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高分辨溶解曲线分析技术LightScanner高分辨熔解曲线（High Resolution Melting, HRM）介绍一、HRM简介高分辨熔解曲线（High Resolution Melting, HRM）技术是近年来国际上兴起的一种最新的SNP及突变研究工具。该技术是2002 年由犹他大学和爱德华科技公司合作开发的应用于SNP 检测分析的一项新技术。这种检测方法因其操作简便、快速，使用成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。其商品化的仪器为LightScanner，LightScanner高分辨熔解曲线基因突变/基因分型检测系统是美国Idaho公司生产的专门用于快速基因突变扫描和基因分型的高通量检测系统，5分钟内可完成96/384个样品的突变检测，由于其具有灵敏度高、特异性好、高通量、快速、检测成本低等优势，目前已广泛应用于流行病学等大规模的未知突变/SNP和已知突变的genotyping工作。这种检测方法不受突变碱基位点与类型局限，在进行针对已知位点的基因分型工作时，无需序列特异性探针，只需要合成低成本的非标记探针或者直接使用小片段扩增的方案，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。二、HRM原理高分辨率熔解曲线分析（HRM）是通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况. 单核苷酸多态性（SNP）位点因不匹配会使双链DNA 在升温过程中先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。Lightscaner检测的样本是PCR产物，依据杂合异源双链的原理或者不同样品DNA双链的Tm值差异的原理。在PCR反应前加入LC Green饱和荧光染料（LC Green荧光染料只结合DNA双链，对PCR不会有任何抑制作用），然后将PCR产物（96/384孔板）直接放入LightScanner进行溶解，在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行变性，使DNA双链逐渐解链，此时LC Green荧光染料分子逐渐从DNA双链上脱落，96孔板中的每一个孔里的荧光信号均下降。（上图：杂合突变的个体PCR产物中会形成杂合异源双链）。图二 ：HRM高分辨率熔解曲线示意图。不同的基因型表现为不同的HRM熔解曲线形状如果某个个体是杂合突变，则在其PCR产物中会有杂合异源双链的存在，如上图，在杂合异源双链中有不配对的碱基对，因此该样品在温度逐渐升高的时候会首先发生解链，其荧光信号首先开始下降，而此时的纯合个体的样品由于解链温度较高，荧光信号没有下降或者下降的较慢，仪器的光学检测系统采集密集的荧光信号变化并绘制温度熔解曲线，根据曲线准确区分野生型、杂合突变、纯和突变，软件自动分型。如下图：图三：LightScanner一次扫描多个PCR产物，直接判定纯合突变并可以区分不同的SNP，温度熔解顺序为 A/A T/T C/C G/G三、HRM特点和应用1、LightScanner高分辨溶解曲线分析系统是理想的SNP分析手段 l 操作简便PCR反应前加入饱和LC Green Plus荧光染料，PCR产物直接分析，无需任何后处理 l 快速、高通量标准96/384孔板，5分钟完成整板样品（96/384）检测 20000个SNP/天 灵敏度高、特异性好l l 重复性好LightScanner重复性100% 成本低-l LightScanner检测SNP每个样品的成本为1RMB/样品 准确性、特异性、重复性好l l 全程闭管操作，避免污染 检测片段范围50bp1000bp，一般推荐400bp以内l 96孔板或者384孔板模式l 2、LightScanner高分辨溶解曲线法广泛应用于 样本中特定突变位点SNP（包括缺失、重复）的筛查，基因突变扫描l 遗传研究，特定突变的筛查、未知突变的发现l 肿瘤研究，尤其适用于体细胞样本中低突变比例DNA的突变检测l HLA基因组配型、等位基因频率分析l 物种鉴定、品种鉴定l 甲基化研究l l 法医学鉴定、亲子鉴定 动植物品质相关多态性位点的研究等。植物抗逆性，突变与性状关联性的研究。l l STR、SSR分析四、HRM与常规熔解曲线的区别HRM的概念早在上世纪70年代就已经提出并应用于相关的研究中。限于当时有限的实验条件，人们通过紫外吸收来绘制熔解曲线，当然这种方法在检测精度上相比现在的研究手段要大打折扣。随着仪器的改良和定量PCR技术的出现，人们开始用Sybr Green I荧光染料在在定量PCR仪上监测熔解曲线的变化，这也是现今使用最多的熔解曲线研究工具。然而限于分辨率的关系，Sybr Green I熔解曲线一般用于区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列，例如用于检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其它非特异性的扩增。如果要用Sybr Green I熔解曲线来区分SNP，目前看来是无法实现的，这与该类染料的特性相关。Sybr Green I这类染料属于非饱和性染料，由于染料对PCR的抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远低于将DNA双螺旋结构中的小沟饱和的浓度，由于使用浓度未达到饱和，加之染料本身的特性，在DNA双链解链的过程中，Sybr Green I分子发生重排，那些从已经解链的DNA片段上脱离下来的染料分子又与尚未解链的双链DNA结合，造成结果失真，无法真实反映DNA熔解的情况，影响了检测的分辨率。近几年来，人们发现/发明了一类新型的染料，称为饱和染料，如LC Green，LC Green Plus，SYTO 9和Eva Green。这类染料有着更强的DNA结合能力和很低的抑制作用，在DNA解链过程中不会发生重排，这使得用这些染料的熔解曲线有了更高的分辨率。在仪器精密度提高的基础上，配合这类饱和染料就出现了我们现在所说的高分辨率熔解曲线，即HRM。这样人们便可以利用熔解曲线分析这种极其简单的实验手段来对SNP和突变进行研究了。五、LightScanner高分辨溶解曲线应用1、应用一：未知SNP扫描（Mutation Discovery）LightScanner直接检测PCR产物可以发现序列中是否有未知的SNP图一：设计引物，扩增目的片段（一般为100400bp大小），在PCR之前掺入LC Green荧光染料（图一左），针对扩增的目的片段进行HRM分析，可找出新的未知SNP（图一右）。2、应用二：已知SNP位点基因分型（Genotyping）方法一; Small Amplicon法进行已知SNP位点基因分型图二：针对已知SNP位点设计小片段（一般片段大小50100bp），PCR前掺入LC Green荧光染料，对PCR产物进行HRM检测，采用Small Amplicon分析，可以给出该SNP位点的3种基因型。方法二：Luna Probe（非标记探针）法进行已知SNP位点基因分型图三：针对已知SNP位点设计2035bp Luna Probe（非标记探针，与普通引物价格相当），PCR前掺入LC Green荧光染料，针对PCR产物进行HRM检测，采用Luna Probe分析，可以给出该SNP位点的3种基因型。参考文献：GUNDRY C N，VANDERSTEEN J G，REED G H，et al.Amplicon melting analysis with labeled primers：a closed-tube method for differentiating homozygotes and heterozygotes.Clin Chem，2003，49：396-406.SLINGER R，BELLFOY D， DESJARDINS M，et al. Highresolution melting assay for the detection of gyrA mutations causing quinolone resistance in Salmonella enteric serovars Typhi and Paratyphi. Diagn Microbiol Infect Dis，2007，57：455-458.LIPSKY R H，MAZZANTI C M，RUDOLPH J G，et al. DNA melting analysis for detection of single nucleotide polymorphisms. Clin Chem，2001，47：635-644.WITTWER C T，REED G H，GUNDRT C N，et al. Highresolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen. Clin Chem，2003，49：853-860.LIEW M，PRYOR R，PALAIS R，et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin Chem，2004，50：1156-1164.ERALI M, VOELKERDING K V, WITTWER C T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Exp Mol Pathol. 2008 August; 85(1): 5058. ZHOU L，WANG L，PALAIS R，et al. High-resolution DNA melting analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution. Clin Chem，2005，51：1770-1777. $ghtScanner高分辨溶解曲线分析方法介绍ver2.doc 小片段法.pdf 用探针法进行基因分型的方法.doc 2010.Allele-specific extension allow base-pair neutral.pdf 2010.Application of high-resolution DNA melting for genotyping and variant scanning of diploid and autotetraploid potato.pdf 2010.Rapid diagnosis of spinal muscular atrophy using high-resolution melting analysis.pdf Rapid detection of.pdf YE 001.pdf YE 002.pdf 2008 Mader BMC Gen 67.pdf 2009.Mutation scanning and.pdf 2009.High-resolution melting analysis of cDNA-derived PCR amplicons for rapid and cost-eVective identiWcation of novel alleles in barley.pdf An interspeciWc linkage map of SSR and intronic polymorphism.pdf HRM(高分辨率熔解)及其在植物DNA变异检测中的应用-甘四明老师.pdf High Resolution Melting Applications for Clinical Laboratory.pdf 2007.Unlabeled oligonucleotides as internal temperature controls for genotyping by amplicon melting.pdf 2008 Hung Clin Biochem 70.pdf A approach for the ealuation of the human papillomavirus type 16 variability with high resolution melting analysis.pdf 2009.Determining the effectiveness.pdf 2009.Diagnostic guidelines for.pdf 2008.Chinese Medical Genetic.pdf 高分辨率熔解曲线在地中海贫血检测中的应用展望.pdf 2005.Rapid species identification.pdf 2008.Rapid Differentiation of.pdf首先要区分一下HRM和荧光定量，这两个实验对数据的采集点完全不同，HRM实验对数据采集点的要求是100个数据点/s，而荧光定量只需要4-10个数据点/s。HRM