茯苓人参中Re.doc

序号（学号）： 0801090122长 春 科 技 学 院毕 业 论 文 茯苓人参中人参皂苷Re的含量测定姓 名 徐颀学 院生物食品学院专 业中药学班 级2009级（1）班指导教师徐 凌 志 （讲师）2013年05月27日1茯苓人参中人参皂苷Re的含量测定摘要 本文采用薄层色谱扫描法（TLCS）测量茯苓人参中人参皂苷Re，测定波长s = 530nm，参比波长R = 650nm；展开剂为(正丁醇：乙酸乙酯：水=4:1:5)放置后的上层液；显色剂为10 %硫酸乙醇溶液。结果： 茯苓人参中人参皂苷Re样品浓度为2.270mg/ml，平均加样回收率为99.22%，RSD为0.49%(n=5) 结论：该方法处理简便，分析准确，快速，重现性强，适合用于人参的人参皂苷的含量测定和质量控制。关键词 茯苓 人参 人参皂苷Re 薄层色谱扫描法 Determination of ginsenoside Re content in Poria cocos flavor of ginsengAbstract In this paper, using thin layer chromatography scanning (TLCS) measurement of the red dates, ginseng ginsenoside Re, determination of the wavelength s = 530nm reference wavelength R = 650nm; solvent for (n-butanol: ethyl acetate: water = 4:1:5) Place the upper liquid; chromogenic reagent for 10 ml / L sulfuric acid in ethanol. Results: The sample concentration of red dates, ginseng, ginsenoside Re 2.270mg/ml, the average recovery was 99.22%, RSD 0.49% (n = 5) Conclusion: The approach is simple, analysis of accurate, rapid, reproducible , suitable for ginseng ginsenosides assay and quality control.Key words Poria cocos flavor of ginseng ginsenoside Re TLC scanning method I目录引言11.实验材料、试剂及仪器设备51.1实验材料51.2实验试剂（本次实验所用化学试剂皆为分析纯）51.3实验仪器设备62.实验方法与结果62.1对照品溶液的制备62.2供试品溶液的制备62.3薄层色谱扫描法62.4实验结果72.5精密度试验82.6稳定性试验82.7加样回收率测定83.讨论9致谢10参考文献11附录一：英文原文12附录二：中文翻译2431吉林农业大学发展学院 茯苓人参中人参皂苷Re的含量测定引言茯苓为多孔菌科真菌茯苓 Poria Cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核1。多依附松树根生长傍松根而生的为茯苓(别名：玉灵、茯灵、万灵桂、茯菟)，始载于本草经，列为商品，它的菌核为球形、长圆形、卵圆形或不规则团块。茯苓主要分布在我国云南、贵州、湖北、安徽、福建、广东、广西等地2。根据不同药用部位在加工过程中将茯苓分为白茯苓、赤茯苓、茯苓皮以及获神4种类型。白茯苓为茯苓菌核白色部分，具有补脾利窍的功效；赤茯苓为干燥菌核近外皮部的淡红色部分，甘淡渗泄尤能清利湿热，为湿热诸证所常用；茯苓皮为茯苓菌核的外皮，味甘淡，功能渗湿长于利水消肿；部分茯苓中间抱有松根，被称为茯神，有宁心安神的作用。古人称茯苓为“四时神药”，因为它功效非常广泛，不分四季，将它与各种药物配伍，不管寒、温、风、湿诸疾，都能发挥其独特功效。茯苓味甘、淡、性平，入药具有利水渗湿、益脾和胃、宁心安神之功用。我国食用茯苓的历史已有两千多年神农本草经将茯苓列为“上品”，称其“久服安魂养神，不饥延年”茯苓性甘、淡、平人心、脾、肾经药理实验表明茯苓具有渗湿利尿、合胃健脾、宁心安神、抑菌、增强机体抗病能力及降低血糖的功效心捌茯苓治病范围相当广泛。适用于水肿尿少，脾虚食少，心神不安，失眠多梦等症可用于心脾两虚、心肾不交之心肾不安诸证，并用于脾阳不足，气陷精泄之遗精主治心悸、失眠、小儿惊悸、遗精摄生秘剂天王补心丹主治阴虚血少，神志不安证以茯苓、远志养心安神，又可交通心肾金匮要略酸枣仁汤主治虚烦不眠，以茯苓宁心神茯苓功效还有利水渗湿，健脾补中中医认为，脾虚与水湿互为因果，所以，无论脾虚还是水湿泛滥，都应首选茯苓且效果极佳茯苓与他药合用更显补脾化湿之功效药品化义日：“茯苓，主治脾胃不和，泄泻脾胀，胸胁逆气，膈间痰气”名医洪竹书先生认为茯苓、苷草每方必用，用于治疗肝炎、心悸、肿瘤、精神分裂症、婴幼儿秋季腹泻、斑秃、抗衰老、尿路感染、脑血管疾病等，并且早有茯苓单味药，与桂枝等中药组成复方药，茯苓在中医及人民生活中有着广泛的使用价值有统计表明：在158个中医处方中，有茯苓的就占80茯苓与黄芩、灵芝、丹参、远志、黄精一起称为“云南六大中药”，同时也是国家卫生部、国家中药管理局颁布的“既是食品又是药品的品种名单”的一种茯苓也是著名的食用菌吴氏中馈录关于唐宋集市食摊上用茯苓、糯米、白术磨粉制成的茯苓糕是食用茯苓的最早记载；很早以前，我国食用茯苓就有“南糕北饼”的传统习惯；北方的茯苓饼也是久负盛名，清朝慈嬉曾喜食之；还有“茯苓包子”、“茯苓粥”等茯苓药材的化学成分主要包括茯苓多糖、三萜等。茯苓多糖含量约占茯苓干燥菌核的93%3，其中茯苓水不溶性多糖是一种带有支链的键接的B-D-葡聚糖，经化学修饰后有明显的抗肿瘤活性，而以茯苓酸为代表的三萜类成分具有利水渗湿的作用4。目前茯苓加工工艺较为粗放，且没有统一标准，造成不同规格的茯苓药材在不同批次之间质量有较大差异，因此采用紫外分光光度法和高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定茯苓、赤茯苓、茯苓皮中水不溶性多糖5和茯苓酸含量6，从而为茯苓药材加工的产业化研究和临床用药提供科学依据。中医学认为茯苓的不同药用部位有着不同的临床应用主治7。这与茯苓的化学成分有关 茯苓味甘、淡、性平、入药具有利水渗湿、益脾和胃、宁心安神之功效。现代医学研究表明 茯苓能增强机体免疫功能，茯苓多糖及其衍生物具有抗诱变、抗肿瘤及保肝脏作用8。研究结果表明:茯苓中水不溶性多糖含量大小依次为白茯苓、获神、赤茯苓、茯苓皮、为茯苓中医临床应用提供科学依据9。而获神有宁心安神的功效、这可能与获神木的成分有关，这有待进一步研究。此外，研究表明，茯苓酸有明显的抗炎、抗氧化、抑菌的作用。这些药理活性偏向于茯苓利水消肿的作用10。研究结果显示，赤茯苓中茯苓酸含量约为白茯苓的4倍，约为茯苓皮的2.5倍，可为中医临床在清利湿热时选用赤茯苓，利水消肿时选用茯苓皮提供科学依据. 由于茯苓不同药用部位的化学成分含量存在差异,并且其质量与中医临床疗效关系密切,因此茯苓药材在产地加工过程中分成不同药用部位，对规范茯苓的产地加工工艺，区别饮片的不同临床应用有重要意义。湖北省为茯苓道地药材产地，药材品质优良，驰名中外，市场份额接近50。近年来，北京同仁堂、湖北惠涛集团按照国家有关规定，在湖北罗田、英山等地投资兴建茯苓种植基地，直接为企业提供大量优质药材，扩大了湖北茯苓的品牌优势，为当地经济发展作出重大贡献。随着现代科技技术的发展，对茯苓的物质基础及药理作用机理研究将进一步深入，茯苓作为一种“药食两用”药用植物，其应用范围也将进一步扩大。为此，加强茯苓的开发与研究将会产生良好的社会效益和经济效益11。茯苓的药理活性作用。（1）抗衰老作用。现代医学研究表明，茯苓能在基因转录水平下调酪氨酸RNA表达，抑制酶蛋白的生物合成而对红细胞及皮肤中SOD活性则影响不显著表明茯苓水提液可能通过提高皮肤中羟脯氨酸的含量来延缓衰老。（2）对免疫功能的影响。茯苓多糖具有增强免疫功能的作用，它有抗胸腺萎缩、抗脾脏增大和抑瘤生长的作用既可增强细胞免疫。又可增强体液免疫。（3）抗肿瘤作用。茯苓多糖与茯苓有明显的抗肿瘤作用一方面是直接细胞毒作用，真菌多糖能非特异地刺激网状内皮细胞和血液系统功能另一方面是通过增强机体免疫功能而抑制肿瘤生长（4）利水消肿作用。茯苓素作为茯苓的主要活性成分，体外可竞争醛固酮受体，体内逆转醛固酮效应，不影响醛固酮的合成这些都说明茯苓素是新的醛固酮受体拮抗剂，有利于尿液排出，恢复肾功能，消除蛋白质。（5）对消化系统的作用。独茯苓有使肿胀的肝细胞明显减退的功能，使肝脏的重量明显增加，加速肝细胞再生，达到保肝降酶的作用。（6）预防结石的作用。茯苓多糖能有效抑制大鼠肾内草酸钙结晶的形成和沉积，具有较好的防石作用（7）抗排斥反应的作用。明茯苓提取物对大鼠异位心脏移植急性排斥反应有明显的抑制作用。(8)抗茵、抗炎、抗病毒的作用。100茯苓浸出液滤纸片对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、炭疽杆菌、大肠杆菌、甲型链球菌、乙型链球菌均有抑制作用。(9)增白作用。白茯苓对酪氨酸酶有著的抑制作用且为竞争性抑制通过抑制酪氨酸酶活性来减少黑色素生成量，可能是增白中药的作用机制之一。（10）减轻卡那霉素中毒性耳损害。)耳蜗铺片显示，单用卡那霉素动物外毛细胞损伤较严重，耳蜗底回外毛细胞缺失率为575。而茯苓组动物耳蜗底回外毛细胞缺失率为396(P005)结果说明，茯苓可减轻卡那霉素中毒性耳损害。（11）抗迟发性超敏反应。以小鼠2，4-二硝基氟苯(DNFB)变应性接触性皮炎(ACD)为迟发性超敏反应(DHR)的实验模型，以茯苓的高、中、低剂量于致敏期及诱发期给药，观察耳肿胀、耳部组织块重量结果显示，茯苓能明显抑制ACD，且呈现一定的量效关系。（12）其他作用。茯苓煎剂腹腔注射，能明显降低小鼠自发活动，并能对抗咖啡因所致的小鼠兴奋过度的作用。综上所述，我国茯苓资源丰富，以中医理论为基础，结合现代医学与药理研究成果，对茯苓有效成分加以开发利用，发掘新药，将对传统中药茯苓的开发有重要意义12 人参为五加科植物人参（PanaO ginseng C.A.Mey ）的干燥根，多年生草本植物，喜阴凉、湿润的气候，多生长于昼夜温差小的海拔5001100米山地缓坡或斜坡地的针阔混交林或杂木林中。由于根部肥大，形若纺锤，常有分叉，全貌颇似人的头、手、足和四肢，故而称为人参。古代人参的雅称为黄精、地精、神草。人参被人们称为“百草之王”，是闻名遐迩的“东北三宝”（人参、貂皮、鹿茸）之一，是驰名中外、老幼皆知的名贵药材。其研究和应用已受到国内外的普遍重视,随着对人参研究的深入和发展,人参化学成分及其药理作用已逐渐被发现,对人参主要活性成分人参皂苷和多糖以及人参对中枢神经系统、循环系统、内分泌系统等药理作用研究进展做了简要概述.为其研究开发提供有价值的参考13.具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神之功效。现代药理学研究表明，人参中的主要有效成分是人参皂苷，其生理活性作用极为广泛。目前从人参中提取的人参皂苷单体有30多种，其药理效应和作用机制不尽相同14-16。人参药理作用:（1）对中枢神经系统(CNS)的作用。人参和西洋参包括其有效成分Rg，Rb。均能增强CNS活动，有时也产生抑制作用，人参中Rg(O27)：Rb。(05)比值较高，西洋参中Rg(0133)：Rb(027)比值较低，故西洋参对CNS作用弱于人参，以增强学习记忆为例.Rg改善记忆全过程，Rb只改善记忆获得与再现而无改善记忆巩固的作用。（2）对心血管系统的作用。人参水提物在清醒的正常大鼠和高血压大鼠有降压作用，在原发性高血压患者也证明有效。Rg和Rg能松弛血管平滑肌，抑制内皮素产生和血小板聚集。Rb，Rg，Re均对心脑缺血损伤有改善作用。Rb因有较强抗氧化活性和清除自由基作用，所以作用更强些。（3）对免疫系统、炎症和过敏的作用。Rg可增加T辅助细胞功能并能提高老年人的免疫力，多糖能增加干扰素的产生、提高吞噬细胞和自然杀伤细胞、B及T细胞活性，Rb，Rg，Rg则能抑制细胞因子产生，抑制COX-2基因表达以及组胺的释放。（4）抗肿瘤作用。人参可提高人体抗x射线辐射的保护作用，长期服用人参能降低肺、胃、肝和结肠癌发生率，Rh和Rg，在动物和人体试验对乳腺瘤、前列腺癌、肝癌和小肠肿瘤有抑制作用，其主要作用机制是提高免疫力、抑制肿瘤血管新生和引起肿瘤细胞凋亡。(5)降糖降血脂作用。人参西洋参均有一定的抗糖尿病作用，从人参分离的Panaxan A和B可增加胰岛素水平和对胰岛素的敏感性。（6）对血管新生的作用。Re，Rg能增加血管新生，Rb，Rb2，Rc3抑制肿瘤血管新生，从而防止肿瘤转移。人参皂苷Re是人参皂苷的一类主要有效成分，质量分数约占总皂苷的3017。人参皂苷Re主要是从人参中提取出来的，但是就其所在植物而言并不是仅仅存在于人参中，比如西洋参、田七的部分组织中叶可能含有，但是含量较人参相差很多18-19。人参地上部分所含人参皂苷Re的数量较高，是提取Re的理想材料。人参皂苷Re具有很好的药理活性，在临床上主要应用于神经、免疫、心脑血管等诸多疾病上，已被证实具有抑制中枢神经，促进DNA、RNA合成，促进血清蛋白质合成，促进蛋白质分解酵素活性化，促进刺激副肾皮质荷尔蒙分泌等作用20。目前有人报道人参皂苷Re可能对一些肿瘤分化或者一些肿瘤的疾病具有抑制作用。有些还可能产生某些有益于人类的“毒素”，因此人参皂苷具有很广泛的应用前景21。根据中国中医药报上海交通大学附属瑞金医院内分泌代谢病临床医学中心的研究人员日前发现人参皂苷Re是人参降低血糖的主要成分，并阐明了人参皂苷Re的降血糖作用机理。人参皂苷Re对小鼠学习记忆障碍的作用。采用东莨菪碱、NaNO：和40乙醇分别造成小鼠记忆的获得、巩固和再现障碍，并观察人参皂苷Re高、中、低剂量对3种不同模型小鼠学习记忆的影响。通过行为学的测试，结果显示人参皂苷Re高、中、低剂量对化学性记忆损伤有明显的改善作用。有实验表明口，人参皂苷可以抑制小鼠脑组织AChE活性，且人参具有改善脑缺血缺氧的作用，为探讨人参皂苷Re是否是通过以上机制发挥对学习和记忆的改善作用，本实验对小鼠脑组织AChE活性及血Fib和HCT进行了检测。研究结果显示人参皂苷Re可降低东莨菪碱所致的记忆获得障碍组小鼠的脑组织AChE活性，对NaNO：造成的异常血液流变状态具有改善作用。因此，凋节中枢胆碱能系统及对血流变相关指标Fib和HCT呈现调节作用，可能是人参皂苷Re促智的作用之一。老年性痴呆是以进行性认知功能障碍为主要临床表现的神经退行性疾病与脑胆碱神经元损伤及其受体功能不足有关，老年性痴呆患者脑组织乙酰胆碱数量减少；而血性痴呆患者的核心问题都在于脑组织缺血，脑细胞存在氧代谢供需矛盾。本实验从胆碱能神经系统和血液流变状态的角度探讨了人参皂苷Re对学习记忆障碍改善的机制，为今后进一步探索人参皂苷Re预防和治疗痴呆奠定基础。有关于人参皂苷的分析方法较多，如分光光度法、比色法、薄层扫描法、气相色谱（GC）法、HPLC 法等22。从以前到现在已有多人采用TLCS法对红参，高丽参以及人参须等人参各种部位进行人参皂苷含量的测定，但在本实验中将采用此方法对红枣人参的人参皂苷Re的含量测定据了解还未有先例。此方法该法具有简便、快速、准确和重现性好等特点，已广泛应用于人参皂苷Re的含量测定23。茯苓人参中人参皂苷Re的测定，对研究人参的新产品，提高人参的药用价值都具有重要的意义。1.实验材料、试剂及仪器设备1.1实验材料人参（3年生）：购自吉林省长春市，已经经过人为鉴定茯苓：长春市普通市售硅胶G（化学纯）：青岛海洋化工厂分厂制造人参皂苷Re标准品：中国药品生物制品检定所层析硅胶（H）-薄板：浙江台州市路桥四甲生化塑料厂生产出品大孔吸附树脂 ：天津南开大学化工厂1.2实验试剂（本次实验所用化学试剂皆为分析纯） 1.正丁醇 北京化工厂 2.乙酸乙酯 天津市巴斯夫化工有限公司3.甲醇 天津光复科技发展有限公司4.无水乙醇 天津新通精细化工有限公司5.氯仿 北京化工厂6.石油醚 天津光复科技发展有限公司7.显色剂：10%的硫酸乙醇液8.展开剂：正丁醇：乙酸乙酯：水（4:1:5）上层液1.3实验仪器设备1.豪华型自动电饭锅（出厂日期2009年9月20日） 廉江市万家宝电器厂制造2.DT系列电子天平 型号：DT1002 江苏省常熟市意欧仪器仪表有限公司3.超声波清洗机 型号（SB2512DT） 宁波市新芝生物科技股份有限公司4.电热鼓风干燥箱 型号：DGX9143051 上海福玛实验设备有限公司5.倾斜式高速万能粉碎机 型号：FW400A 北京中兴伟业仪器有限公司6.循环水式真空泵 型号：SHZ：D()型 河南省予华仪器有限公司7.旋转蒸发器 型号：RE52A 上海亚荣生化仪器厂8.多头磁力加热搅拌器（国华）9.移液器 WKY型50250L 上海荣泰生化工程有限公司10电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂11.数显恒温水浴锅 DFS KW-1000D 上海梅香仪器有限公司.12玻璃仪器气流烘干器 型号：KQC 巩义市予华仪器有限责任公司13.电热板 型号：DB2 国华14.薄层色谱扫描仪 型号：KH3000 上海科哲生化科技有限公司2.实验方法与结果2.1对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Re对照品适量， 加甲醇制成每1ml 含人参皂苷Re 约0.5mg 的溶液（浓度为0.5mg/ml）, 作为对照品溶液。2.2供试品溶液的制备 精确称取红参、生晒参、茯苓人参各10g，分别加入氯仿溶液，直至没过药材，然后将其放入超声仪中，进行超声30Min。将超声完后的药材过滤，弃去氯仿液，将药渣放置在60的水浴锅中，进行水浴加热，将剩余的氯仿挥发。在挥发完的药渣中加入正丁醇50ml，放入超声仪中超声30min，然后过滤，取滤液25ml，放在水浴锅上蒸发。将蒸发完的残渣加水，至刚好溶解，然后注入到树脂柱中，静置吸附。用50ml的蒸馏水洗脱，弃去水液用50ml的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，放置水浴锅上蒸干用甲醇溶解，装入5ml的容量瓶，用甲醇稀释至刻度线。2.3薄层色谱扫描法 采用移液器分别吸取对照品溶液2ul、4ul、6ul、8ul、10ul 以及供试品溶液(辅料参)2ul分别点于同一硅胶G 薄层板上, 同时在进行点样时使用电吹风吹干，以免其边缘化，然后在以(正丁醇：乙酸乙酯：水=4:1:5) 放置10min的上层溶液为展开剂， 展开,取出, 晾干, 喷以10%硫酸乙醇溶液(或浸在10 %硫酸乙醇溶液中)在105下 加热至斑点显色清晰（或在烤板中加热至斑点显色清晰）, 取出, 然后在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板, 周围用胶布固定, 在 波长: s= 530nm, R = 650nm下,用薄层色谱扫描法进行扫描，色谱图见（图2-1），测得供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值,以对照品的点样量X（ul）为横坐标，以吸光度积分值Y为纵坐标，进行线性回归，即得（图2-2） 图2-1. Re对照品溶液的TLCS谱图图2-2图2-2所得人参皂苷Re的线性回归方程为Y=13.61X+0.61，相关系数r=0.9999。2.4实验结果人参皂苷Re在19ug的范围内呈良好线性关系。所得人参皂苷Re的含量为2.163mg/ml。2.5精密度试验精密吸取对照品溶液10ul，重复点样5次，测定峰面积，其相对标准偏差RSD均小于1.50，表明仪器精密度良好。2.6稳定性试验 取适量对照品溶液点样、展开、显色，从显色15min起，每隔1h测定1次，共测5次，结果峰面积值基本不变，RSD=0.50(n=5)，表明人参皂苷Re显色后至少5h内稳定。2.7加样回收率测定 取上述已测知含量的样品5份，加入一定量的人参皂苷Re，按薄层色谱扫描的方法制备供试品溶液，依法测定，计算回收率，结果平均回收率为99.22，RSD=0.49(n=5)。见（表2-1）。 表2-1. 人参皂苷Re加样回收率（n=5）编号样品含量(mg)加入量(mg)测得量(mg)回收率%平均回收率%RSD%12.2742.2904.55999.7899.220.4922.2722.2904.53798.9132.2742.2904.55599.6142.2722.2904.54499.2152.2742.2904.53298.603.讨论本实验中所做的茯苓人参，据了解，则为首创，是首次对其进行含量测定，且为人参在食品方面的开发，口感改善提供了理论支持。茯苓是一种药食兼宜之品，其营养价值缀高 24。在伤寒论、金匮要略、本草纲目中也多有阐述而人参大补元气，所以依据药效而言，将茯苓和人参结合起来为茯苓人参，则是补气加活血有具有行气活血的功能。 人参皂苷Re的含量测定方法有：薄层扫描法、紫外分光光度法、HPLC法等。对比薄层扫描法，紫外分光光度法较为繁琐，并且煎煮时间的延长，人参皂苷Re 含量显著下降，煎煮7h后将不能再检出。所以人参皂苷Re不适宜用传统的煎煮法来提取。文献25规定采用比色法测定总皂苷含量。而比色法在操作过程中存在操作烦琐、影响因素多及重复性差等问题26，尤其是不能分别测定总皂苷中各主要成分的含量。为此，特建立了薄层扫描法（TLSC）来测定,该法快速、稳定、可靠，为进一步研究研究提取人参皂苷Re新工艺奠定了基础。而相对于HPLC法，采用TLCS 法薄层色谱中背景干扰较大, 在复方配伍的中成药中, 样品溶液的处理就更加困难, 所以文献报道较少见, 因此供试品溶液的制备是关键27。 在人参皂苷Re的含量测定中, 必需具备可定量测定的比移值( Rf) , 所以展开系统的选择也是关键。比较常用的展开剂氯仿：甲醇：水（65:35:10）10以下放置的下层液或文献报道的展开剂氯仿：甲醇：水（3:0.8:1）两次展开，人参皂苷之间互有干扰。而正丁醇：醋酸丁酯：水（4:5:1）上层液为展开剂可鉴别人参皂苷Re与其他皂苷，所以采用此展开剂可以很好的解决此类问题,但是采用此展开剂发现供试品背景干扰严重，但实验发现供试液背景斑点不够集中，不利于含量测定。如果在浓氨水饱和条件下二次展开，则能大大消除背景干扰，并且能达到较好的分离效果，所以本次实验在此处有待改进。致谢在论文完成之际，我首先要感谢长春科技学院在我四年的大学生活当中对我的教育与培养，感谢发展学院的所有专业老师对我的谆谆教导，感谢大学四年曾经帮助过我的所有同学，没有你们就不会有我今日的满载而归。从论文的选题到顺利的完成，在其撰写过程中遇到了无数的困难和障碍，都在老师和同学的帮助下度过了，在此尤其要感谢我的论文指导老师，他严谨的治学态度和求实的工作作风给我留下了深刻的印象，并多次不厌其烦地指导我论文的修改，才使得本篇论文得以顺利完成。另外还要感谢这篇论文所涉及到的各位学者。本文引用了数位学者的研究文献，如果没有各位学者的研究成果的帮助和启发，我将很难完成本篇论文的写作。在此，谨向他们致以诚挚的谢意！最后，我要向在百忙之中对本文进行审阅，评议和参与本人论文答辩的各位老师表示衷心的感谢。参考文献1 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部:M.北京:中国医药科技出版社,2010 :240-241.2中国药科大学中药辞海M北京：中国医药科技出版社。1996：1272-12783康廷国.中药鉴定学M. 北京中国中医药出版社.2006 :452.4沈思,李罕杰,梅光明等.茯苓皮三萜类物质含量的测定及其抑菌活性的研究J .食品科学,2009,30(1): 95.5段启,李霞兰,王少军等. 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The aim of this study is to develop a robust and accurate DNA marker for identifying P. ginseng and the origins of ginseng products. Two single nucleotide polymorphism(SNP) sites specic to P. ginseng were exploited from nuclear ribosomal external transcribed spacer(ETS) region. Based on the SNP sites, two specic primers were designed for P. ginseng and P. quinquefolius respectively. P. ginseng can be easily discriminated from P. quinquefolius by amplifying the two specic alleles using multiplex allele-specic PCR. Favorable results can also be obtained from commercial ginseng products. The established method is highly sensitive and can detect 1% of intentional adulteration of P. quinquefolius into P. ginseng down to the 0.1 ng level of total DNA. Therefore this study provides areliable and simple DNA method for authentication of the origins and purities of ginseng products. 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.1. IntroductionPanax ginseng (Korean ginseng) and Panax quinquefolius (American ginseng) are the most widely used Panax species, and the products of these two ginsengs have attracted worldwide consumption. Ginsenosides are the major bioactive constituents in both species, but they are known to have different properties and medicinal values 1,2. P. ginseng is considered to be “warm” and used in “yang-decient” conditions, whereas P. quinquefolius is“cool” and is mainly used in “yin-decient” conditions 3. However, American ginseng is sometimes adulterated in commercial Korean ginseng products as material by some dishonest merchants to reduce production costs, as American ginseng has much higher total ginsenosides content 4. Therefore, it is essential to develop effective methods to authenticate the origin of commercial ginseng products to safeguard public health as well as consumers rights. Although several efforts have been made for discrimination of Korean ginseng from American ginseng, authentication of the origin of P. ginseng products is not an easy task. First, the sterilization and extraction treatments in processing red ginseng extracts will result in a high degree of DNA degradation, therefore DNA molecular markers such as RAPD (random amplied polymorphic DNA), ISSR (inter-simple sequence repeat), SSR (simple sequence repeat), and AFLP (amplied fragment length polymorphisms) may get unfavorable identication results. Second, with the development of new P. ginseng cultivars 5, the current DNA molecular markers cannot identify the ginseng origins accurately. The chemical analysis method 6,7 encounters the same problem because ginsenoside prole used for authentication markers may be affected by commercial processing. In the present study, we describe a robust and reliable method for authentication of the origin of P. ginseng products, by using two SNP markers exploited from the external transcribed spacer (ETS) region of ribosomal DNA.2. Materials and methods2.1. Materials and DNA isolationSamples of ginseng plants list in Table 1were provided by Korean Ginseng Center for Most Valuable Products & Ginseng Genetic Resource Bank. The plant roots were frozen in liquid nitrogen and ground into ne powders. Genomic DNA was isolated using a plant DNA isolation kit (Exgene Plant SV mini, Gene All), according to manufacturers instructions. Commercial products of Korean ginseng and American ginseng were purchased from local market and USA, respectively. Ginseng commercial samples were used directly in DNA isolation procedure.2.2. PCR amplication of ETS regionPCR amplication of ribosomal ETS region was per-formed on ginseng plant DNA samples. Oligonucleotide primers ETSF (5-TTTGCAAGTCGTGTGAGTTG-3) and ETSR (5-AGACAAGCATATGACTACTGGCAGG-3) specic for the ribosomal ETS region were designed according to the 26S18S ribosomal DNA intergenic spacer region of P. ginseng (Gen Bank accession EU232126). The 20ul PCR reaction mixture consist of 10 ng of template DNA, 0.5uM of each primer, and 10ul of 2X Premix DNA polymerase (Genotech). PCR amplication was performed using 1predenaturation cycle of 4min at 94C, 35 cycles of 94C for 30s,60C for 3s, and 72 C for 30s, and a nal extension at 72 C for 5min. PCR products were analyzed on a 1.0% agarose gel stained with ethidium bromide. 2.3. DNA sequencing and analysisThe PCR products were puried with a PCR DNA Purication Kit (Gene All), as described in the manuf