基因工程菌在矿物加工方面的应用.doc

此文档收集于网络，如有侵权，请联系网站删除 基因工程菌在矿物加工方面应用的研究进展 摘要：基因工程菌在矿物加工方面的应用主要是浸矿方面，总结了一些先进分子生物学技术在浸矿微生物鉴定和浸矿微生物基因工程育种两方面的应用情况。关键词：基因工程菌 生物浸矿 浸矿微生物鉴定 基因工程育种目前，越来越多的分子生物学技术被应用到浸矿微生物的研究中。PCR技术以其快速、简便、灵敏、特异性好等特点广泛应用于基因工程、环境检测、临床检验等研究领域，它是生物学界的一次重大革命。如今，在PCR技术的基础上，已发展出很多可应用于浸矿微生物检测的先进分子生物学技术。一、浸矿微生物鉴定上的应用随着分子生物学技术的发展，蛋白质与基因水平的鉴定方法逐渐成为微生物鉴定的主要手段，其鉴定结果更具有说服力。目前，对于浸矿微生物的鉴定研究也以该水平上的鉴定方法为主，以常规的细胞形态生理生化鉴定手段为辅。1.DNAG+ CmoL%含量测定和DNA/DNA杂交大体来说，亲缘关系相近的种，其G+CmoL%含量接近;反之，G + CmoL%含量接近的两个种，其亲缘关系却不一定接近。一般来说，同一种微生物，其种内各菌株间的G+CmoL%值可相差2.5% 4.0%，差值过小(低于2%)，则没有分类学上的意义;若差值在5%以上，可认为是2个不同的种;若相差超过10%，则可考虑它们属于不同的属。因此，G+ CmoL%值的用途主要在于排除不确切的分类单元，而不是用它去建立一个新的分类单元1、2。DNA/DNA杂交是将待测的不同来源的DNA在体外加热使其解链，并在合适条件下使互补的碱基重新配对，然后测定杂交百分率。此值越高，说明两碱基顺序的同源性越高，即其间的亲缘关系越近1、2。这两种方法已经成为了细菌分类鉴定中的基本方法，是描述细菌分类单元中种属的一项基本标准。在浸矿微生物鉴定研究中也得到了广泛的应用，如Paul R Norris等3对多种来源的几株嗜酸性中等嗜热的革兰氏阳性的亚铁离子和硫化矿氧化细菌进行了鉴定。他们采用了SDS-凝胶电泳(SDS-PAGE)测定了全细胞蛋白质，同时提取了细胞的DNA进行了G + CmoL%含量的测定与DNA/DNA杂交试验。结合16S rRNA序列分析结果，鉴定了浸矿菌株。由此可见，这两种方法并非是浸矿微生物鉴定过程中具有确定性意义的方法，但作为基本的方法，它们在鉴定过程中是不能被忽视的。2.DNA探针分析DNA探针是依据已知菌株的部分基因序列，人工构建限制性核苷酸片段，进行标记加入到菌群基因DNA提取物中，发生反应，从而使菌株得到鉴定的一种方法。Yates J R等4在1984年率先提出了利用基因探针鉴定不同菌种，并从浸出液过程中分离出硫杆菌属菌株。这些探针能够区分不同种属以及菌株，灵敏度很高，能检测到浓度低于104的细菌量。MarkHernandez等5对腐蚀污水管道的嗜酸性菌群进行了研究。他们对其中的几种菌株进行了限制性核苷酸探针识别。所用探针分别为氧化亚铁硫杆菌和氧化硫硫杆菌为Thio820;亚铁氧化钩端螺旋菌为Lept581;嗜酸性菌属某个未确定菌种为Acdp821，这些探针都是根据相应菌株的16S rRNA序列确定的。同时，作者还应用了全细胞荧光原位杂交法(FISH法)来鉴定了腐蚀污水管道的嗜酸性菌群。结果表明，该菌群中存在氧化亚铁硫杆菌和氧化硫硫杆菌，但未鉴定出亚铁氧化钩端螺旋菌和嗜酸性菌属的菌株。Bond P L和Banfield J F6采用了16S rRNA主体基因序列库中的数据来构建了7个限制性核苷酸探针对酸型矿坑水中的微生物种群进行了原位荧光杂交检测。该探针已经被用于测定微生物的含量和分布情况，包括新的和未经过培养的菌种。并可以在酸型矿坑水中确定微生物的主体分布情况。由以上研究情况可知，使用合适的探针对于经过培养的细菌菌群与未经培养的环境样品进行特异性反应而鉴定浸矿微生物是一种非常有效的方法。3.16S rRNA和16S rDNA基因序列分析16S rRNA为原核生物核糖体小亚基的重要组分，其序列非常保守，因此它在微生物间同源性关系的研究中占有重要的地位。根据大肠杆菌16SrRNA中的保守区域序列设计引物，利用PCR技术来扩增待测微生物的16S rRNA序列，再通过相关的分子生物学软件与已知微生物的16S rRNA序列进行比对，可以计算待测微生物的进化距离，分析待测微生物的进化地位。目前， 16S rRNA分析在浸矿微生物的鉴定中得到了广泛的应用。16S rDNA是编码原核生物16S rRNA的基因，长度约为1 500 bp，其序列包含10个可变区和与之相同的11个恒定区，可变区的变异程度与细菌的系统发育密切相关。16S rDNA分析在浸矿微生物的研究中也得到了广泛的应用。Zhou等7在黄铜矿中分离出一种嗜高温和嗜酸的浸矿细菌L1(T)，并对其进行了DNA/DNA杂交、DNA G+C含量分析和16S rRNA基因序列分析，结果发现这种细菌属于Ferroplasma属，而且是一种新的品种。刘文全等8从四川攀枝花露天铁矿及煤矿的坑水和圬泥中分离出一种氧化亚铁硫杆菌pzh21，并且分析了该菌的16S rDNA序列，建立了系统发育树，结果表明该菌与氧化亚铁硫杆菌属的多种细菌具有较高的同源性(相似度98% )，其中与菌株DX(DQ529310)的同源性最高，两者位于系统发育树同一个分支中，相似度达到99172%，而与标准菌株ATCC23270 (AF465604)的相似度为98151%。刘艳阳等9通过分析16S rRNA基因序列来确定生物浸矿反应器内矿浆原样中微生物的群落组成与结构，结果表明，所选矿浆原样中主要的微生物物种有Leptospirillumsp1，Sulfobacillus sp1，Acidithiobacillussp，Spingomonas sp1及古细菌Sulfolobussp1，Ferro-plasma sp1等。同时还分离出5株纯菌株，这些菌分别与Acidithiobacillus thiooxidans， Acidithiobacilluscaldus，Acidithiobacillus ferrooxidans，Leptospirillum ferriphilum，Sulfobacillus thermosulfidooxidans相似。4.实时定量PCR实时定量PCR(real-time quantitative PCR)是指在PCR扩增时，于加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针(一种寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团)，在PCR指数扩增期间，通过连续监测荧光信号的强弱变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要对PCR产物进行分离。与常规PCR相比，实时定量PCR的特异性更强，能有效解决常规PCR反应易污染的问题，并且具有自动化程度更高的特点。目前实时定量PCR作为一种极有效的实验方法，已被广泛地应用于对浸矿微生物的研究。Zhang等10应用实时定量PCR技术对黄铜矿生物浸出体系中的嗜热细菌进行了分析，结果表明，化能自养细菌L1ferriphilum，At1caldus和异养细菌Sul-fobacillusLN，F1thermophilum在黄铜矿浸出中起主要作用。Chen等11同时采用16S rRNA基因序列分析和实时定量PCR技术对中国的一种生物浸矿滤出液中的微生物进行检测，结果表明，钩端螺旋菌属在浸出液中为优势菌属，而且检测到了唯一的古细菌F1acidiphilum。在这种浸出液中，各种细菌的比例分别是:硝化螺旋菌74%，C-变形菌14%，放线菌门6%，广古菌门6%。Liu12为6种浸矿微生物的16S rDNA基因序列设计了引物，然后成功应用实时定量PCR技术对黄铜矿浸出过程中这些细菌在不同温度下的生长动力学特性进行了研究。5.荧光原位杂交荧光原位杂交( fluorescence in situ hybridization， FISH)方法是一种物理图谱绘制方法，使用荧光素标记探针，以检测探针与分裂中期的染色体或分裂间期的染色质的杂交。FISH是一种重要的非放射性原位杂交技术，具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点。Mahmoud等13利用荧光原位杂交技术成功检出了酸性矿山水环境中的氧化亚铁硫杆菌。他们设计出一个16S rRNA探针，在5c端采用吲哚碳菁染料，结合荧光原位杂交技术对经FeTBS固体培养基培养的水样和未经培养的水样进行检测，结果表明经培养水样中的氧化亚铁硫杆菌可被检出，而未经培养水样中的氧化亚铁硫杆菌则无法检出。二、浸矿微生物基因工程育种方面的应用浸矿微生物生长速度慢，且在实际应用中，表面活性剂、重金属离子等超过一定浓度时，将抑制浸矿微生物的生长，甚至造成菌体死亡。因此，人们希望采取一定的手段对浸矿微生物进行改造。传统的方法是通过驯化、诱变来改良菌种，存在专一性差、效率低的缺陷，并且所获得的菌种只是在一定范围内有所改进，不能达到质的飞跃。分子生物学技术的不断发展为浸矿微生物的改造开辟了新的思路，即通过基因工程手段将外源基因引入浸矿微生物14。1.浸矿微生物质粒载体研究转化和接合的前提是必须要有合适的载体,也就是要以浸矿微生物的原始质粒为起点,建立重组质粒载体。研究浸矿微生物质粒的目的之一是构建在大肠杆菌和浸矿微生物中都能复制又携带选择性标记和单一限制性酶切位点的穿梭载体。郝立凯等15利用R族(IncR)质粒pBBRIMCS-2为出发质粒，将来自于大肠杆菌的链霉素抗性基因和来自于水母的绿色荧光蛋白基因作为报告基因,构建含有大肠杆菌强启动子tac的组成型表达载体pBBR-tac-Sm和pB-BR-tac-EGFP，为改造浸矿细菌，提高铁、硫氧化细菌的浸矿能力提供了合适、高效的外源基因表达载体。2.外源基因导入浸矿微生物方法研究刚开始人们探索采用转化的方法。近期Chen等16报道了一种将含有外源基因的质粒导入喜温硫杆菌的电转化方法，是喜温硫杆菌基因工程育种方面的重大突破。但有关他其浸矿微生物的转化至今还没有找到比较好的方法。转化迟迟没有成功，人们开始尝试接合转移的方法。1983年， Davidson19成功地将IncP类群的RP4质粒通过接合从大肠杆菌转移到硫杆菌中，后者又可作为供体将质粒反向转移到大肠杆菌中。1993年,金松谟17等人成功地在IncP质粒的带动下将IncQ族质粒pJRD215和pKT230从大肠杆菌转移到氧化硫硫杆菌中，建立了大肠杆菌和氧化硫硫杆菌的接合转移系统。彭建军18等人同样成功地构建了大肠杆菌和极端嗜酸氧化亚铁硫杆菌的接合转移系统。接合转移系统的成功建立，使外源基因转入浸矿微生物成为可能,为浸矿微生物基因工程育种打下了坚实的基础。到目前为止,已有多种浸矿微生物基因工程菌被成功构建。1995年，徐海岩19等将抗砷片段克隆到pJRD215中构建成新的抗砷载体pSDX3，通过接合转移将其转到Tf-59中,并得到了表达，使Tf-59的抗砷水平有了很大的提高。2005年边疆20利用pJRD215构建成带有抗砷基因的IncQ质粒pSDRA1，并通过接合转移成功地将pSDRA1转入到了喜温硫杆菌中，使喜温硫杆菌的抗砷性能获得了明显提高。2006年陈丹丹21将抗汞基因与IncQ族质粒pJRD215连接，构建了抗汞质粒载体,并成功地通过接合转移系统转入到了喜温硫杆菌中，使喜温硫杆菌的抗汞能力获得了明显提高。2006年刘玮22利用pJRD215构建了带有磷酸果糖激酶的重组质粒pSDK-1，并成功地将其转入了到野生型氧化硫硫杆菌中，结果这种氧化硫硫杆菌能利用葡萄糖，其生长量随着葡萄糖浓度的提高逐渐增加。2009年蒙建州23利用IncQ族质粒载体pBBR1MCS-2构建了新的具有链霉素抗性的低分子量质粒载体，并连接抗砷基因构建成抗砷载体pMSD2-As，然后通过接合转移将pMSD2-As转入喜温硫杆菌并获得了表达。结语随着基因工程学突飞猛进的发展，一些先进的生物技术也应用到对金矿微生物的研究中来，从而明确了浸矿微生物的分类地位，深入揭示了浸矿体系中微生物的演替及其浸矿机理，为有效的利用微生物服务于矿业生产奠定了坚实的基础。参考文献1 周德庆.微生物学教程.北京:高等教育出版社，19932 东秀珠，蔡妙英，等编著.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，20013 Paul R,Norris,Darren A Clark,Jonathan P Owen,et al.Characterization of Sulfobacillus 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