以动物细胞系统大量制造活性蛋白质.docx

第十一章 以动物细胞系统大量制造活性蛋白质 Preparation of Large-scale Active Proteins Using Animal Cell Culture System 吴 灿 辉 环球基因生物科技股份有限公司 研发生产部 经理 一, 前言 动物细胞培养技术很早即建立,初期常因微生物的污染受困扰,至1913年Carrel将外科无菌操作技术应用在动物细胞培养上,细胞始能长期培养而不受污染.1916年Rous及Jones利用胰蛋白(trypsin)由组织中分解细胞,发展出附著性细胞的次培养法(subculture).在19481952期间,mouse纤维母细胞(fibroblast)和HeLa两种细胞株先后被Earle与Gey等学者建立.1955年Eagle开发生化学配方培养液(chemical defined medium),使得细胞培养不必再依赖体液培养.配合分子生物与生物科技技术的进展,1975年Kohler和Milstein研发出融合瘤(hybridoma)技术,之后被广用於单株抗体的制备.80年代第一个由动物细胞制造的重组蛋白组织胞浆素原激活(tissue plasminogen activator; t-PA)由美国Genentech 公司以中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)正式生产. 在培养角瓶(T-flask)进行的小量细胞培养是确立一株新细胞或用以研究细胞形态及比较不同试剂对细胞生长与代谢之影响的最佳细胞培养方式.但是有愈来愈多的应用需要使用大量的动物细胞,例如:萃取细胞组成份(如109细胞可以提供 7 mg DNA);使用大量细胞培养病毒以制备疫苗(一般每批次使用5x1010细胞);以及许多医药用重组蛋白制剂之生产,如干扰素(interferon),红血球生成素(erythropoietin),胞浆素原激活,酵素,贺尔蒙,快速检验试剂与抗体,规模达到10,000 L之动物细胞培养在生物科技产业制造过程已被广泛使用.这方面的进展已由昂贵,花费人力提升至大规模的单元操作系统(unit process system).虽然单元操作系统可以节省成本且更有效果,但是将其使用於细胞培养放大生产仍需一系列的修改以克服一些大量生产的限制因子,例如氧气限制,剪力伤害(shear damage),养分的供给以及大量新陈代谢产物的生成与排除,在本章以下的内容将针对这些大量生产的限制因子提出讨论. 以动物细胞做为生产活性蛋白的一个重要考量点在於动物细胞合成的蛋白质可正确折叠(folding)形成四级结构且蛋白质释放出细胞之前会进行一系列转译后修饰作用158 (post-translational modification),其中最重要的是醣化作用(glycosylation),醣化作用对蛋白的生物活性表现以及在人体中代谢速率有极大影响性,所以现在表现医疗用活性蛋白常使用动物细胞为宿主.目前动物细胞可依其性质,形态及培养特质来分类,以其性质来分有初代细胞(primary cell),正常细胞(normal cell)及持续性细胞株(continuous cell line)三种.初代细胞是直接以胰蛋白将动物组织或器官加以分解而得;正常细胞是指具成对染色体,培养时须有培养表面供其附著,单层长满后即不再继续增生,可用胰蛋白让这些细胞脱离附著面进行继代培养,但无法永续地培养,有一定生长代数.相反地,细胞株则可持续地培养.生物蛋白制剂生产所使用的细胞依其形态则可分类为纤维状(fibroblast-like)及表皮状(epithelial-like)两种不同的细胞.若以培养时是否需要附著面,又可分为悬浮性(suspension)及附著性(adherent)两种细胞.悬浮式细胞培养是一种最易於放大生产培养的方式,因为1 L培养槽在概念上与1000 L培养槽是相似的,只是对於环境控制及维持细胞生长之正确生理环境需要较多的考量.附著性细胞培养因受到培养表面与氧气营养供给问题,较不容易以单一培养槽体放大培养生产,须有周边配备协助,但是近年来的一些改良设备已有突破性的进展,在本章后半段将会进一步探讨. 二, 影响大量细胞培养之参数 1. 培养容器与培养表面 最标准非抛弃式动物培养细胞容器是玻璃制品,在大量培养中则以不锈钢制品取代.细胞通常易於贴附於玻璃表面,如有需要可以先处理过玻璃以提高细胞贴壁效果.在悬浮式细胞培养,细胞通常不需要细胞贴壁,而且玻璃培养容器须以矽胶(silicone)处理培养表面,通常使用的有:Sigmacote (Sigma-Aldrich),Dow Corning 1107,dimethyldichlorosilane (Repelcote, Hopkins and Williams).表面处理后须以大量水冲洗乾净以防止溶剂残留.在较复杂的生物反应器中通常以不锈钢或矽胶管来连接不同的组成部分,矽胶管对於气体具有相当的通透性,同时有许多不同管壁厚度可供选择,不管使用不锈钢或矽胶管必须慎选合适的连接器(connector)以确保操作过程的无菌性. 气体过滤器(vent filter)对於气体进出生物反应器是必要的,即使连续式气体的供应并非必要,但一个过滤器出入口对於整个生物反应器压力的平衡及培养液进出仍是相当重要的,这个气体过滤器必须采用非湿性(non-wettable)且为绝对0.22 m孔径大小的产品. 2. 培养液与营养成分 一定成份的营养成分只能供应一定细胞的生长,各种细胞的来源不同,所喜好的营养成分也不相同,除了一些大部份细胞共同需要的成分之外,最好能针对所选用细胞研究其所特殊需求之添加物,组成最适合该细胞生长及生产成品的培养液.培养液与营养成分已被Ham与McKeehan (1),Litwin(2),Waymouth(3)等学者仔细探讨.细胞培养液对於大量细胞培养的功用主要在两方面,第一:维持一个适合的生理环境包括pH与渗透压;第二:提供大量细胞生长与制造产物所需之足够养分.早期的培养液是根据分析血浆或其他生物液体而调配出159 来,例如199(4).有另一种设计方式是降低培养液组成配方至最低而显示哪些成分是生长所必须,这种培养液称为极少培养液(minimal medium).经由这个方式,Eagle发明了MEM培养液(minimal essential medium)(5).经由四,五十年细胞培养制程的改良,MEM,199,DMEM (6),RPMI 1640 (7)与F12 (8)现已成为使用最广泛之细胞培养基础培养液,这些培养液在使用时通常会合并添加牛血清或其他非确定成分(non-defined)之培养液添加物.通常我们会根据以下的考量来选择或调配培养液,第一,依据所使用细胞株:由所使用细胞株以往一般培养所用之培养液开始著手研究;第二,细胞型态:一般而言转型细胞(transformed cell)与已建立的细胞株(established cell line)对血清的需要量较低;第三,培养液产品的便利性:需考虑所选用培养液或添加物之供应来源是否有两个以上供应厂商,同时尽量少采用稀有成分培养液;第四,细胞培养系统:不同细胞培养系统对培养液之需求不尽相同,应针对该培养系统选定合适培养液;第五,成本考量:使用无血清培养液或者在基础培养液中添加血清均应仔细评估其成本,此通常是选用何种培养液的主要考量点;第六,对培养液中化学成分之需求性:无血清培养液通常可以确定其化学组成,而培养液中添加血清则难以确定其化学组成,应依据大量细胞培养的目的以及品管检测分析能力选用培养液与添加物. 在各种细胞培养液成份中,葡萄糖是一项重要的限制因子(9),它通常被细胞分解利用再经由代谢而转换为能量供应细胞使用,葡萄糖在培养液之浓度范围5-30 mM.一般细胞培养产程初期并不添加太高量,在培养2-3天后才增加添加量会收到较好的效果.另外不同培养方式也会影响培养液中葡萄糖的使用浓度,通常均需依照所用之细胞特性额外添加.麸胺酸(glutamine)是培养液中另一个能量供应来源,同时作为核酸合成的前驱物(precursor).一般浓度范围0.7-6 mM,由於麸胺酸并不安定,常需额外再补充.此外培养液中胺基酸的成份对细胞生长也相当重要(10),通常胺基酸在不同培养液有一定成份配方,在大量培养细胞时会考虑针对收获培养液分析不同胺基酸之剩余量,加以个别添加. 在细胞培养液中通常都包含水溶性维生素(11),例如生物素(biotin),叶酸(folic acid),菸碱酸(nicotinamide),泛酸(pantothenic acid),硫胺酸(thiamine),哆醇(pyridoxine)与核黄素(riboflavin),这些水溶性维生素扮演酵素辅因子(cofactor)的角色.在199培养液中另外还添加维生素A,E等脂溶性维生素. 动物细胞生长一般而言也需要钠,钾,钙,镁,磷,氯,硫与重碳酸盐(bicarbonate)等无机离子与钴,铜,碘,铁,锰,锌,锡,镍等微量元素(12).无机离子对维持细胞生理功能有帮助,例如维持正常渗透压,膜电位与缓冲溶液效果,也可以促进细胞贴壁或做为辅因子的角色.细胞生长速率与产量与这些无机离子之比例有关,特别是钠/钾的比例(13),在大量培养细胞以制备蛋白质产品时须配合这方面的研究.一般培养液大多含有一些无机离子,但较少添加微量元素,动物血清是微量元素重要来源之一,而且血清会与这些微量元素结合使其成为无毒性且可被细胞利用,若使用无血清培养液须针对所采用细胞特性另外添加微量元素.动物血清同时也提供细胞生长,制造产物所需生长因子(growth factor),添加浓度范围在0.5-30%(v/v),通常血清来源为小牛血清(fetal calf serum;FCS),马血清等等.动物血清在160 细胞培养上有相当贡献,但是其本身有(1)每批产品成份不尽相同;(2)引起污染之来源(病毒,霉浆菌,噬菌体);(3)下游纯化困难度增加;(4)价格昂贵且产期不稳定等缺点,使得运用大量细胞培养以制造生物医疗制剂时,为符合制剂法规需求已逐渐少用动物血清. 有些研究指出可以添加一些生长因子,贺尔蒙於基础培养基液,可逐渐研发出合适的无血清培养液,最通常的添加方式为:胰岛素(5 mg/L);铁传递蛋白(transferrin) (5-35 mg/L);乙醇胺(ethanolamine) (20M);selenium (5g/L)(14). 在某些培养液成份包括脂质(lipid),例如F12,199培养液分别含有亚麻脂酸(linoleic acid)及胆固醇(cholesterol).一般培养液配合动物血清使用时,由血清可提供一些脂质.另外,针对特定细胞调制的无血清培养液也会添加一定浓度的脂质. 3. pH控制 在细胞培养初期最适宜的pH环境为pH 7.4左右,而整个培养期pH以不低於pH 7.0 较为理想,但是融合瘤细胞株(hybridoma)一般喜好pH 7.0或更酸的环境.若培养液pH低於pH 6.8常会抑制细胞生长.影响培养液中pH稳定性的因素有:(1)缓冲系统种类与能力;(2)培养槽上部空间(headspace)与(3)葡萄糖浓度. 在一般培养液最常见的缓冲系统是二氧化碳/重碳酸盐(CO2/HCO3-),这是一个弱缓冲溶液系统,其pKa为6.1远低於生理最适合值,同时需要在培养槽内培养液上部空间不断加入二氧化碳(5%10%)以防止二氧化碳损耗并增加氢氧离子(hydroxyl ions).当培养液含有平衡的盐溶液(balanced salt solution; BSS),其中的磷酸根会增加培养液的缓冲能力,培养液与5%二氧化碳平衡时通常会包含Earles BSS (25 mM重碳酸纳盐).另外也可以以zwitterionic buffer来改善培养液缓冲系统,例如使用HEPES,因为HEPES在pH 6.87.2有良好的缓冲能力,通常使用的浓度为10-25 mM,太高浓度对细胞会产生毒性. 在密闭的细胞培养槽内,培养槽内培养液上部空间对维持pH有其重要性.在培养初期,5%二氧化碳对於维持培养液稳定pH值非常重要,但是随著培养时程增加,细胞数目逐渐增多,细胞代谢之产物与呼出二氧化碳逐渐堆积於培养液中,二氧化碳也渐渐堆积充满於培养槽内部空间,阻止培养液内二氧化碳排放至培养槽内部空间,使得培养液pH下降. 细胞代谢葡萄糖使得丙酮酸与乳酸堆积於培养液,葡萄糖在培养液的浓度最好不要太高,一般建议在培养过程逐步添加而非一开始就使用高浓度葡萄糖.另一个替代方式是以果糖(fructose)或半乳糖(galactose)取代葡萄糖(15),可以有效降低乳酸产生,但是会使得细胞生长速度减慢.这个方法在小量细胞培养足够维持培养液pH值稳定. 在大量培养细胞时,产生二氧化碳,乳酸的量也大大增加,培养液pH值立刻会受到极大影响,各厂牌生物反应器(bioreactor)都会开发特别方法如一段时间由培养槽抽出旧的培养液,使用连续式更换培养液或使用pH控制系统.pH控制系统主要由一可高温高压灭菌的pH探针(probe)其一端与生物反应器培养槽内培养液接触,另一端则连接至生物反应器控制平台,当感应到培养液pH升高或降低时,控制平台会调控通入二氧化碳或加入一定量碱(重碳酸钠盐),可以将生物反应器内培养液pH控制在理想范围. 161 4. 氧气供应 大量细胞培养时如何足够供应氧气且不伤害细胞是一大课题.106细胞每小时需氧量大约6g,氧气只能以搅拌通气溶解於培养液(7.6g/mL),所以一般培养量2x106cells/mL会很快将氧气用光.细胞培养可以利用以下的一种方式或合并多种方式交换供应氧气: (a) 表面气体交换(surface aeration) 在密封培养角瓶的密闭培养系统中,重要的因子是存在於此系统中氧气的含量,这也意味是否对培养液面下3-6 mm处细胞是否可提供足够之氧气.一般而言,培养容器上部空间与培养液的比例为10:1以供应足够的氧气,所以在1L培养瓶中,应该有100 mL的培养液与900 mL的空气可以在培养开始阶段提供0.27克氧气,这些氧气大约可支持108细胞使用450小时.另一个关键在於这些氧气对细胞而言是否可利用 这牵涉到氧气由气相转换成进入液体的速率(16),由於氧气扩散进入培养液的速率并不快,所以真正培养液中所能溶解的氧气在1L培养瓶中最多只够培养5x107细胞.因此显示维持一个较大培养容器上部空间的重要性,否则在静态且密闭培养方式中,氧气供应会成为细胞生长的限制因子. (b) 通气(sparging) 这个方法是将气体打入培养液中使之产生气泡,是一种很有效的氧气传递方法.但是它的缺点是产生的气泡具有很高的表面能量,气泡破掉时会伤害与之接触的细胞,有一些方法可以避免这些伤害:第一,使用表面能量较低的大气泡;第二,降低气体流量;第三,使用消泡剂,如Pluronic F-68 (0.1%)等.在一些特定的生物反应器的通气系统中,有特殊的设计将产生的气泡与细胞以网子区隔开来,例如美国NBS公司cell lift impeller的设计,可以降低通气产生气泡对细胞的伤害. (c) 膜扩散(membrane diffusion) 矽胶管(silicone tubing)对气体具有通透性,可以利用这个性质将其安排围绕於培养槽体内壁,再通入氧气可提高培养液之溶氧.它的缺点是需要很长矽胶管的且价格昂贵,在放大生产时须加以评估. (d) 培养液灌流(perfusion) 利用密闭环状灌流系统由培养槽吸出培养液,通过一富含氧气的装置再回到培养槽,可以维持培养液一定的氧浓度.但必须要考虑的是要将培养细胞与吸出之培养液分开,因为在此培养槽外部装置中,培养液会与氧气激烈通气产生气泡,有时也会以碱(NaOH)来调整pH值,所以吸出培养液若含有细胞会受到极大伤害. 5. 温度控制 培养人类细胞或温血动物细胞最常使用的温度是37或稍低一些的温度,以防止温度过热产生的伤害.一般过热对细胞生长的伤害远大於温度不足,细胞通常对低温有耐受性,对於高温却极端敏感,38.539.5几个小时即会死亡,所以在大量细胞培养时须相当仔细调控温度.现在使用的生物反应器多能够较精细地控制温度,反而对於培养环境温度空调的控制也须注意,因为当培养环境温度偏高时(通常高於30以上)就会影响生物反应器循环水箱之162 降温功能以及培育箱维持37之能力.至於细胞生长至一定数目后进入生产期,在生产期常会调整温度(一般会调降温度)以增加产量或者让细胞培养期延长,该调整几度则需要依产品特性与使用细胞加以产程开发研究.较新式的生物反应器的培养槽通常会以双层制作,中间以循环水流控制培养恒温,即可於室温下操作生物反应器培养. 6. 搅拌(agitation) 搅拌速度会影响培养液溶解气体的快慢,也会影响新鲜培养液中营养成分进入到培养槽后之均匀分布速度,小的培养系统(1 L培养瓶)搅拌速度对细胞生长的影响较工业制程大培养槽(100 L以上)小很多.搅拌装置(称为搅拌器,impeller)的选择也非常重要,否则会对细胞产生剪力(shearing force)伤害,视悬浮细胞种类或是以微载体培养贴壁式细胞各有不同的搅拌棒可选择,在大量细胞培养槽常用的是船推进螺旋桨式搅拌器(marine blade impeller)以及交叉螺旋桨式搅拌器(pitched blade impeller),很多培养槽制造商均有特殊专利设计的搅拌器,以避免剪力对细胞产生伤害.一般小的培养系统搅拌速度较慢,大约在100 rpm以内即足够,越大的培养槽其搅拌速度也随之增加. 三, 细胞培养制程种类 细胞培养制程依照培养液供应方式可分为以下培养方式: 1. 批次 (batch) 培养 此为一般细胞培养的标准方式,细胞被培养於一定体积培养液中,随著细胞生长细胞数目逐步增加而养分渐渐减少,代谢产物则累积於培养液中.最后细胞生长限制於一定数目随即开始减少.随后陆续发展出一些批次培养修改方式(如外加养分式批次培养),经由逐步添加培养液与养分给予进而提高产量. 2. 外加养分式批次 (fed-batch) 培养 此为批次培养修改方式,一开始培养时并不将培养液一次加足,通常为一半体积,随著培养期的增加逐步加入新的培养液与其他营养成分,慢慢增加培养液体积至原先设定的量,经一段时期培养后一次回收细胞或培养液,如此可得到高密度培养及高产量. 3. 灌流 (perfusion) 培养 连续添加培养液至培养槽同时也吸出相同体积原有之培养液,使培养槽内培养液体积维持一定,同时培养液内养分也维持细胞生长所需范围以上,细胞代谢产物则不会堆积太多,因此灌流培养方式是一种较新且逐渐被采用的大量细胞培养方法.灌流可以是开放式由系统中完全清除更换培养液;也可以是密闭系统经由另一个培养液容器再循环回到原先之培养槽.此模式因为培养液吸出时不含有细胞,因此细胞的密度会逐步增加到相当高的密度. 4. 连续式 (continuous) 培养 连续式培养可提供一个完全稳定的培养环境,包括培养液营养成分,细胞代谢产物与培养槽内细胞数目等等.与灌流培养相似,连续式培养添加培养液至培养槽同时也吸出相同体积原有之培养液,但这些吸出培养液中含有细胞,所以这个方式只适合运用在悬浮细胞或微163 载体细胞培养.也有一种称为半连续式批次培养(semi-continuous batch)的方法,一定时间即更换定量的培养液,如此细胞数目,培养液营养成分即会维持在一定的范围之内. 5. 不同细胞培养制程种类之比较,各种培养方式在细胞数变化情形比较於图一. 3.灌流培养 细胞密度 4.半连续式批次培养 5.连续式培养 2.外加养分式批次培养 1.批次培养 培养时间 图一,不同细胞培养方式培养过程中细胞数变化情形 连续式培养是唯一可提供稳定细胞数目的培养方式,但对於以大量细胞培养来制造蛋白产物而言却不是最经济的方法,而且细胞数目也并非最多.量产时的成本考量包括员工的工时成本,培养液原物料的花费,生物反应器等相关设备的购置与下游蛋白纯化的成本,同时培养技术的复杂性和制程技术的了解也须考虑在内.由此看来,批次培养在人员成本与培养液的需求上较为昂贵.外加养分式批次培养仍需大的培养槽,在培养设备上亦相当昂贵,且整个培养期长达数月才将整槽培养液收获下来,过程中仍需冒相当风险.灌流培养是一种以较小培养槽达到高密度细胞培养的方式,培养期可以较长,且不需一次就准备如批次培养相当大量的培养液,灌流培养操作较为简便,因此所需的人员也相对较少,成本与操作压力会比较低,但须注意考量长期培养后细胞与蛋白成品在品管上的一致性问题.虽然很多种培养方式看起来较批次式培养来得成本低,但这些方法增加设备与产程的复杂性,同时也增加机械与电子故障的威胁,另外微生物在产程中的污染风险性也较高,所以并没有一定最好的培养方式,需要参考所使用细胞,制造何种产品,产品特性,下游蛋白纯化可能遇到的问题以及产品使用上所需遵循的法规问题来选定培养方式.一般灌流培养,连续式培养与批次培养在制造单株抗体之单元成本比例为1:2:3.5 (17). 四, 贴壁式细胞培养(adherent cell culture) 1. 贴壁式细胞培养简介 (a) 优点: (1) 容易将培养液完全更换,而且在加入新培养液之前可以PBS清洗细胞层,尤其是产程中需更换不同培养液时(例如由含血清之生长培养液更换成无血清生产培养液)更为方便. 164 (2) 许多细胞贴附於生长介质时会更有效表现标的产物. (3) 以灌流方式培养时因细胞均已贴附,所以不需要另外的过滤器以分离细胞与培养液. (4) 贴壁式细胞培养因为可以适用於所有细胞,所以较具弹性. (b) 缺点: (1) 较困难放大生产且成本较昂贵. (2) 培养需较大空间. (3) 细胞生长期间难以有效监控,因为贴壁式细胞培养较困难取样,也较难以细胞计数.所以常用其他之方法来评估细胞生长情况,例如培养液中葡萄糖消耗,乳酸生成或测定产物效价. (4) 较难达到系统均质化. 以上的部份缺点近来已被微载体培养所解决,我们随后会加以介绍. 2. 细胞贴壁(cell attachment) 贴壁式细胞培养最重要的起始步骤就是细胞贴壁,往往这个步骤决定随后细胞产程的成功与否也牵涉到产量与生产期长短等问题,这个过程包括静电引力(electrostatic attraction)与凡得瓦力(van der Waals force)等两种作用力的交互作用.动物细胞表面与一般培养表面如玻璃,塑胶等均带负电,所以细胞贴壁常需要一些醣蛋白或二价阳离子(钙,镁离子)在细胞膜与培养表面形成一连接层,在常见的例子中,醣蛋白与培养表面先形成2.5 nm厚度的界面以供细胞进行贴附.细胞贴壁的醣蛋白最常见的是纤维网蛋白(fibronectin),它的分子量很大,很多细胞都可以合成,在血清中含有此醣蛋白.可以在培养表面涂布(coating)一层纤维网蛋白,或将其添加於所使用培养液使用.也可以在培养表面涂布胶原蛋白(collagen)使其适於细胞贴壁,一些商品化的微载体就是将胶原蛋白涂布於表面,让细胞贴壁效果更好. 另一个影响细胞贴壁的重要因子是培养表面的净负电荷,玻璃培养容器经碱处理后在其培养表面即会带负电;细胞培养用的塑胶容器通常由sulphonated polystyrene构成,每nm2带有2-5负电荷.Alum-borosilicate玻璃(Pyrex)不会放出碱至培养液,是较合适的玻璃培养容器,在重覆使用多次后细胞贴附的效果会变差,可用1 mM醋酸镁处理即可恢复贴附效果. 3. 放大培养法方与各式生物反应器(bioreactor)基本介绍 当我们需要大量细胞来制造蛋白质产品时就必须以合适的生产方式来大量培养细胞,以降低生产成本并且避免污染发生.虽然一般印象认为贴壁式细胞使用在量产较为困难,但是贴壁式细胞仍有一些前述优点,所以经由这些年来科学家努力开发改良的结果使得多种针对贴壁式细胞使用的大量细胞培养容器及生物反应器被商品化,以下我们将做一简单介绍: (a) 旋转瓶(roller bottle) 细胞放大培养的原则是可使用培养面积最大化,使用的培养液体积与培养槽上部空间最小化,使得细胞数目与产品达到最适化.旋转瓶是一种直接增加培养面积的简易放大细胞培养制程,它的材料可为塑胶或玻璃,一般常用的以polystyrene塑胶,单一使用制品为主,最初使用到大量细胞培养制程是用以生产病毒疫苗.随著旋转瓶瓶身长度增加有不同165 培养面积(850-1,750 cm2)可供使用,使用的培养液需200-500 mL.将细胞植入后将旋转瓶置於旋转架以缓慢的转速(0.5-1 rpm)转动,使细胞连续都浸润於培养液,通常会把旋转架放入培养箱使培养环境温度维持於37,若有多台旋转架同时培养则可建立一间大的37恒温室以方便操作.虽然同一时间只有15-20%面积被培养液覆盖,但是旋转瓶内部培养面积几乎可被完全利用.这个方法降低培养液使用体积同时一定程度提升产量,相对就降低了部份成本,可是旋转瓶内部仍需要相当大空间以维持足够的氧气与pH恒定,营养成份逐渐消耗,代谢产物聚积并且无法提供气体,所以旋转瓶并不适合长期培养,另外更换培养液操作过程与准备原物料都相当耗费人力,也影响旋转瓶长期商品化量产使用.有国外生技公司修改传统旋转瓶加入自动化的控制,每个旋转瓶均有管线可自动吸出或灌入培养液,可节省人力;有些则是将旋转瓶身做成凹凸波浪状以增加培养面积. (b) 细胞工厂(cell factory) 这是由美国Nuc公司研发生产的产品,在一次操作中可因为培养面积增加而操作更多细胞.在一个培养容器中有多层相互平行的培养表面,每层的面积有600 m2,内部有管道相通使培养液可流至每一培养层.一般常用的细胞工厂是10层培养表面在一个单元,可提供6,000 m2培养面积,需要2 L培养液.一般而言,细胞工厂类似培养角瓶使用简便,将一个细胞工厂单元翻转90度后由培养液注入口将细胞植入并灌入足够培养液,因为有内部管线连通关系这些细胞与培养液会平均分配到每一培养层,再将单元放正稍加左右摇晃均匀,置於37培养箱培养.使用上的一个缺点是以胰蛋白使细胞剥落回收时不能百分之百回收细胞.若要增加操作细胞数量,也可以选用40层培养表面在一个单元的细胞工厂. (c) 细胞方体生物反应器(cell cube bioreactor) 这是由美国Corning Costar公司研发生产的生物反应器,该反应器将细胞培养於一培养方形盒,培养方形盒内部是由一片片的polystyrene平板以1mm互相平行排列组成.培养方形盒正反面各有一培养液进,出口,以矽胶管连接反应器各个组成部份,由培养方形盒出口充氧器(oxygenator)帮浦培养方形盒入口形成一密闭灌流循环系统.在充氧器玻璃容器中有pH及氧气探针可以侦测细胞生长状况同时提供氧气与培养液混合溶解的场所,溶氧提高后的培养液再被帮浦推送进入培养方形盒供细胞使用.最小的培养方形盒总培养面积为21,250 cm2,体积5 L,需要1.25 L培养液;需大量培养时可以选用两倍或四倍培养面积的培养方形盒,总培养面积分别为42,500 cm2,85,000 cm2.细胞方体生物反应器使用上的缺点是须将整个系统放置於37恒温室,操作人员在产程中须较常时间处於高温,且整个系统以silicone tubing连接各个组成部份,有相当多的接点必须一一以管束绑紧,否则会有因不耐压力而有泄漏或爆开的潜在危机. (d) 中空纤维束生物反应器(hollow fiber bioreactor) 一束束中空纤维提供细胞生长界面基质,类似血管构造使细胞生长於中空纤维表面,是中空纤维束生物反应器培养的主要原理(18).中空纤维管束膜具有孔洞为半通透性,当液166 体由管束中流过,液体中比孔洞小的成份会穿越中空纤维管束膜而出.中空纤维束生物反应器的设计是将许多中空纤维管束集合装入圆筒管柱中,在两端汇集成一培养液出入口,培养液可被帮浦打入而流进各个中空纤维管束,产生的净水压(hydrostatic pressure)促使培养液营养成分通过纤维管束膜,供应生长於纤维管束膜外的细胞养分,细胞代谢产物则会扩散进入纤维管束膜内,随培养液流出细胞所在的纤维管束.整个系统以矽胶管连接反应器各个组成部份如同上述细胞方体生物反应器,但不同的是此系统可独立於37培养箱操作,操作比细胞方体生物反应器简便.期操作的缺点是细胞种植时会较不均匀,培养液进入端细胞会较多,同时营养成分也会由培养液进入端至出口端形成一递减的梯度.放大产程时一个操作控制台通常一次可以控制很多支中空纤维束,可提供更多细胞与产物. (e) 陶瓷生物反应器(ceramic bioreactor; OptiCell) 陶瓷生物反应器(19)由美国Cellex Bioscience公司研发制造,主要培养细胞的部份是一个圆桶状陶瓷多管束单元,内部区隔出许多截面积大约为1 mm2的陶瓷管束贯穿其中,细胞就贴附生长於陶瓷管束内面,总培养面积约为0.4-12.5 m2.陶瓷多管束单元由silicone tubing连接反应器各个组成部份形成密闭灌流系统,培养液会流经一玻璃容器可侦测培养液状况(pH,氧气)与再溶氧,并在此更换加入新的培养液.此生物反应器提供大的培养面积与体积的比例(40:1),适合生产疫苗,细胞表面抗原或单株抗体(20).细胞植入时须分为四次进行,因为每一陶瓷管束四面均可提供细胞贴附生长.第一次植入四分之一细胞数,含有细胞之培养液以帮浦打入圆桶状陶瓷多管束单元,静置30分钟再进行第二次植入.第二次植入前先将陶瓷多管束单元转90度,再植入四分之一细胞数,静置30分钟再进行第三次植入,同样须先将陶瓷多管束单元转90度再接种,总计四次完成细胞植入程序.放大生产时将多个陶瓷多管束单元平行排列由单一控制平台操作,可增加培养面积至210 m2. (f) 微载体(microcarrier) 贴壁式细胞放大培养时常会碰到培养面积不足的问题,为了解决这个问题,1967年van Wezel (21)以表面带有电荷的葡聚醣小珠(dextran bead,Sephadex A-50) 微载体将贴壁式细胞培养在小珠表面,而每个葡聚醣小珠可视为悬浮式细胞而以悬浮方式培养.虽然van Wezel发明的微载体因表面所带的电荷不适合并没有真正商品化,但随后一系列的试验与改良使得现在有相当多的商品化微载体可供不同细胞或不同培养设备选择,表一列出现在较常使用的微载体. 一般使用的微载体是粉末状,方便秤量与操作,秤量完成后以PBS浸泡使其膨胀再灭菌使用.小量培养时常用的量为3-6 g/L;大量高密度培养可达15-25 g/L,但须增加环境控制与频繁更换培养液.微载体材质可为葡聚醣,塑胶,玻璃或胶原蛋白(collagen),有些表面带有电荷,有些表面涂布有胶原蛋白都是为了增加细胞的贴附性.其密度约为1.03-1.05 g/mL,直径在150-200m左右,在培养液中很容易形成悬浮分布.最常用的培养容器为玻璃旋转角瓶(spinner flask),中央轴心位置的下端连接一个搅拌磁棒做为均匀搅动培养液使用.玻璃旋转角瓶内部在使用前须以silicone或类似产品(如Sigmacote ,167 Sigma-Aldrich公司出品)涂抹,避免微载体与细胞贴在玻璃表面.常用的旋转角瓶为1001,000 mL,使用的工作体积为总体积的一半,以增加上部空间之通气.操作时须将旋转角瓶置电磁旋转平台,控制搅拌转速25-60 rpm (开始接种细胞时以低转速,随著细胞在微载体生长数目增加,微载体重量增加,须加快转速才能维持微载体均匀分布).在细胞种植时须注意细胞是否平均分布於微载体,最好每个微载体最少有3-5个细胞贴附.培养过程很容易可由旋转角瓶两侧取样,在显微镜下可直接观察细胞生长状况与满度,同时以胰蛋白将细胞由微载体表面剥离,细胞核染色,计数可得到细胞数目,较容易掌握细胞生长情况,这是一般贴壁式细胞培养方式所没有的优点.至於微载体放大培养与悬浮细胞培养相似,将培养容器由玻璃旋转角瓶逐步转换成搅拌式生物反应器(stirred bioreactor),在悬浮细胞培养部份会加以介绍.微载体培养已逐渐受到生技公司的重视与采用,由於其可达到非常高密度培养,已被使用在制造疫苗方面,是一种很有将来性的大量细胞培养方法. 表一,常用微载体之比较 型 式 商品名 出品公司 比重 直径 (m) 培养面积(cm2) 组 成 Cytodex-1 Pharmacia 1.03 160-230 6000 DEAE dextran Cytodex-2 Pharmacia 1.04 115-200 5500 DEAE dextran Microdex Dextran products 1.03 150 250 DEAE dextran Dextran Dormacell Pfeifer and Langen 1.05 140-240 7000 DEAE-dimers-dextran Biosilon Nunc 1.05 160-300 255 Polystyrene charged Cytosphere Lux 1.04 160-230 250 Polystyrene charged Plastic Bioplas Solohill Eng. 1.04 150-210 350 Polystyrene charged Cytodex-3 Pharmacia 1.04 130-210 4600 Collagen coated dextran Gelibeads Hazelton labs 1.04 115-235 3800 Gelatin Gelatin Biospheres Solohill Eng. 1.02 150-210 350 Collagen Bioglas Solohill Eng. 1.03 150-210 350 Glass coated plastic Glass Ventreglas Ventrex 1.03 90-210 300 Glass coated plastic Cellulose DE-52/53 Whatman 1.03 fibres 4000 DEAE - Cellulose (g) 充填床生物反应器(packed-bed bioreactor) 由非活性固体例如玻璃珠(3-5 mm)充填於管柱,使细胞可以贴附其表面生长,称为充填床生物反应器(22).培养液经由帮浦在密闭的回路中循环,在一特定的玻璃容器通以氧气使流经的培养液重新溶氧再回到充填床供应细胞生长使用.须注意的是使细胞植入时均匀168 分布於整个充填床.可以在玻璃珠表面涂布纤维网蛋白使细胞贴附更为迅速.充填床生物反应器已被使用到商业化生产动物用疫苗. (h) 吊篮式生物反应器(basket bioreactor; CelliGen plus) 这是美国NBS公司所推出的产品,培养动物细胞的机型为CelliGen plus.在反应槽内部充填一层纤维片(fibra-cel disc),细胞接种后循环至此即被捕捉陷入纤维片的网状交织架构中,贴附而后伸展并开始生长,由於细胞藏於网状交错结构之中,可减少剪力对细胞的伤害.细胞所制造的蛋白质产物会分泌到培养液,几乎没有细胞混於培养液,方便后续纯化作业.整套系统搭配该公司专利的低剪力通气搅拌装置(draft-tube basket impeller)可增加20%氧气传送.一般培养的转速为70120 rpm,循环路线由中央转动轴的小管(draft tube)进入向上,由中央转动轴三个出口(port)出来进入纤维片细胞层再回到转动轴的小管,形成一个气体与养分的供应路线.培养槽有pH,氧气探针随时侦测状况.培养液的更换可采用连续灌流方式,控制平台上有五个蠕动帮浦可用来注入新鲜培养液,吸出旧有培养液,滴入碱(重碳酸钠)来调控pH.四个气体:空气,氧气,二氧化碳,氮气与培养槽内培养液之pH形成相互调节的机制称为DO-pH模式,可稳定控制pH与氧气. 吊篮式生物反应器可由最小体积(总体积2.2 L,操作体积1.4 L;2.2/1.4L)开始进行培养产程开发,待培养步骤一一确定之后可逐步放大培养体积至所需的生物反应器规模.CelliGen plus系列生物反应器2.2/1.4 L,5/3.5 L,7.5/5 L与14/10 L培养槽由玻璃所构成,20 L以上培养槽由不锈钢所构成,最大培养槽可达130/100L.因为搭配灌流培养方式可使细胞达到高密度生长,所以即使100 L培养槽(非几千公升培养槽)也可以得到相当多产量.细胞培养於纤维片比微载体多增加十倍细胞,一般每立方公分纤维片充填体积可得到108细胞.纤维片是由polyester与polystyrene交织组成,在100 mL充填体积中可放入10g纤维片,提供12,000 cm2培养面积. 吊篮式生物反应器若将低剪力通气搅拌装置更换为气举式搅拌器(air lift impeller),可以在原培养槽进行微载体细胞培养. 五, 悬浮式细胞培养(suspension cell culture) 悬浮式细胞培养是一种较易於放大生产的细胞培养方式,它不像贴壁式细胞需一再考虑到培养界面的放大,材质问题以及细胞与界面贴附强度问题.在放大生产时只需考量增加生产培养槽至多大体积,以及阶段放大生产以逐步得到足够的接种细胞数,进行最终培养槽之培养.也因为悬浮式细胞在细胞大量培养上有其便利性,所以在产程开发阶段初期,常常会试著将贴壁式细胞驯化(adaptation)成为悬浮式细胞,以利后续的放大生产. 1. 驯化细胞成为悬浮式细胞 (a) 细胞选择 选择一个细胞族群中贴壁性较弱的细胞进行培养,长满的细胞用手轻拍或缓慢摇晃使培养液成漩涡状.将细胞培养液取出离心,收集沉淀下来的悬浮细胞,这个步骤须重覆多169 次以获得足够的接种细胞(最少2x105 cells/mL).经由这个方法挑选出的细胞有可能适於进行悬浮式细胞培养. (b) 驯化 另一种得到悬浮细胞的方式是利用驯化的方法,将贴壁式细胞在培养角瓶培养至80%满度时以胰蛋白将细胞由培养表面剥离,再以5x105 cells/mL的密集将细胞接种於250 mL旋转角瓶(spinner flask),使用的培养液体积为100 mL,搅拌速度为75-95 rpm.每天测定细胞数目建立悬浮细胞培养的生长曲线,当细胞数目增加至1x106 cells/mL则进行细胞次培养.一连三个继代均於次培养后三天细胞密度达到1x106 cells/mL其中有90%以上属於活细胞,这株细胞即被认定已驯化成功.完成驯化后细胞仍需要维持於旋转悬浮培养,因为静态培养往往使得细胞又逆转回复为贴壁式细胞. 2. 小规模培养 小规模悬浮细胞培养一般使用2 L以下玻璃旋转角瓶,它包括一位於中央位置的轴心,下端连接一个搅拌磁棒做为均匀搅动培养液使用.旋转角瓶通常在上瓶身处有两个出口称为手臂(arm),在培养过程中可由手臂位置取样分析.在培养进行中,旋转角瓶置於一电磁转盘上,藉由转盘的动力使搅拌磁棒依指定转速旋转,使整个旋转角瓶细胞及养分均匀分布.整个系统在37培养箱操作. 3. 放大培养 (a) 搅拌式生物反应器(stirred bioreactor) 前述小规模培养培养所使用玻璃旋转角瓶最大的规格为10 L,超过这个尺寸就相当困难操作与进行高温高压灭菌,同时也难以足够搅拌均匀.解决10 L以上放大生产问题可经由马达驱动搅拌器之搅拌式生物反应器来解决,数千升甚至上万公升的搅拌式培养槽已在各个国外生技公司成功生产成品.搅拌式生物反应器(B. Braun Inc.;Bioengineering Inc.) 有以下的改良:(1)采不锈钢圆底槽体,在低速搅拌时仍有良好混合效果,培养槽体内面以电抛光处理,必须完全光滑以降低机械性伤害,避免细菌微生物滋生与细胞贴附;(2)槽体最外层中空可注入温水以维持恒温;(3)采用合适搅拌器;(4)驱动马达设计於槽体上方,培养中细胞不会被卷入,也较无死角.搅拌式生物反应器培养须注意搅拌效果使细胞均匀分布於培养液之间,大量氧气能够转移溶解进入培养液并且不伤害细胞,一些细胞如Vero,HeLa与融合瘤细胞已成功使用在这个系统并制造生物制剂;(5)反应槽清洗,高温高压灭菌在操作现场进行(clean in place, CIP; sterile in place, SIP),使大的反应槽也能够确保无菌操作.美国Genentech公司使用CHO细胞以上万公升培养槽生产t-PA重组蛋白质以及治疗癌症之生技药品,由於最终需要相当庞大细胞以接种到12,000 L培养槽,所以起初须由20 L,200 L,2,500 L培养槽逐渐放大至12,000 L培养槽,整个产程费时3-4个月. (b) 气举式发酵槽(airlift fermentor)(23) 这个发酵槽是由内含一个小玻璃管的玻璃管柱