基因克隆质粒载体.doc

此文档收集于网络，如有侵权，请联系网站删除第六讲 基因克隆的质粒载体 中国科学院遗传与发育生物学研究所 基因克隆的质粒载体一、导言1质粒是一类引人注目的亚细胞有机体其结构比病毒还要简单，既无蛋白质外壳，也无细胞外生命周期，只能在寄主细胞内增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。2质粒的类型多种多样F质粒：F因子或性质粒(Sex plasmid)，它能够使寄主染色体上的基因与F因子(F factor)一道转移到原先不存在该质粒的寄主受体细胞中去。R质粒：通称抗药性因子(Resistant factor, R factor)，编码一种或数种抗菌素抗性基因，并能将此抗性转移到缺乏该质的适宜的受体细胞中去。Col质粒：所谓Col质粒，即是一种产生大肠杆菌素的因子，编码控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素可使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。3质粒载体70年代在实验室构建的一类最普遍使用的基因克隆载体。二、质粒的一般特性1质粒DNA(细菌质粒定义*1.大肠杆菌的质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是质粒DNA。但是质粒DNA的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。*2.质粒DNA分子大小文献中有3种说法：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质；大的可达105KD，两者相差上百倍。1Kb200Kb (Sambrok et al.)5Kb400Kb (Lehninger)MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿)1.5Kb1MD*3.质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。*4.质粒DNA的分子构型SC构型：即共价闭合环形的cccDNA所呈现的超螺旋构型。走在凝胶的最前面。OC构型：即开环DNA(ocDNA)所呈现的构型，其中一条DNA链保持完整的环形结构，另一条链上则出现有一个至数个的缺口。走在凝胶的最后方部位。L构型：发生双链断裂形成的线性DNA分子所呈现的构型，通称L型。走在凝胶中间部位。2质粒克隆载体必须具备的条件(三种共同的组成部分)具有复制区或复制因子(replicator) 复制因子：是指一段特定的质粒DNA，它含有质粒DNA的复制起点(ori)(origin of replication)，以及编码质粒DNA和质粒复制所需要的DNA序列结构。*注意 复制因子(replicator)和复制子(replicon)之间在概念上的差别。复制子(replicon)：系指含有一个复制起始位点的DNA复制单位，例如细菌染色体、病毒基因组、质粒基因组等，凡其DNA能够进行自主复制的遗传单元均称为复制子。*在一般的情况下，一个质粒只含有一个复制起点，构成一个独立的复制子。但在少数的情况下，由融合产生的质粒也会含有两个复制子，但其中只有一个有活性。具有抗菌素抗性基因一种理想的质粒克隆载体应具有两种抗菌素抗性基因，以便为寄主细胞提供易于检测的表型性状作为选择记号，而且在有关的限制酶识别位点上插入外源DNA片段之后形成的重组质粒，至少仍要保留一个强选择记号。具有若干限制酶单一识别位点这样的分子结构特性，可以满足基因克隆的需要，而且在其中插入适当大小的外源DNA片段之后，应不影响质粒DNA的复制功能。具有较小的分子量和较高的拷贝数这类质粒的优点在于：a.低分子量质粒易于操作，克隆了外源DNA片段之后(一般不超过15Kb)仍可有效地转化给受体细胞；b.含有较高的拷贝数有利于质粒DNA的制备，增加克隆DNA片段(基因)的产量；c.低分子量的质粒分子中对某种限制酶具多重识别位点的机率也就相应下降；3质粒DNA编码的表型质粒DNA的分子量较小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为3%。质粒DNA尽管分子量 小，但却编码着重要的遗传性状：a.抗性特征：抗菌素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性，以及其它抗性。b.代谢特征：抗菌素及细菌素合成；简单的碳水化合物(例如乳糖、蔗糖等)的新陈代谢；复杂碳水化合物(甲苯、苯胺)及卤代化合物的新陈代谢；蛋白质新陈代谢；固N作用；H2S的合成；柠檬酸的利用；欧文氏菌的色素形成；产碱杆菌的反硝化活性；产碱杆菌和欧文氏菌的硫氨素的合成；c.修饰寄主生活方式的因子：大肠杆菌肠毒素的合成；金黄色葡萄球菌剥脱性毒素的合成；炭疽杆菌外毒素的合成；苏芸金芽孢杆菌l-内毒素的合成；破伤风杆菌神经毒素的合成；大肠杆菌定居抗原的合成；大肠杆菌及链球菌等的溶血素的合成；肠道细菌的血清抗性；耶尔森菌的毒力；炭疽芽孢杆菌的荚膜的合成；大肠杆菌中铁的运转。d.其它特征：盐杆菌细胞中气泡的形成；链霉菌之痘疱形成的(致死接合)；肺炎克氏杆菌中的Kik+IncN质粒的致死效应；土壤杆菌对细菌素的敏感性；麻风杆菌之半透明/不透明菌落的变异；Nod+Flx+豌豆根瘤菌的根际蛋白质的合成；Caedibacter包涵体的产生；葡萄球菌之内肽酶活性。4质粒DNA的转移接合型质粒和非接合型质粒*接合型质粒(conjugative plasmid)：又叫自我转移质粒，具有自我复制基因。控制细菌配对和质粒接合转移的基因；*非接合型质粒(non- conjugative plasmid)：亦叫不能自我转移的质粒，具有自我复制基因，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此不能够从一个细胞转移到另一个细胞。加上大肠杆菌素基因大肠杆菌Col质粒非接合型质粒加上抗菌素抗性基因大肠杆菌R质粒，也称R因子。带上一段寄主染色体DNAF因子接合型质粒(F因子) 加上大肠杆菌素基因大肠杆菌素Col质粒加上抗菌素抗性基因大肠杆菌R质粒，R因子接合型质粒 F因子是最有代表性的接合型质粒：F因子在寄主菌中的三种存在方式：a.染色体外双链环形DNA，F+细胞b.染色体外双链环形DNA F细胞+寄主染色体DNA片段c.以线性DNA形式整合到 Hfr细胞寄主染色体DNA上。接合型质粒F因子的接合转移：F+细胞和F-细胞，以及性须pilus结构F+细胞和F-细胞混合培养，通过性须作用，细胞配对，这个过程称细菌的接合作用(conjcogation)在细胞配对期间，F+细胞中的F因子接滚环复制模型，经过性须通道进入F-细胞(单链)F-细胞变成F+细胞质粒的接合转移与基因工程的安全载体问题：从基因工程的安全性角度考虑，我们感兴趣的主要是非接合型质粒：理由是：接合型质不但自身转移；还可引起寄主染色体片段转移；而如果F因子整合到寄主染色体上，则会牵动染色体发生高频转移；引起其它非接合型质粒发生迁移作用。5质粒DNA的迁移作用(mobilization)质粒DNA迁移作用的概念由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程叫做质粒DNA的迁移作用。非接合型质粒由于分子量小不足以编码转移过程所需的全部基因，因而不能够发生自身转移，但如果寄主细胞中存在着共存着一种接合型质粒，那么它们通常也就可以被转移。质粒DNA迁移作用原理ColE1质粒 是一种可迁移的非接合型质粒ColE1质粒迁移的生化过程：迁移条件bom位点，(位于ColE1质粒分子上)mob基因编码的核酸酶，又叫迁移蛋白*1.bom位点又叫nic位点，迁移蛋白作用于nic位点，从而引动非接合型质粒发生迁移作用。mob gene=接合性动员基因 conjugative mobilization gene.nic site=自我转移的接合型质粒在起始接合性DNA转移时，在转移起点oriT进行链特异性及以部位特异性的单链切割的DNA部位。*2.许多质粒载体在构建过程中已失去了nic位点，故此不能被迁移。种nic-质粒的转移途径是形成融合质粒，从而使它们在形体上变成接合型质粒的一部分。*3.重组缺陷(recA)寄主菌株的使用在重组缺陷的寄主菌株中，nic-质粒就不会同接合型质粒发生重组，因此在recA寄主中，nic-质粒比nic质粒较为稳定。*4.图4-5解释6质粒DNA的复制类型低拷贝数质粒“严紧型”控制的(stringent plasmid)高拷贝数质粒“松弛型”复制控制的(relaxed plasmid)质粒拷贝数定义：在文献中常用有两种定义A常用定义：生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含的质粒DNA分子数。B特殊定度：培养在富裕培养基中快速生长的细菌细胞，可拥有3-4条染色体DNA，而在碳源供应不足的培养基中缓慢生长的细菌细胞，平均只有1.1条染色体DNA。因此有的文献中质粒拷贝数定义是：每个细菌细胞中每条染色体平均具有的质粒DNA分子数。C本书定义： 在LB液体培养基中生长的每个细胞中含有高于20个以上质粒DNA者，叫做高拷贝质粒(High-copy-number plasmids)；低于20个的则称为低拷贝质粒(low-copy-number plasmids)。7质粒的不亲和性问题(incompatibility)不亲和性，即不相容性 定义：是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定共存的现象。 注意：只有当有确切的证据表明第二种B已经进入含有A质粒的寄主细胞，而且它的DNA不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种细胞却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说A和B是不亲和的质粒。 不亲和群的概念：彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群(incompatibility group)。彼此能够共存的质粒则属于不同的不亲和群。同一不亲和群的南粒在亲缘关系上则比较接近。质粒不亲和性的分子基础质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的：*1负反馈调节环(negetive feed-back loop)大多数质粒产生可控制质粒复制的阻遏蛋白质，其数量与细胞中质粒拷贝数成正比。在质粒拷贝数少的情况下，细胞中阻遏蛋白质亦相对降低，于是阻遏蛋白质与质粒DNA中靶序列相互作用，使之发生复制。随着质粒DNA复制的结果，质粒拷贝数上升，于是所编码产生的阻遏蛋白质也就随之增多。细胞中阻遏蛋白质浓度增多的结果，会形成二聚体，于是失去与质粒DNA结合并促使其发生复制的能力。结果质粒复制停止，也就是说质粒拷贝数是受阻遏蛋白质的负反馈调节：负反馈调节环(negetive feed-back loop)当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。当质粒处于低拷贝数和低浓度的阻遏蛋白时，其复制活动更会继续时行。*2.同一个细胞含两种相容质粒由于这两种相容质粒亲缘关系远，故它们所产生的阻遏蛋白质就不会互相影响另一个质粒的复制。于是这两种相容的质粒在同一细胞中都保持着自己的正常拷贝数。*3.同一细胞含两种不相容的质粒鉴于这不相容的质粒亲缘关系密切，它们所产生的阻遏蛋白质不仅影响自身质粒DNA复制，还会彼此影响对方质粒DNA的复制。这就出现了两种阻遏蛋白质联合调控质粒复制速率。质粒拷贝数控制体系无法辨别这两种不相容性质粒，只是随机地选择其中一种进行复制。于是出现拷贝数偏差。两种不相容质粒往往拷贝数不相当，其中高拷贝数的对复制抑制剂的敏感性较低拷贝数的要差一些。因此在复制抑制剂(阻遏蛋白质)浓度低的情况下，高拷贝质粒仍可复制，从而最终使低拷贝质粒被淘汰掉(稀释掉)。三、质粒DNA的分离与纯化1氯化铯-EtBr密度梯度离心原理(1)寄主染色体DNA与质粒DNA高级结构的差异*所谓质粒DNA的分离纯化的分子本质是，在细胞破裂后释放出来的染色体DNA和质粒DNA的混合物中，如何将质粒DNA与染色体DNA区分开来，得到只有质粒DNA的过程。*但是由于质粒DNA与染色体DNA在化学结构上并没有什么差别，因此，要使质粒DNA与其寄主染色体DNA区分开来，达到分离与纯化的目的，就必须从两者DNA的高级结构上寻找突破口。实验表明，在细胞裂解和DNA的分离过程中，大分子量的细胞染色体DNA容易断裂成相应的线性片段，而质粒DNA由于分子量小，结构紧密，因此仍能保持完整的状态。氯化铯-EtBr密度梯度离心法，就是根据这种寄主染色体DNA与质粒DNA在高级结构上的差别(或说是异质性)而建立的一种经典的分离纯化质粒DNA的技术。(2)CsCl的作用在氯化铯密度梯度离心中，氯化铯是作为介质其密度为1.7g/cm3，经过一段超速离心平衡之后，便形成了1-1.9052g/cm3的连续的浮力密度梯度。已知大肠杆菌寄主染色体DNA、质粒DNA、大肠杆菌寄主染色体DNA和RNA等4种大分子物质，具有不同的浮力密度，因此经过超离心平衡之后，便会分布在CsCl连续密度梯度介质的等密度位置上，从而达到了彼此分离的目的：a.RNA大分子 浮力密度=2.0g/cm3， 沉于离心管底b.蛋白质分子 浮力密度介于1.3-1.4g/cm3，浮于液面c.DNA大分子 浮力密度约为1.70g/cm3，在中间部位(3)EtBr的作用*1.溴化乙锭分子的插入作用。由于EtBr是具有扁平的分子，可以插入到DNA分子的碱基之间，即通过这种在碱基间的嵌入作用而结合在DNA分子链上，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应。*2.各种不同来源的DNA分子在浮力密度之间差别不大，例如大肠杆菌染色体DNA为1.7g/cm3，f174噬菌体DNA为1.718g/cm3；而同一种DNA分子的不同构型，其浮力密度均为1.70g/cm3。因此在氯化铯连续密度梯度中难以区分，形成十分接近的区带。*3.不同构型的DNA分子结合EtBr的能力不同。OC构型和L构型的DNA(包括E.coli染色体DNA片段)，因其具有游离的末端而易于解旋，故可结合大量的EtBr分子。导致密度下降！SC构型的DNA(质粒cccDNA)，由于没有游离的末端，只能发生有限的解旋反应，结果便限制了与EtBr的结合能力。因此，在加入EtBr之后，cccDNA比OC DNA及SC DNA，在浮力密度上要上升0.04，达到很好分离的目的。因此，在EtBr达到饱和浓度的条件下，质粒cccDNA就要比线性的染色体DNA片段以及L构型和OC构型的质粒DNA，具有更高的密度，这样通过氯化铯密度梯度离心之后，就会平衡在不同位置上，从而达到纯化质粒DNA的目的。2氯化铯密度梯度离心纯化质粒DNA的优缺点(1)优点：可以获得高纯度、高质量的质粒DNA许多种与基因克隆有关的实验，例如限制性内切酶的消化作用、探针制备的缺口转译、DNA序列分析等，都需要高纯率的、不含污染物的质粒DNA制剂，对此微量碱法一般来说是不适用的。(2)缺点及注意事项*1.氯化铯价格昂贵，因此非必要的情况下，要尽量避免使用；*2.EtBr(Eethidinm bromid)，是一种强烈的致癌化学物质，务必小心操作，避免伤害人体和造成环境污染。*3.通过CsCl梯度纯化DNA时，就不要使用SDS，因为它不溶于CsCl溶液，当然可用其它的去污剂，例如Sodium sarcosinate代替。*4.由于在有CsCl的条件下，可见光有可能造成DNA发生单链缺口(Nick)(失去一个磷酸二酯键)，所以在加入EtBr之前，应用锡箔纸包裹容器或是在暗室中操作(避光的环境)。异戊醇：isopropanol异丁醇：isobutanolEtBr经异戊醇抽提后，便被分配到上相中去(粉红色)*5.EtBr影响酶切反应，故应将其从DNA溶液中除去办法是加异戊醇或异丁醇，但两者得光用DNA buffer饱和。*6.EtBr是扁平的分子，它与DNA分子相互作用，插入两个核苷酸之间，从而降低了DNA分子在CsCl中的密度共价闭合环形(ccc)的DNA结合EtBr的量要比开放环形(OC)的及线型的DNA的少得多，因此通过CsCl梯度，便可以容易地将cccDNA同其它型的DNA分离开。*7.在使用Beckman L5-65型超速离心机时，建立CsCl梯度的条件：转子型号转速(PPM)离心时间离心温度Type5044,000 60,00040-44hours 48h5Type6544,000 60,00040hours 24h5VTi6550,00020-24hours5Vti70.160,00024h*8.用长波紫外光显示DNA带，并戴保护镜在254，300或366nm波长的紫外光照射下，EtBr DNA复合物便会马上发出荧光。但短波UV会使DNA出现单链缺刻或是形成二聚体，所以观察DNA及取样时均使用长波段紫外光(366nm)。*9.从DNA溶液中除去EtBr加入1体积经缓冲液饱和的异戊醇(isopropanol)或异丁醇(isobatanol)到DNA溶液中，混匀后静置片刻，EtBr便被抽提到上相中去(呈末了红色)。由于isopropanol或isobutanol两者均能从DNA溶液中移去水，从而使DNA得到浓缩。这样也就改变了DNA buffer的体系的体积，所以事先得用DNA buffer饱和isopropanol或isobutanol。应尽量除净EtBr，因它影响酶切反应。四、质粒DNA的复制与拷贝数的控制1ColE1质粒DNA复制调节的机理(From L. Snyder and W. Champrees. P.111-112)(1)RNAI和RNAII分子：RNAI和RNAII这两种分子都是由ColE1 DNA转录产生的，是控制ColE1质粒复制的两种关键因素。RNAI和RNAII分子的互补关系：由于这两种RNA分子是根据同一区段DNA的正反链合成的，因此两者的序列是彼此互补的。RNAI是由ColE1质粒的inc基因编码的一种小分子量的RNA分子，它通过干扰RNAII分子的加工而抑制质粒DNA分子的复制。RNAII也是由ColE质粒DNA编码的另一种小分子量的RNA分子，它可形成质粒DNA复制的引物，并在复制起点形成RNA-DNA杂交分子。(2)RNase的功能：RNase是一种核酸内切酶，它切割RNAII分子释放出3-OH作为DNA聚合酶I催化的DNA复制的引物。但是，除非RNAII被RNaseH加工，否则它无 *(见P.5-16页)这种蛋白质形成二聚体，增强了RNAI和RNAII之间的碱基配对作用。结果RNAII(引物)的加工便被抑制，甚至于在RNAI分子处于相对低浓度的情况下亦是如此。2质粒DNA拷贝数的控制(1)天然质粒拷贝数的控制实验证明，一个细胞中每种质粒拷贝数的多寡是通过控制DNA合成的启动速率来调节的。低拷贝质粒在细胞分裂前只需复制少数几次就够了。高拷贝质粒在细胞分裂前需要复制多次才能达到足够数量的拷贝数。(2)杂种质粒拷贝数的控制pSC134质粒是由ColE1和pSC101重组形成，这两个质粒的拷贝数分别为18个和6个。从ColE1 ori开始的复制，pSC134拷贝数可达16个，大体接近ColE1的拷贝数。图ColE1及其派生质粒的复制调节：RNAII分子在其能够引发质粒DNA进行之前，必需经受RNaseH的加工。(RNAII分子必须经过RNaseH加工之后，才能引动质粒DNA进行复制)。“起点origin”表示RNA引物和DNA之间的转换点(transition point)。在大部分时间中，RNAI和RNAII分子结合，从而抑制(RNaseH)对RNAII的加工，结果质粒的拷贝数受到了调节。PRNAI和PRNAII是分别代表RNAI和RNAII转录的启动子。Rop Protein二聚体增强了RNAI和RNAII之间的起始配对。法作为引物启动质粒DNA的复制，因此质粒DNA的复制活动也就停止了。由于RNAI和RNAII这两种RNA分子的序列是彼此互补的，故可形成双链的RNA双螺旋分子。这种结构的形成便阻止了RNAII分子的加工，从而阻止了质粒DNA的复制。(3)ColE1质粒维持其拷贝数的机理上述这些情况解释了为什么ColE1质粒能够维持其拷贝数的原因：*1.因为RNAI分子先由ColE1质粒DNA编码合成的，所以当质粒拷贝数增多时，便可合成出较多数量的RNAI分子。而高浓度的RNAI分子又反过来干扰大多数RNAII分子的加工，于是质粒DNA的复制便被抑制。当细胞中质粒的拷贝数达到大约16个时(ColE1质粒的拷贝数是每个细胞16个)，质粒DNA的复制便几乎被完全抑制。*2.除了RNAI之外，质粒编码的一种叫做Rop的蛋白质，也帮助维持ColE1质粒的拷贝数。3质粒复制控制的分子模型：*抑制蛋白质稀释模型(Inhibitor dilution model)关键论点是：阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。*自体阻遏蛋白质模型(Autorepressor model)关键论点是：阻遏蛋白质的合成受负反馈(Negative feedback)机理调节，而且其浓度是恒定的。1抑制蛋白质稀释模型观点：a.质粒DNA的复制，是受一种由质粒DNA编码的抑制蛋白质Cop调控的。b.细胞中Cop蛋白质的浓度是同质粒分子的拷贝数成正比。c.Cop蛋白质抑制质粒DNA复制活性的作用方式有两种途径：第一种途径：直接抑制途径。通过同质粒DNA的复制起点(Ori)结合，直接地抑制质粒的复制。第二种途径：间接抑制途径通过阻断起始蛋白质的合成，间接地抑制质粒DNA的合成。*一般认为单体状态的Cop抑制蛋白质没有活性，只有它处于多体状态时是才有活性的；单体抑制蛋白质和多体抑制蛋白质间的平衡，完全取决于细胞中的抑制蛋白质自身的浓度；作用机理：在细胞生长过程中，体积加大抑制蛋白质的浓度随之下降形成单体的抑制蛋白质失去抑制活性，结果对质粒DNA的复制的抑制作用也就被撤除了质粒DNA复制启动拷贝数不断上升到一定程度形成多体形式的抑制蛋白质具有抑制活性重新导致质粒DNA复制活性的抑制。2自体阻遏蛋白质模型第一种解释：质粒DNA的复制是由一种叫做起始因子蛋白质Rep引发的；这种Rep蛋白质是质粒DNA复制启动作用的限速因子，它的浓度决定着每个细胞每个世代之质粒分子的最终复制总数；Rep=起始因子蛋白质起始因子蛋白质Rep的编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因atr，同属于一个操纵子，共转录成一个mRNA分子；Atr=自体阻遏蛋白质自体阻遏蛋白质通过同启动子-操纵单元(P/O)的结合作用，调节质粒DNA的转录作用，以维持细胞中Atr和Rep蛋白质处于恒定的水平；由Atr蛋白质调节产生的Rep蛋白质，是通过同复制起点(ori)的结合，引发质粒DNA的复制。第二种解释：Rep蛋白质是一种具有双重功能的蛋白质：a.它既有自体阻遏蛋白质的功能，可同P/O区结合而抑制转录作用；b.它又既有起始蛋白质的功能，能对复制起点(ori)发生作用，引发质粒DNA进行复制。自体阻遏蛋白质提供的这种负反馈环(Negative feed back loop)。保证了细胞中的Rep蛋白质的浓度，因而也就是质粒DNA的复制速率，是处于恒定状态，而与细胞的体积、生长速率或质粒的拷贝数无关。五、质粒载体的构建及其类型1质粒载体必须具备的条件a.具有复制起点：这是质粒增殖所必不可少的条件，亦可帮助维持正常的质粒拷贝数b.具有抗菌素抗性基因：提供转化子的选择记号，理想的质粒载体应具两个抗菌素抗性基因。在外源DNA插入之后，仍应保留一个强选择记号。c.具有若干种限制酶单一识别位点：这一特点可满足克隆需求，而且要求在插入了外源DNA片段之后，应不影响质粒DNA的复制功能。d.具有较小的分子量和较高的拷贝数易于操作，而且在插入了外源DNA(一般不超过15Kb)仍可有效地转化受体细胞。2质粒载体选择记号(书P.202)a.氨苄青霉素抗性基因(ampr)b.氯霉素抗性基因(cmlr)c.卡那霉素抗生基因(Kanr)d.链霉素抗性基因(strr)e.四环素抗性基因(tetr)3不同类型的质粒载体(1)高拷贝数的质粒载体根据不同实验目的选用不同类型的质粒载体。如果克隆的目的仅仅是为了分离大量的高纯度的克隆基因的DNA片段，对于这样的实验则应选用高拷贝的质粒载体：通常是ColE1和pMB1或它们的派生的质粒载体。这些质粒具有：低分子量高拷贝数的优点氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000-3000个拷贝之多。(2)低拷贝数质粒载体F质粒和pSC101是两种天然产生的低拷贝质粒；此外还这两个质粒派生出一批低拷贝质粒如：pLG338, pLG339, 及pHSG415等。*低拷贝质粒的特点：体积小拷贝数少基因剂量少*低拷贝质粒的特殊用途：当用高拷贝质粒作载体时其产物含量过高，即超量表达严重扰乱寄主细胞正常的新陈代谢。例如：a.编码表面结构蛋白的一些基因；b.调节细胞基础代谢活动的蛋白质编码基因；c.囊性纤维化跨膜传导调节蛋白编码基因；对于诸如此类的蛋白质编码基因，应选用低拷贝质粒作载体进行克隆，使之置于严紧的复制控制之下，以保证其蛋白质产物对寄主细胞的毒害降低到最低限度。(3)失控的质粒载体高拷贝数质粒优缺点：产量高，但有可能使寄主细胞致死低拷贝数质粒优缺点：产量低，避免了寄主细胞致死，但有可能弄巧成拙，达不到预期目的。解决这个问题的办法是使用失控的质粒载体(Runaway plasmid vectors)失控的质粒载体，在有的文献中也叫做复制控制失控的质粒载体。其依据的原理：一些低拷贝数的质粒，其复制控制是温度敏感型的，也就是说在不同温度下拷贝数会有明显的变化。例如：pOU71 37 1个拷贝/cell42 1000个拷贝/cellB. E. Uhlin et al. (1979年)发展了第一批失控的质粒载体pBEU1和pBEU230 适量拷贝数/cell35 拷贝数持续上升在此高温下，pBEU1和pBEU2可持续细胞生长及质粒复制2-3小时，质粒DNA累积达细胞总DNA的50%左右。(4)插入失活型的质粒载体克隆的外源DNA片段编码着可供作选择记号的表型功能，这种情况是十分罕见的。DNA分子探针的应用 这是十分麻烦的过程插入失活型质粒载体的应用解决了上述这问题即转化的选择问题应用插入失活型质粒载体，例如pBR322，具有Teer和Ampr两种抗药性抗性基因，将外源DNA片段插入其中任何一个抗性基因序列都会导致该基因的失活：pBR322+DNA片段(插入在Tetr Gene)根据Ampr表型选择转化子根据Ampr+Teer表型和Ampr+Tees表型筛选出具插入序列的转化子克隆(5)正选择质粒载体*正选择概念：遗传学上的正选择(direct selection)，是指应用只有突变体或重组体分子才能正常生长的培养条件进行的选择。*正选择质粒载体(direct selection vectors)：按照遗传学上正选择的概念发展的一类具有直接选择记号并可赋予寄主细胞相应表型的质粒载体，特称为正选择质粒载体。*正选择质粒载体的优点：a.极大地降低了需要选择的转化子的数量；b.减轻了实验的工作量；c.提高了选择的敏感性。*正选择质粒载体举例：例I a. pKN80质粒载体就是一种正选择类型的质粒载体。其正选择的原理如下所述：该质粒带有来自Mu phage DNA的EcoRI-C片段；此EcoRI-C片段编码一种致死功能的Kil基因；该致死基因是受原噬菌体阻遏蛋白控制的，当其转化到对Mu phage敏感的细胞之后，便可得到有效的表达。pKN80质粒可以在Mu phage溶源菌株中正常地复制，不致死而对非溶源菌株则是致死的。在pKN80质粒的HpaI或Hind位点插入外源DNA之后，会使Kil基因失活即使去致死功能，产生出具Ampr表型的Mu phage非溶源的转化子菌株。例IIb. pUR2是另一种正选择质粒它是根X-gal显色反应原理作重组体转化子正选择的。辨别方法：生长在X-gal-IPTG平板上的菌落。只含有pUR2质粒的克隆显蓝色，在EcoRI、BamHI或Hind具外源插入序列的重组子质粒，这样的转化子克隆呈白色。例. c. pTR262质粒也是一种正选择质粒辨别方法：含重组质粒(具外DNA插入的)的转化子克隆呈Tetr表型，反之则呈Tets表型*正选择质粒载体的局限性：a.需用特殊的寄主菌株或选择培养基b.可使用的克隆位点少c.假阳性机率高。(6)表达型质粒载体*在基因克隆工作中，人们感兴趣的往往不是目的基因本身，而是其编码产物蛋白质。特别是商业中、医药中以及科研方面具有重要意义的蛋白质。*这些基因的调控元件往往无法被Ecoli遗传体系所识别，而超量表达又会导致寄主细胞致死。*所以必须把这些真核基因的编码序列置于原核启动子的调控之下，故需建立表达载体。*表达质粒载体定义：按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体，包括表达型质粒载体和表达型噬菌体载体。六、重要的大肠杆菌质粒载体1pSC101质粒载体是一种典型的严紧型控制的低拷贝的大肠杆菌质粒载体，是第一个成功地用于在E.coli中克隆真核DNA的大肠杆菌质粒载体：拷 贝 数： 1-2个/cell分子大小： 9.09Kb抗性表型： terr2ColE1质粒载体ColE1是属于大肠杆菌Col类质粒的一种，可产生细菌素，故Col质粒又叫做细菌素质粒。ColE1质粒的特点：拷 贝 数： 高拷贝数分子大小： 6.36Kb选择表型： ColE1imm3pBR322质粒载体拷贝数： 较高以经氯霉素扩增后可达1000-3000拷贝/cell分子大小： 4.4Kb选择表型： terr, ampr(1)pBR322质粒载体的优点：a.具有较小的分子量；b.具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号；c.具有较高的拷贝数，特别是经过氯霉素扩增之后，可达1000-3000个拷贝/细胞(2)pBR322质粒载体的缺点：a. pBR322质粒载体虽然失去了迁移蛋白质基因mob，但却保留着这种蛋白质的作用位点bom。因此在F. ColK和pBR322三种质粒共存的情况下，由ColK质粒产生的迁移蛋白质就会作用于pBR322的bom位点，通过F质粒提供的转移装置而发生迁移作用。b. pBR322质粒上的EcoRI位点不会发生插入失活，而EcoRI酶又是基因工程中最常用的一种核酸内切限制酶。4pUC质粒载体(1)pUC质粒载体的结构(i)来自pBR322质粒的复制起点(ori)(ii)氨苄青霉素抗性基因(ampr)，但其核苷酸序列已经发生了改变，不含有原来的限制酶切割位点。(iii)大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码a-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因。(iv)位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点(MCS)区段，但它的存在并不破坏该基因的功能。(2)pUC质粒载体的优点：a.具有更小的分子量和更高拷贝数例如：pUC8和pUC18分子大小分别为2750bp和2686bp，在未经氯霉素扩增的条件下拷贝数可达500-700个/cell。b.适于用组织化学方法检测重组体。pUC质粒载体中的lacZ基因编码的a-肽链可能与a-互补作用，因此可以用X-gal-IPTG组织化学显色反应方法进一步对重组体转化子克隆进行鉴定。c.具有多克隆位点MCS区段。pUC质粒载体中MCS区段与MBmp80噬菌体上的MCS相同，可在这两类载体之间来回穿梭。5其它重要的质粒载体(1) 丧失迁移功能的质粒载体丧失了bom位点，因此不会被迁移(2) 能在体外转录克隆基因的质粒载体(3) 穿梭质粒载体Shuttle plasmid uectors七、质粒载体的稳定性问题1质粒载体不稳定性的现象克隆有外源基因的质粒载体当其转化到寄主细胞之后会发生一系列的生理变化，影响到自身的稳定性。a.导致寄主细胞发生变化，例如生长速度下降，形态学特征发生变化等。b.无质粒突变体细胞的产生无质粒的大肠杆菌细胞突变体、质粒拷贝数减少的大肠杆菌细胞突变体、克隆基因无法表达的大肠杆菌突变体。*正是由于此类突变体细胞具较快的生长速度，经过持续增殖之后，其数量便会迅速地超过、甚至取代具正常质粒拷贝数的寄主细胞，成为培养物中的优势群体。2质粒不稳定性的类型 结构不稳定性分离不稳定性质粒不稳定性(plasnid instability)，包括分离不稳定性(segregational instability)和结构不稳定性(structural instability)两个方面：结构不稳定性与分离不稳定性。(1)结构不稳定性(Structural instability)由转位作用和重组作用引起的质粒DNA的重排与缺失等突变，是造成质粒不稳定性的一个重要原因。*1.缺失突变引起的质粒不稳定性：现已观察到在许多质粒DNA中存在着自发缺失的现象；人工构建的具有多个串联启动子的质粒载体特别容易发生缺失作用。*2.重组作用引起的质粒不稳定性：一方面存在质粒载体位点之间的同源重组；另一方面大肠杆菌寄主染色体与质粒载体上的IS因子或转位因子，同样也会引起结构的不稳定性。这是由于通过IS序列和转位因子的插入作用、邻位缺失或DNA倒位，都有可能使质粒载体产生自发突变。(2)分离不稳定性*1.定义：由质粒不平均的缺陷性分配(defective partitioning)所造成的质粒丢失现象，叫做质粒分离的不稳定性。*2.质粒稳定遗传条件：a.每个世代每个质粒都必须发生一次复制；b.在细胞分裂时，复制形成的质粒拷贝必须分配到两个子细胞中去；*3.质粒拷贝分配途径：在细胞分裂过程中，质粒拷贝分配到子细胞的途径有两种不同的方式：主动分配(active partition)和随机分配(random distribution)。主动分配方式，包括平均分配机理，它使每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝。配对位点分配机理，它认为只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。由于主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳定性。随机分配方式，它是指在细胞分裂过程中，质粒拷贝数在两个子细胞之间是随机分配的。由此产生的分离频率，即形成无质粒细胞的频率相当低，因此，在一般情况下，通过随机分配质粒亦可得到稳定的遗传。3影响质粒稳定性的因素：a.新陈代谢负荷；b.拷贝数差度；c.寄主重组体系；(1)新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应。质粒对寄主的影响：a.加重寄主细胞的新陈代谢负荷；b.延长寄主细胞的世代时间(达15%)；克隆的外源DNA片段越大，寄主细胞的世代时间也就越长；正是由于上述这些原因，使得含有质粒载体的寄主细胞加重了代谢的负荷，降低了生长速度。因此，尽管在细胞分裂过程中，因随机分配而产生的无质粒载体细胞的机率相当低，但由于这些细胞生长速度快，经过初始的缓慢积累之后，最终便会取代具质粒载体的细胞成为培养物中的优势群体。(2)拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响*1.在大肠杆菌培养物中，产生无质粒载体细胞的速率，是由分裂细胞中的质粒拷贝数决定的。不过这里有必要指出，文献中所说的质粒载体拷贝数，是实验测定的大量细胞的平均值，它并不反映细胞群体中质粒载体拷贝数分布的客观无能为动态。*2.质粒载体拷贝数差度：事实上在同样的细胞培养物中，每个细胞所拥有的质粒载体拷贝数是不尽相同的。这种不同细胞个体之间的质粒载体拷贝数的差异程度，简称差度(variance)。*3.质粒差度可影响质粒载体丢失的速率，也是造成质粒载体不稳定性的原因之一：具高差度分布的质粒载体，其稳定性就比较差，这是因为位于低拷贝数的一端，产生无质粒载体细胞的频率相当高；具氏差度分布的质粒载体，其稳定性就相当高。图(3)寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应*1.质粒寡聚体(plasmid oligomer)在野生型的大肠杆菌细胞中，质粒间的重组的结果会形成质粒寡聚体，而且事实表明含有大片段插入的质粒载体的寡聚化作用，是普遍存在的问题，它同样也是造成质粒载体不稳定性的原因之一。*2.决定含质粒寡聚体细胞比例的因素。决定在大肠杆菌培养物中，含有质粒寡聚体细胞比例的因素有两点：其一是质粒DNA分子间的重组频率；其二是含质粒寡聚体细胞的生长速率；*3.二聚体灾难(dimmer catastrophe)重组的质粒二聚体一旦形成，便会以高出质粒单体分子两倍的速率进行复制，从而导致出现质粒寡聚体的克隆增殖，即所谓的二聚体灾难。*4.质粒二聚体灾难的清除。由于大肠杆菌细胞中存在着某种目前我还不知道的机理，使含有二聚体的细胞生长速度下降，并最终使细胞群体中含质粒二聚体的细胞的比例达到平衡的状态。*5.寄主细胞类型对质粒稳定性的影响影响质粒重组的突变同样也会影响质粒的稳定性。例如在重组缺陷的(rec-)大肠杆菌寄主细胞中，pBR322和pUC，当其以单体形式存在时表现得最为稳定，而随着质粒寡聚体比例的逐渐上升，其稳定性也就相应地下降。图 寡聚体对pBR322稳定性的效应在寄主菌株rec下中，pBR322以单体形式存在，因此十分稳定，经过160世代之后含有pBR322的细胞仍为百分之百；而在sbcA菌株pBR322发生了广泛的寡聚化效应，经过80世代之后，含质粒的细胞便下降到16%左右。4随机分配的分子机理天然高拷贝数的质粒都相当稳定(此点与重组质粒载体明显不同)。这类高拷贝数天然质粒在细胞分裂过程中，都是随机分配的。维持随机分配的天然质粒稳定性的分子机理包括如下几个主要的方式：(1)控制环路机理通过精巧的控制环路使质粒拷贝数的差度限制在最低的水平，这是维持随机分配的天然质粒稳定性的一种有效方式(机理)。如前有关ColE1质粒复制控制所述：RNAI和RNAII是由ColE1同一区段序列之正反链编码的，因此两者序列可以互补；Rom蛋白质是由质粒rom基因编码的DNA复制阻遏物，它可使RNAI和RNAII结合得更加稳定。副反馈环路：RNAII又叫复制引物，它同质粒复制起点上游DNA结合成RNAII/DNA双链分子经RNaseH切割释放出3-OH作为合成DNA的引物 质粒开始复制RNAI可以同RNAII结合阻止其形成RNAII-DNA双链体分子，而Rom蛋白质又可促进并稳定这种结合作用，质粒停止复制。因此当细胞中质粒拷贝数下降到正常值以下时，RNAI水平下降，解离了与RNAII的结合，质粒开始复制RNAI和Rom上升抑制质粒复制。(2)位点特异重组机理通过位点特异的重组作用，消除天然质粒的寡聚体，也是维持随机分配的天然质粒稳定性的一种有效方式。在许多高拷贝数的质粒中，都已鉴定出了寡聚体解离位点cer，该位点的功能是参与位点特异的分子内重组，使质粒寡聚体转变成单体分子。在能够形成质粒寡聚体的大肠杆菌sbcA菌株中：a. 无cer位点的ColE1突变体(cer-)，经100世代无质粒细胞可高达40%；b. 具cer位点的ColE1质粒(cer+)，经100世代之后，则仍然保持稳定；图4-35 质粒寡聚体解离位点cer的功能作用由同源重组形成的ColE1质粒寡聚体，通过cer位点特异的分子内重组转变成单体质粒分子中的cer，是寡聚体解离位点cer的启动子指导Rcd转录本合成超量表达的Rcd会抑制寄主细胞分裂含寡聚体质粒的细胞中，cer转录活性加强Rcd过表达的结果抑制细胞分裂避免无质粒细胞产生质粒稳定(3)细胞分裂调节机理在cer位点中的启动子，会指导合成一种短小的Rcd转录本，当其超量表达时就会抑制大肠杆菌寄主细胞的分裂。在含有质粒寡聚体的细胞中，因转录活性加强而提高的Rcd转录本水平，会导致细胞分裂活动的阻断，从而避免了无质粒细胞的产生，维护了质粒的稳定性。(4)大肠杆菌素效应大肠杆菌素的合成会增进质粒的稳定性。许多天然高拷贝质粒都编码有大肠杆菌素或其类似的化合物。这类化合物释放到细胞周围之后，便会杀死无相应质粒的细胞，是在大肠杆菌自然群体中维持质粒稳定性的重要手段。5主动分配的分子机理(1)分配区的结构与功能仅由一个复制起点和选择记号构成的质粒是很不稳定的，因为要维持质粒载体的稳定性，还需要在质粒分子结构中存在一个编码主动分配体系的par区段。*1.par区段定义：par区段又叫做分配区(partition region)或分配座位(patition locus)，是指能够在细胞分配过程中直接影响质粒拷贝分配行为的特定的质粒DNA序列区