程可以数出菌落数，并为1 cfu/100ml的稀释样品或1cuf/10g的原样提供检测限值。准备稀释样品和热处理样品各100ml和两个滤膜。将这两种溶液分别过滤培养，用20ml的溶液（如：无菌蒸馏水）冲洗过滤器。将第一个滤膜放到K板上，将第二个滤膜放到YSG或BAT板B7中的注释讲解了如何使用酒精浸渍和烧灼的镊子以确保滤膜下无气泡存在在A. 耐热耐酸菌和A. 嗜酸菌.的培养基上划线1.5 富集 建议将不能过滤的样品进行富集培养，即使样品已经过平镀检测。在451培养剩下的热处理样品（大概100ml）。1.6 直接平镀（可选用） 使用平板技术，将0.1ml的热振样品直接涂到K板，和YSG或BAT板上培养（附录1）。 在A. 耐热耐酸菌和A. 嗜酸菌.的培养基上划线 注：这个检测的检测限值是100个菌落 (cfu)/g样品1.7 板的培养将所有的琼脂板和肉汤在451培养。每天观察板上的生长情况，最少要培养两天，如果两天后板上几乎无生长就培养五天。 注：培养过程要避免平板干燥，应将其放于塑料袋或密封容器中1.8 富集肉汤的次培养 轻摇混合肉汤 两天后对其进行次培养，用接种环在K板和YSG或BAT板上划环。（经过至少两天的培养后）如果经过次培养的板无带有臭味的耐热菌生长，就在总共培养5天后再次进行次培养。在A. 耐热耐酸菌和A. 嗜酸菌.的培养基上划线1.9 假定环脂芽胞杆菌的确认 观察K板、YSG板和BAT板上菌落的生长情况。在每个菌落类型中选取有代表性数量的菌种作确认试验。注：现知的所有环脂芽胞杆菌都在YSG、BAT培养基上生长。因此，与K板相比较，在YSG、BAT培养基上会看到更多种类的菌落 所选的每个菌种在一个K板、一个中性培养基（比如：平板，胰蛋白板，脑心浸液板）和两个YSG板上接种。将K板，中性板、及一个YSG板在451培养3-5天，将另一个YSG板在651培养2-3天。 观察菌落在这些板上的生长情况，中性板上应该没有生长现象，如果有，就记结果为环脂芽孢杆菌（alicyclobacilli）阴性 通过在相差显微镜下观察未凝固载片判断K板上是否有芽孢生成。如果K板上无生长，应该观察YSG板。YSG板上可能也没有芽胞形成，所以就需要使用其它培养基（比如BAT），最好是PH4.0以排除其它耐酸菌芽孢的形成（凝脂芽孢杆菌） 观察在65培养的YSG板，产生臭味的耐热菌不可能在65生长，如果发现有，记为假定意义上产生臭味的环脂芽胞杆菌阴性。 记在PH3.7产生芽胞，但在PH 6不生长芽胞的菌为假定意义上的环脂芽胞菌，那些在65不生长的为假定意义上产生臭味的环脂芽胞杆菌。 留YSG板（45培养）作过氧化酶试验。 根据确认试验结果，按以下方式记结论。若用了过滤技术，在10克样品中有“x”个假定意义上产生臭味的环脂芽胞菌检出 （未检出）若使用浓缩技术，在10克样品中假定意义上产生臭味的环脂芽胞菌阴性（阳性）若使用平板技术，在0.01克样品中有“x”个假定意义上产生臭味的环脂芽胞检出（未检出）1.10 通过过氧化酶实验检测愈创木酚的产生（可选择）注：过氧化酶检测可以用来证实香草醛酸分离菌生成愈创木酚的能力。菌种如A.acidoterrestris，A.acidiphilus, A.herbarius等会产生正面的结果，但是不会在所有的果汁产品中都产生愈创木酚，例如A.acidocaldarius就会产生负面的结果。由于实验结果会因为接种水平和物种的不同而变化，所以实验包括阳性和阴性控制培养物即：A.acidoterrestris和A.acidocaldarius很重要，将它们要分别和要检测的分离菌在同一条件下培养。从YSG板（经45）上选择菌落作过氧化酶实验 从YSG板（经45）上挑选出5-10个均落（取决于其大小）转移至含100ppm香草醛酸的YSG肉汤中（YSGVA）制成悬浮液，混匀 将阳性和阴性控制培养物分别接种到另外的YSGVA肉汤中，混匀 培养两个YSGVA肉汤培养基（不接种），一个作为空白实验，另一个作为有愈创木酚控制 将所有的肉汤在45下与带搅拌的水浴中培养，经过至少3小时，从水浴中取出肉汤 加入试剂（附录2中有描述） 记录每组过氧化酶检测的结果，如果结果不确定，则应延长培养时间或重复实验，加大接种量2.加工后的终产品检测过程2.1取样取包装完整的终产品作样品2.2 预培养将样品在原包装袋中，451下培养7天2.3 涂层无菌条件下打开包装袋，将含有K，和YSG或BAT板（附录1）的皮氏皿，使用平板技术接种0.1ml的预培养样品， 2.4 培养将皮氏皿在451至少培养2天，如果5天后无生长，再次培养2.5 确认见C1.93 从市场取来的终产品的检测3.1 取样取包装完整的产品3.2 预培养（可选择）将样品在原包装袋中，451下培养7天3.3 平镀无菌条件下打开包装袋，将含有K，和YSG或BAT板（附录1）的皮氏皿，使用平板技术接种0.1ml的（预培养）样品培养， 注：如果怀疑有环脂芽孢杆菌腐败，平板上没有微生物体，则选取约100ml的样品按照C1.3中的方法热振，然后将其在451下培养。在K和YSG或BAT板进行2天的次培养，如果5天后无生长，再次培养。3.4 培养将皮氏皿在451至少培养2天，如果5天后无生长，再次培养3.5 确认见C1.9附录1A1.1培养基:K板组分酵母菌浸膏 2.5g蛋白胨 5.0g葡萄糖 1.0gTween80 1.0g琼脂 15.0g 制作将所有成分混合在一起，加1升蒸馏水。高压灭菌器121下灭菌15分钟。冷却至50，再用25的L-苹果酸将pH至调至3.7注：K板可以从Biotrace 国际BioProducts购买到，产品编号BP-0234-500，/. A 1.2.1 培养基：YSG板组分酵母菌浸膏 2.0g葡萄糖 1.0g可溶性淀粉 2.0g琼脂 15.0g制作: 将所有成分混合在一起，加1升蒸馏水。高压灭菌器121下灭菌15分钟。冷却至50，再用1N HCL将pH至调至3.7注：YSG板可以从德国Darmstadt，Merk KGaA公司购买到：用于微生物的YSG板，产品编号1.07207.0500.A 1.2.2 培养基：YSG肉汤YSG肉汤的制作和YSG板的制作相似（见A 1.2.1），不含琼脂。建议高压灭菌前调节pHA 1.3.1 培养基：BAT板组分A) CaCl2 2H2O 0.25g MgSO4 7H2O 0.50g (NH4)2SO4 0.20g KH2PO4 3.0g 酵母菌浸膏 2.0g 葡萄糖 5.0g 矿物质溶液 1.0ml 蒸馏水 500ml用1N H2SO4或1NNaOH将pH值调至4.0，高压灭菌器121下灭菌15分钟，冷却至50。 矿物质溶液 CaCl2 2H2 0.66g ZnSO4 7H2O 0.18g CuSO4 5H2O 0.16g MnSO4 H2O 0.15g CoCl2 5H2O 0.18g H3BO3 0.10g Na2MoO4 2H2O 0.30g 蒸馏水 1000ml高压灭菌后存放于冰箱中B)琼脂 15-20g 蒸馏水 500ml高压灭菌器121下灭菌15分钟。冷却至50无菌条件下，将A和B等量混合，检查pH（必要时调至4.0），然后倾注成平板注：BAT板可以从德国Darmstadt，Merk KGaA公司购买到：用于微生物的YSG板，产品编号1.07994.0500.A 1.3.2 培养基：BAT肉汤BAT肉汤的制作和BAT板的制作相似（见A 1.3.1），不含琼脂。建议高压灭菌前调节pH附录 2A 2.1 愈创木酚确认试验过氧化酶法原理该实验是用来确认能将香草醛酸生成愈创木酚的环脂芽胞杆菌菌种的,它是用的假定菌群（生长于45培养的YSG板上）作为实验物的.该确认是以YSG香草醛酸培养基和过氧化酶反应后会变色为实验基础的.注: 日本Kyokuto Pharmaceutical Industrial 公司可提供过氧化酶确认实验 （联系方法:inagakikyokutoseiyaku.co.jp）培养1. 将从分离实验中得到的5-10个菌群接种到含有100ppm香草醛酸的YSG肉汤（1ml）2. 接种阳性（A.acidoterrestris）和阴性（A.acidocaldarius）培养控制。保留两个未接种的试管作其它控制（空白或愈创木酚控制）3. 将所有的试管在451的振动水浴中培养3个