小鼠过氧化氢酶的制备与测定(10口腔).doc

小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 学院：口腔医学院 班级：10级口腔本科 指导老师：刘昆 实验人员：师艳伟 10011040015 李东 10011040021 代鑫鹏 10011040024 邢栋 10011040022 一、实验背景资料1. 实验背景资料过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。小鼠肝脏过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水，几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。2. 实验方案3. 实验目的熟悉并掌握生化四大技术离心、层析、比色、电泳。熟悉并掌握分离纯化小鼠过氧化氢酶和测定其含量的技术和方法。4. 实验原理匀浆原理： 分离纯化某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性，所以要根据所提取蛋白质的性质采用适当的方法将组织和细胞破碎。过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中溶解度很小，而脂质在有机溶剂中溶解度较大,通过加入有机溶剂可实现过氧化氢酶与脂质的分离。过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中稳定性好，不易变性，而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差，容易变性。根据上述原理选择0.05mol/L，pH4.0醋酸-乙醇缓冲液以及氯仿作为匀浆缓冲液，通过匀浆法破碎肝组织细胞，匀浆液离心后脂质分配到有机相中，部分杂蛋白则沉淀下来，而过氧化氢酶主要存在于上清液中，分离出上清液即获得过氧化氢酶的粗提液。盐析原理： 蛋白质在高浓度盐溶液中由于水化膜被破坏而溶解度降低。通过向过氧化氢酶粗提液中加入适当浓度的中性盐,使过氧化氢酶呈盐析状态,而部分杂蛋白呈盐溶状态，离心后过氧化氢酶主要存在于沉淀中，弃去上清收集沉淀，即可实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。透析原理： 采用20%乙醇、0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液、0.1mol/L NaCl溶液为透析液，对产物进行透析处理。在该透析条件下，过氧化氢酶溶解度变小，以沉淀形式析出，但不变性。透析过夜后离心，过氧化氢酶主要存在于沉淀中，但沉淀中也可能含有少量变性的杂蛋白。选择0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液复溶沉淀，则过氧化氢酶溶解，而变性的杂蛋白不能溶解，从而实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。层析原理： 凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，各种物质分子扩散移动速度不同使混合物中各种物质得到分离的技术。采用sephadexG-200葡聚糖凝胶层析柱可以实现过氧化氢酶与其他分子量杂蛋白的分离，通过监测洗脱液在407nm（过氧化氢酶特征性吸收波长）和280nm波长下的光吸收值变化，合并收集OD407nm和OD280nm重叠峰值管，即可获得纯化后的过氧化氢酶。Lowry法原理： 蛋白质中的酪氨酸等与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。福林酚法测定蛋白质可分为两个步骤：1.在碱性溶液中，蛋白质与铜离子发生反应：2.Cu-蛋白质使试剂中的磷钨酸-磷钼酸还原成为蓝色化合物，测定光吸收值就可以推算出蛋白质的含量。试剂中的碳酸钠有缓冲作用，使溶液的pH保持在10左右，显色最深。福林-酚法灵敏度高、蛋白质浓度测定范围是25250g/ml。但此法实际上是蛋白质中酪氨酸和色氨酸等与试剂的反应，因此它受蛋白质氨基酸组成的影响，即不同蛋白质中氨基酸组成的不同会使显色强度有所差别；此外，样品中酚类及柠檬酸的干扰会使结果偏高。低浓度的尿素（约0.5%左右）、胍（0.5%左右）、硫酸钠（1%）、硝酸钠（1%）、三氯醋酸（0.5%）、乙醇（5%）、丙酮（0.5%）对显色无影响，上述物质浓度高时必须做校正曲线。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理： SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法是在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠，则蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于它的相对分子质量（Mr），而与所带电荷和形状无关。在一定条件下，蛋白质的相对分子量（Mr）与电泳迁移率间的关系，可用下式表示： 式中：Mr为蛋白质的相对分子量；k，k1为常数，b为斜率；m为迁移率。因此，要测定某个蛋白质的Mr，只需比较它和一系列已知Mr的蛋白质在SDS-凝胶电泳时的迁移率就可以了。过氧化氢酶米氏常数测定原理： 在酸性环境中（硫酸）紫红色滴定终点为微红色，记录滴定用的ml数，取平均值，计算H2O2准确的摩尔浓度。求出反应前后H2O2的浓度差及反应的速度（v）。以为横坐标，为纵坐标作图可求出H2O2酶的Km值。 二、实验操作（一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液【器材】1、动物：成年小鼠2、器材：手套、镊子，剪刀，肾盘，冰袋，电子天平，托盘天平，组织捣碎机，10mL匀浆管，冰浴盒，吸量管，滴管，10ml、50mL量筒，100mL烧杯，50mL锥形瓶，玻璃棒，离心管，离心机，制冰机，4冰箱，纱布，滤纸 3、试剂：0.05mol/L醋酸-乙醇（23.5）缓冲液，pH4.0；氯仿【方法】1、颈椎脱臼法处死小鼠（6只），取肝脏（按6g计算，不称重）；2、加入肝重8.5倍体积（51ml）的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L, pH4.0醋酸缓冲液,23.5乙醇，），用组织捣碎机匀浆1-3min（三组合并一块匀浆，快慢交替使用）。【留样】不离心，取200ul匀浆液留样，放-20oC保存。3、冰浴下缓慢滴加肝重0.5倍体积（3ml）的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆30s-1min；匀浆液离心，4，7500rpm，30min后，弃沉淀，收获上清液约44ml于100ml锥形瓶中。4、取匀浆后上清液120uL，加入40 uL 4电泳上样Buffer，沸水浴3-5分钟，备用于SDS-PAGE检测，-20冰箱保存。【留样】另取200 uL匀浆后上清液-20冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。（二）盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶【器材】1、100mL锥形瓶，冰浴盒，制冰机，JT-1型定时电磁搅拌器，离心管，托盘天平，离心机，透析袋（截留量10KD-20KD，直径2公分），滴管，50mL量筒，5mL吸量管2、试剂：0.5mol/LNa2SO4；0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液；透析液（20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L NaCl），50%甘油。【方法】1、冰浴搅拌状态下，向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰浴搅拌1h（用玻璃棒手动搅拌）；2、将盐析溶液离心（40C，7500rpm，10min）后弃去上清，保留沉淀；3、用肝重4倍体积（24ml）的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助溶）15min ，离心（40C 5000rpm , 10min）后，弃去沉淀，保留上清液；4、【留样】取盐析后上清样品120ul，用40 uL 4电泳上样Buffer制样，煮3-5min，备用于SDS-PAGE检测，-20冰箱保存。5、将透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用（不要捞出来）；6、将上清液放入透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）内（注意封口要结实），置于透析液（20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L NaCl溶液，上清液的10倍体积）中透析两周，中途更换一次透析液（让学生自带水溶VC瓶）；7、两周后，取出透析袋内混浊溶液，离心（40C，7500rpm，10min）后，弃去上清，收集沉淀；8、用2mL3mL的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器助溶）， 离心（40C，4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液。9、【留样】取上清样品120ul，用40 uL 4电泳上样Buffer制样，沸水浴3-5分钟，备用于SDS-PAGE检测。放置-20冰箱保存。10、将透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用；11、将收获的样品液（三组样品合并为一组）放入处理后的透析袋中，置于75%的甘油中包埋浓缩2小时，待样品浓缩至11.2ml收样，放置-20冰箱保存。（三）凝胶层析法进一步纯化纯化过氧化氢酶【器材】1、玻璃层析柱（直径1.8cm长45cm）、细乳胶管、夹子、玻璃棉或棉花、细玻璃棒、收集管（试管）、试管架、紫外可见分光光度计（型号-9100）、锥形瓶、吸量管、滴管。2、试剂：sephadexG-200，0.1mol/L pH7.8磷酸盐缓冲液【方法】1、凝胶的处理：每组取2.5g sephadexG-200葡聚糖凝胶干粉（膨胀体积3040mL/每克干胶），浸泡于蒸馏水中充分溶胀，倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，替换等体积磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH7.8) 继续浸泡一天 （准备室操作）。2、装柱：取层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填入一薄层玻璃棉或海绵垫，越薄越好。将层析柱垂直夹于铁架上，层析柱下端的止水夹夹紧，向柱中加入约 5-7cm 高的缓冲液，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。当凝胶颗粒沉积约2cm高时，开启止水夹子，使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高度达35cm（柱床体积约60ml）时为止。关闭止水夹子，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡或断纹，表面要平整。如凝胶床表面不平整，可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自然下沉，即可使表面平整。凝胶床表面要保留10cm高的缓冲液。3、平衡：打开层析柱出口，控制流速为0.30.5mL/min (约5-10滴/min，不要超速)，用磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)流洗平衡20min。凝胶管柱上端平衡液应始终不少于10cm高度，不得出现干胶和断层，并应保持凝胶面平整。4、浓缩样品 【前次实验内容中已操作】5、加样：打开层析柱出口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面平齐时，关上出口。用吸管吸取待分离的浓缩后样品溶液1-1.2ml，在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。打开层析柱出口，使样品溶液进入柱床（开始收集）。待样品液恰好完全进入凝胶柱上端面内时，立即用滴管沿层析柱内壁加入少量磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)小心冲洗壁管上的蛋白质，然后再加入磷酸盐缓冲液至距凝胶床表面约4cm高。6、洗脱：洗脱过程中不断补加磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)，保持0.30.5mL/min（约5-10滴/min）的流速。洗脱速度不可过快，以防样品带扩散。7、收集及检测：样品进胶开始，用试管收集流出液，每管收集1mL（约20滴）。收集管依次在407nm和280nm波长下，以空气调零，测定各管吸光度值。以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。8、收获纯化产物：合并收集OD407nm和OD280 nm重叠峰值管，再次测定OD407nm和OD280 nm波长下的吸收值即为最终纯化得到的产物（此次测定以缓冲液调零）。9、【留样】取2mL纯化产物存样，备用于蛋白浓度及Km值测定，放置-20冰箱保存。10、【留样】取层析纯化样品60uL（浓不浓缩视情况而定），用20 uL 4电泳上样Buffer制样，沸水浴3-5min，备用于SDS-PAGE检测，放置-20冰箱保存。【实验结果】（四）Lowry法测定纯化的过氧化物酶浓度【方法】1234567（匀浆）8（层析）标准蛋白溶液（0.1mg/ml）00.20.40.60.81.020ul200ul生理盐水（ml）1.00.80.60.40.201ml800ul试剂AB(9:1)11111111混匀后置于50水浴10分钟，冷却试剂C(ml)3.03.03.03.03.03.03.03.0立即混匀，置于50水浴保温20分钟，冷却后在650nm比色吸光度值00.0190.1230.1850.2490.3610.0130.174【备注】：1.待测样品：层析后的纯化样品（2l+PBS4ml）。 2.样品稀释倍数：需预作后确定，根据层析后样品在280nm下的吸光值（应大于0.2以上）。 3.标准蛋白：为浓度0.2mg/ml的牛血清白蛋白溶液，按操作绘制相应标准曲线用于样品浓度（匀浆产物约稀释50倍，层析产物稀释5倍）测定。【实验结果】标准蛋白匀浆层析试管空白23456OD值00.0190.1230.1850.2490.3610.0130.174蛋白浓度（mg/ml）00.020.040.060.080.100.0170.057 蛋白质标准曲线 （五）双倒作图法测定纯化的过氧化氢酶米氏常数【方法】1.过氧化氢的浓度的再标定：取洁净的锥形瓶2只，各加0.04mol/L的过氧化氢溶液2.0ml和25%硫酸2.0ml。分别用0.002mol/L高锰酸钾滴定至微红，记录滴定毫升数，取平均值，在计算过氧化氢的摩尔浓度。2.样品的稀释：去层析后的过氧化氢酶2ul，用PBS4ml稀释2000倍。反应测速：去干燥的50ml锥形瓶5只，编号后按下表操作：所加试剂（ml）12345过氧化氢溶液2.502.001.501.000.05蒸馏水00.051.001.502.001：2000稀释样品0.050.050.050.050.05要求：试剂加入准确而迅速，立即摇匀，记录室温。蒸馏水的作用是配平各锥形瓶中物质的体积。终止反应：过氧化氢酶加入后立即计时10分钟，到时立即加入25%硫酸2.0ml,边加边摇匀，终止酶促反应。3.滴定：用标准0.002mol/L高锰酸钾滴定，记录各瓶消耗高锰酸钾的ml数。4.计算5.列表项目12345加入H2O2数2.521.510.5KMnO4的用量14.311.37.94.62.1加入H2O2的mmol数0.040.10.080.060.040.02剩余H2O2的mmol数0.0022.50.07150.05650.03950.0230.0105反应速度0.02850.02350.02050.0170.0095反应底物浓度s30.0330.0270.020.0130.0071/V=135.08842.55348.78058.824105.2631/s=13037.55075150【备注】1、待测样品：层析后的纯化样品。2、样品稀释倍数：将样品稀释（匀浆产物稀释5倍、层析产物稀释3000-3500倍），按操作流程用量进行酶活、Km值测定。 （六）SDS-PAGE法测定纯化的过氧化物酶分子量【方法】 1.凝胶的制备：SDS-凝胶电泳可采用柱型，也可采用板型，本次以板型连续系统做实验。SDS-连续系统板状凝胶的制备步骤 （1）装板：将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出，将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放在水平台面上，准备灌注胶液。 凝胶模子由3部分组成：一个压制成“U”形的硅橡胶带；两块长短不等的玻璃片；样品模版片。胶带的内侧有两条凹槽，可将两块相应大小的玻璃片嵌入槽内。玻璃片之间形成一个23mm厚的间隙，将来制胶时，将胶灌入其中。灌胶前，先将玻璃片洗净、晾干、嵌入胶带凹槽中。将玻璃片嵌入凹槽时，长玻璃片下沿与胶带框底之间保持23mm距离，以使此端的凝胶与一端的电极槽相通;而短玻璃的下沿则插入橡胶框的底槽内。由此便形成一个“夹芯”凝胶腔。把上述装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽（白金丝在上方的“半槽”），合上电极下槽（白金丝在下方的另一“半槽”），用四条长螺丝将两个半槽固定在一起。在上螺丝时，要按照一定的顺序逐个拧紧，均匀用力，不能用力过猛或先拧紧一个后再拧另一个，这样电泳槽受力不均，会使玻璃板压碎，电泳槽弄坏造成漏胶、渗液等现象。 （2）配胶：按照下表所列的试剂用量配制某一合适的凝胶。加样顺序试剂名称凝胶浓度%20ml凝胶液混合比ml57101215123430%凝胶储备液0.4molL，pH7.2磷酸盐缓冲液（含0.2%SDS）1%TEMED蒸馏水3.33529.574.67528.236.67526.238.0524.9010.0522.90以上各液加入后混匀，为了除去抑制凝胶聚合的氧，AP加入之前，进行抽气处理。本实验将此步骤省略，并不影响实验结果。510%过硫酸铵（AP）0.10.10.10.10.1 （3）凝胶液的灌注和聚合：灌注凝胶液前先用滴管吸取少量的用电极缓冲液配制的1%琼脂糖溶液，灌入凝胶模版底部（长玻璃板外侧，下沿凹形小槽内），其液面高度约0.51.0cm待琼脂糖凝固后，既堵住凝胶模下面的窄缝（通电时又可作为盐桥）。将所配制的凝胶液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓倒入或用滴管滴入，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿0.5cm处为止。然后把梳形样品槽模板插入胶液顶部。插入样品槽模版的目的是使胶液聚合后，在凝胶顶部形成数个相互隔开的凹槽。电泳前将样品液加在凹槽中。为了使胶聚合好，可在玻璃板两侧放入一定体积的水，但不要超过短的一块玻璃片。预电泳（又称分离胶的预电泳，此步根据实验的需要决定取舍）：凝胶聚合程度一般在90%以上。残留的物质，尤其是过硫酸铵，对某些样品（加酶）会造成钝化或引起其他人为效应。因此，有时需要在正式电泳前，先用电泳方法除去这些残留物，这步称为“预电泳”。预电泳的步骤是:在连续系统中，注入电极缓冲液（上槽没过胶面）。打开直流稳压电源（负极接上槽，正极接下槽）开始预电泳，用30mA、30min2h。若是不连续系统，预电泳不能在制好浓缩胶后进行，也不能用电极缓冲液进行，不然会破坏不连续系统，使浓缩胶失效。2.蛋白质样品的处理：一般是将蛋白质溶解在蛋白质样品溶解液中，在100加热25分钟。蛋白质的最后浓度一般为0.051mgml。也可将上述溶液在37保温2小时，而不是100加热。一般来说，两种处理效果都一样，但如蛋白质样品中混有少量蛋白质水解酶，37处理就会引起样品水解，使测定失败，而100加热3分钟一般都能使蛋白酶失活，得到满意的结果。也有少数例外的情况，需采用特殊的样品处理方法。 （1）标准蛋白样品的制备：称取标准蛋白质样品各1mg左右，分别放入带塞的小试管中，按1，01.5mgml溶液比例，向样品加入“样品溶解液”。待样品充分溶解后轻轻盖上盖（不要太紧，以免加热时迸出）在100的沸水浴中保温3min，取出，冷却至室温。 （2）待测蛋白质样品的制备：若待测蛋白质样品是固体，则与标准蛋白质样品相同，如待测样品已在溶液中，可先配制“浓度大的样品溶解液”，将待测样品与“浓度大的样品溶解液”等体积混匀，然后同上加热。若待测样品浓度太稀可事先浓缩，若盐浓度太高则需先行透析，再进行上述处理。处理好的样品溶液即可用于电泳，也可在冰箱中保存较长时间，使用前在100水浴中加热1分钟，以除去可能出现的亚稳态聚合物。3.加样（若采用预电泳，预电泳后加样）SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法：在垂直板型电泳装置的两个“半槽”，即电极上槽和下槽内，分别加电极缓冲液，电极上槽，即白金丝在上方的“半槽”内加的缓冲液必须高于白金丝。用微量注射器依次在各个样品槽内加样，各加1015l（含蛋白质1015g），稀溶液可加2030l（还要根据凝胶厚度及蛋白质浓度灵活掌握）。4.电泳：上槽接负极，下槽接正极打开直流电源（仔细观察正负极的变化）。对于垂直板型电泳，一般是，样品进胶前电流控制在1520mA，大约1520min；样品进胶后，将电流调至4050mA，保持电流强度不变，待指示染料溴酚蓝（BPB）迁移至下沿约11.5cm处，停止电泳，需56h。5.剥胶和固定垂直板型电泳的剥胶和固定：电泳结束后，取下凝胶模，卸下凝胶模上的橡胶框，用镊子将短板玻璃撬开后，取出凝胶板。在溴酚蓝区带的中心做好标志（插入细金属丝），用水慢慢冲洗一下胶面，将胶置于培养皿内，放入固定液（或10%WV三氯乙酸），没过凝胶板，固定2h以上或过夜。6.染色和脱色考马斯亮蓝染色法：考马斯亮蓝是一类特异与蛋白质结合的蓝色色素。首先将凝胶浸入考马斯亮蓝中，整个凝胶着色，接着进行脱色，胶中被固定并染色的蛋白质不被脱色，而不含蛋白质的凝胶部分则全部脱色，结果出现蛋白质区带。考马斯亮蓝有R-250和G-250两种，考虑凝胶染色的检出灵敏度，一般常用R-250。具体操作如下：将凝胶浸入染色液0.1%考马斯亮蓝R-250（CBBR250）,40%甲醇（或乙醇）和10%冰醋酸中，染色0.51h，弃去染色液。加入脱色液10%甲醇（或乙醇）和10%冰醋酸，脱色13h，期间更换23次脱色液，然后将胶浸泡脱色液中过夜，至背景透明清楚为止。 染色液中的甲醇和冰醋酸，在染色过程中，还起固定蛋白质的作用。此法的检测灵敏度为0.21g，虽然不如银染色法的灵敏度高，但是操作简便，背景干净清楚，显色带的颜色深浅一般与蛋白质的量成正比，可用于蛋白质的定量测定。7.胶板的干燥保存 如欲久存凝胶板，待凝胶脱色至背景清晰时，可继续留置于脱色液中3小时以上。用2张比电泳玻璃板大一倍的玻璃纸，在保存液中操作，先铺一张玻璃纸在玻璃板上，然后轻轻放上凝胶板，再在胶板上覆盖另一张玻璃纸，将玻璃纸外缘剩余部分向下，放置过夜，即可得到透明平整的干胶板。数据处理：蛋白质分子分子量的求算：由于蛋白质在凝胶中的迁移率只由分子的大小和与之成正比的电荷来决定，蛋白质因分子量的不同而被分离，分子量的对数与其相对迁移率呈良好的线性关系，把待测分子量的蛋白质与已知分子量的蛋白质的迁移率进行比较可获得分子量。具体操作如下：1）待测分子量蛋白质与另一系列已知分子量的蛋白质在同一条件，同一凝胶中进行电泳分离，得到取代清晰的电泳图谱后先从分离胶上端为起点测量各蛋白质的迁移距离以及指示染料溴酚蓝的迁移距离。然后计算出各蛋白质的相对迁移率： 相对迁移率=样品迁移距离溴酚蓝的迁移距离2）以标准蛋白的对数为纵坐标，相对迁移率为横坐标作图，得到标准曲线（如图6-19,20）。3）用待测蛋白质的相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。将标准曲线向纵轴（log分子量）延伸可得Y轴截距，即相对涌动为零的分子量值。饭分子量大于此值的蛋白质，在此电泳条件下都不能进入分离胶分离。蛋白质分子如由一条肽链组成，测得的值为蛋白质的分子量，如由多条肽链组成，测量的值为亚基的大小，为了准确起见，至少用两种以上的方法测定同种蛋白质的分子量。8蛋白质的定量 根据凝胶中蛋白质区带的染色深浅，进行蛋白质定量可用下面方法进行。根据区带的透光率进行定量:用一系列已知浓度的蛋白质做标准，在与待测样品同样的条件下电泳，染色，脱色后，用光密度计对蛋白质区带扫描，测定其透光率。用蛋白质的量对透光率作图可得一直线，即定量标准曲线。用待测样品的透光率在标准曲线上即可查出相应的蛋白质含量。所选用的标准蛋白质应尽量与待测蛋白质分子量接近。【备注】1、待测样品：匀浆后样品、盐析后样品、透析后样品、层析后最终样品。2、样品上样量：采用4电泳上样Buffer，各样品均上样20-30ul。标准蛋白Marker上样10ul。 SDS-PAGE图譜 MK 层析 透析 盐析 匀浆 MK Maker分子量（KD）94.066.245.033.026.0 20.0 14.4Lg分子量4.974.824.654.524.414.304.16迁移距离（cm）2.652.803.453.704.004.504.90相对迁移率0.450.480.590.630.680.770.84 层析后过氧化氢酶：迁移距离 3.05cm 分子量 238.05KD 相对迁移率 0.52 三、实验结果小鼠肝脏过氧化氢酶分离纯化溶液体积（ml）蛋白浓度（mg/ml）酶活Km分子量IU/ml 总酶活比活（IU/mg）匀浆产物440.85168007.39219764.710.0287238.05KD层析产物1.50.285114000.17140000比活（IU/mg）=酶活力/蛋白浓度总酶活力105=酶活力溶液体积酶活力（IU/ml）=（H2O2的浓度加入H2O2的ml数-2.5KMnO4 ml数KMnO4浓度/加入样品的ml数）105回收率%=用各步产物的酶活力占匀浆离心上清液酶活力的百分比来表示IU定义：在规定条件下，每分钟催化1umol的【S】转变为【P】的酶量，为1IU。 四、实验讨论1.为什么选择雄性小鼠的肝脏做实验？答：因为雄性小鼠的身体健康指标比雌性小鼠要好。实验要减少偶然，就必须保证在实验过程中引起某个症状的原因是客观的，而不是由于小鼠本身的原因造成的，所以用雄性小鼠会好一点。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。所以用雄性的小鼠的肝脏做实验。2.组织匀浆法的目的是什么？答：在保证过氧化氢酶天然活性的状态下，把肝脏细胞打碎，释放出过氧化氢酶3为什么匀浆缓冲液中加23.5乙醇？答：因为乙醇可以溶解酯质的物质，而过氧化氢酶在乙醇中溶解度很小。4.匀浆法中，为什么加氯仿，而且要边加边搅拌？答：加氯彷是让除过氧化氢酶以外的蛋白质变性。因为氯仿能使蛋白质变性，但过氧化氢酶遇氯仿不变性。边加边搅拌是防止因局部氯仿浓度过高，将过氧化氢酶也氧化。5.盐析时，为什么选择硫酸钠？答：盐能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质沉淀。硫酸钠是中性盐， 对溶液的pH影响小。氯化钠也行。6.盐析时，为什么要在冰浴搅拌的状态下，且要缓慢滴加？答：常温下，酶的活性有损伤。搅拌和缓慢滴加，是防止局部盐浓度过高，使杂蛋白析出。7.为什么匀浆、透析中用醋酸缓冲液，而盐析、凝胶层析中用的都是磷酸缓冲液？答：醋酸缓冲液的缓冲范围的pH值在4.7左右，过氧化氢酶在pH为4.7左右的溶液中溶解度极小，而磷酸缓冲液的缓冲范围的pH值在7.8左右，过氧化氢酶在7.8左右的溶解度很大，醋酸缓冲液是使过氧化氢酶沉淀，而磷酸缓冲液是使过氧化氢酶溶解，这两种缓冲液的作用目的不一样。8.为什么透析袋要煮沸后才能使用？答：为防干裂，透析袋出厂时都用10的甘油处理过，并含有极微