抗生素复习资料.doc

现代定义：生物所产生的能够在低微浓度下有选择地影响它种生物机能的有机物。抗生素时代的开创1929年，Fleming 发现青霉素1940年，Chain 和 Florey提取纯化了青霉素，1943年，实现了青霉素的工业生产1943年，Waksman 发现链霉素1957，Umezawa发现卡那霉素临床上应用的抗生素有时存在以下问题：1、 耐药菌2、 过敏反应3、 毒性较大4、 活性较低等酶抑制剂概念的提出：梅泽滨夫(Umezawa)微生物有机体内酶及其抑制剂是共存的梅泽滨夫研究小组的工作开创了微生物药物的新纪元微生物药物基于微生物整体或实体的药物：菌苗、疫苗。来源于微生物初级代谢产物的药物：氨基酸、维生素。来源于微生物次级代谢产物的药物：抗生素、其它生理活性物质（酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂等）。微生物药狭义内涵：来源于次级代谢产物抗生素剂量表示法效价单位：每ml或每mg样品中所含某种抗生素有效成分的多少效价是衡量抗生素有效成分的尺度，也是衡量抗生素性能的标志青霉素效价表示方法：（稀释单位法）1个青霉素效价单位 =抑制50ml肉汤培养基中生长的金黄色 葡萄球菌的最小青霉素浓度1mg青霉素G钠盐能抑制83350ml肉汤中生长的葡萄球菌，所以1mg青霉素G钠盐的效价单位为1667u。链霉素SM效价（重量单位法）：规定链霉素效价单位=1000u/mg（C21H39O12N7， SM分子量581.6）链霉素硫酸盐（ C21H39O12N7 3/2H2SO4 ，盐分子量728.7 ）链霉素硫酸盐效价=SM理论效价 SM分子量/盐分子量=1000 581.6/728.7=798 u/mg抗菌谱：把某种抗生素所能抑制或杀灭病原体的范围和剂量称为该种抗生素的抗菌谱。抗生素分类：一、按产生菌分类1、 真菌产生的抗生素：如青霉素、头孢菌素、灰黄霉素 2、 放线菌产生的抗生素：如链霉素（灰色链霉菌）、红霉素（红色链霉菌）、四环素（金色链霉菌）、林可霉素（林肯链霉菌）庆大霉素（小单孢菌）等3、 细菌产生的抗生素：如多粘菌素、杆菌肽、短杆菌肽4、 植物及动物产生的抗生素：地衣酸、绿藻素、蒜素。二、按化学结构分类1、 内酰胺类：青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类等2、氨基糖苷类：链霉素、卡那霉素、庆大霉素等3、大环内酯类：红霉素、柱晶白霉素、螺旋霉素等4、四环类：金霉素、四环素、土霉素等5、多肽类抗生素：多粘菌素、放线菌素、杆菌肽、短杆菌肽6、蒽环类抗生素：柔红霉素、紫红霉素、阿霉素、色霉素、光神霉素等7、多烯大环类抗生素：分子结构特征是不仅有大环内酯，而且内酯中尚存有共轭双键，如制霉菌素、两性霉素B、曲古霉素、球红霉素8、苯烃基胺类抗生素：氯霉素及其衍生物9、环桥类抗生素：利福霉素、利副平等10、其它抗生素：磷霉素、创新霉素等医用抗生素应具备的条件1、 具有“选择毒力”2、 在人体内应发挥其抗生效能，而不被人体血、脑脊液及其他组织成分所破坏。生物活性大3、 给药后应很快被吸收，迅速分布到被感染的器官和组织4、 不易产生耐药性5、 具有较好的理化性质，利于提取、精制，且具有一定的有效期。抗生素的生产方法（三大类）1. 生物合成法（微生物发酵法）菌种种子制备发酵提炼精制成品特点：成本较低，周期长，波动性较大。2. 化学合成法某些抗生素化学结构简单，可用全合成的方法进行生产，如氯霉素。3. 半化学合成法（半合成法）利用化学方法对生物合成的抗生素进行结构改造，从而获得性能更优良的新抗生素此法分为两个阶段：通过生物合成法制取某种抗生素，如青霉素G6APA用化学法进行结构改造。 耐药性的遗传学机制1、 诱导性耐药2、 非诱导性耐药（结构性耐药）3、 人工耐药菌4、 自然耐药菌主要机制：具有控制耐药性遗传的质粒，在肠道菌中为R因子，葡萄球菌中为r因子，R因子与r因子都有与细菌耐药性有关的基因，都可传递到敏感菌中，引起耐药菌的逐渐增加。耐药性的生化机制1、细菌产生灭活酶：产生分解酶或钝化酶G+或G-中耐青霉素或头孢菌素的，几乎都是由细菌产生-内酰胺酶，这类酶加水将抗生素的-内酰胺环打开，形成无活性的物质。2、细胞膜通透性改变 细胞膜通透性下降：氨基糖苷类外膜微孔蛋白的缺失3、靶位结构或亲和力改变大环内脂类：50S 腺嘌呤碱基甲基化耐链霉素菌株因核糖体30S亚基的变化而耐药。卡那霉素耐药菌株有30S改变与50S改变形成的耐药菌株4、细胞膜主动外排机制耐四环素菌株产生称为tet蛋白质的膜蛋白。tet蛋白质形成12个贯通膜的通道，在中央有较大亲水性的环状结构，有促进四环素主动外排的作用。 绿脓杆菌菌种选育的概念：菌种选育技术 1、 经验育种：自然选育、诱变育种2、 现代菌种选育：杂交育种、原生质体融合、分子育种自然选育：利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离，筛选排除衰退型菌株，从中选择维持原有生产水平的菌株 。是一种纯种选育的方法。自然选育的目的：1、 纯化菌种2、 防止菌种衰退3、 稳定生产4、 提高产量自然选育的方法1、 单孢子悬浮液的制备2、 分离及单菌落培养3、 筛选诱变育种：利用诱变剂处理微生物群体，使其中部分细胞的遗传物质结构发生改变，从而引起微生物性状发生改变，然后从群体中筛选出目的菌株的过程特点：速度快、收效大、方法简便 缺乏定向性、工作量大主要包括出发菌株的选择、诱变处理和筛选突变株三个部分突变诱发过程及影响因素前突变：诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结构改变称之前突变可以通过影响DNA复制而成为真正的突变，也可以经过修复重新回到原有的结构，即不发生突变(一)诱变剂接触DNA分子前1、 细胞对诱变剂的透性2、 细胞质的某些组分和某些酶可和诱变剂相互作用3、 与基因所处的状态有关，而基因的状态又和培养条件有关(二)DNA损伤的修复1、 光复活作用2、 切补修复:3、 重组修复：又称为复制后修复4、 SOS修复系统 5、 DNA多聚酶的校正作用：增变突变型 (三) 从前突变到突变1、 校正差错:光复活作用、切补修复、DNA多聚酶校正作用:2、 引起差错:重组修复、SOS修复系统 (四)从突变到突变型表型迟延：突变基因的出现并不等于突变表型的出现，表型的改变落后于基因型改变的现象。1、 分离性迟延：是经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态，突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达，需经过复制、分离，在细胞中处于纯的状态时，其性状才得以表达。2、 生理性迟延：突变基因由杂合状态变为纯合状态时，还不一定出现突变表型，新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来。 诱变剂：凡能显著提高生物体突变频率的各种因素都称为诱变剂1.物理诱变剂：主要包括紫外线（UV）、X射线（Xray）、射线(-ray)、快中子(FN)、射线、超声波、激光等。2.化学诱变剂烷化剂：亚硝基胍、甲基磺酸、亚硝酸等碱基类似物： 5-溴尿嘧啶、 6-氨基嘌呤等嵌合剂：吖啶类染料、溴化乙锭等抗生素：丝裂霉素C 、放线菌素D等化学诱变剂的优缺点：1) 大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。2) 经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。3) 大部分诱变剂是致癌剂3.生物诱变剂噬菌体：溶源性噬菌体转座因子诱变剂的选择诱变剂作用：1) 提高突变频率2) 扩大产量变异的幅度3) 使产量变异朝正突变或负突变方向移动选择诱变频率比较高的常用诱变剂合适剂量：凡是既能增加变异幅度，又能促使变异向正突变范围移动的剂量就是合适的剂量高剂量（致死率90%以上）引起变异范围大，变株比较多，适用于单位产量较低的菌株长期用于工业生产经过多次诱变选育的菌株，则宜用中等剂量（致死率为70%80%），甚至更低。并且一般认为低剂量可以提高正变率影响诱变效果的因素1、选择合适的出发菌株即通过选育能有效提高目标产物产量的菌株用作诱变的出发菌株必须产量高，对诱变剂的敏感性大，变异幅度大2、采用分散状态的孢子悬浮液处理3、采用单核细胞（或核质体）处理4、注意微生物的生理状态对数期的细菌、霉菌或放线菌的分生孢子稍稍萌发5、适宜的诱变剂量同一诱变剂一次使用、先后多次使用不同诱变剂同时使用、先后多次使用等诱变剂的复合处理常常呈现一定的协同效应。同时,抗生素产量是数量性状,是微效多基因作用的结果,即抗生素的增产是一种累积效应。因此,这种复合诱变应多次循环进行,诱变效果会更理想。突变株的筛选1、随机筛选肉眼观察法排除低产菌落：经验性琼脂块法排除低产菌落：春日霉素的筛选，提高效率，稳定性差直接摇瓶筛选法：准确性高，但工作量大，效率低2、理性化筛选根据已知的或可能的生物途径、代谢调控机制和产物分子结构来设计筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。比如，已得到去代谢物调节突变株、抗生素酶缺失突变株、形态突变株、耐前体及结构类似物突变株、膜渗透性突变株等。杂交育种：是指将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。部分的定向育种局限性：要求较高，操作复杂杂交育种目的：1、 获得杂种菌株（重组体）2、 优良生产性能集中于重组体3、 扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种4、 促进遗传学理论的发展杂交育种的过程：a、标记菌株的选择如营养缺陷型、抗药性突变型b、异核体的形成异核体：即一条菌丝里含有两个遗传特性不同的细胞核，它们共同生活在同一细胞质中此种异核体一般较稳定c、杂合二倍体的形成异核体菌丝在繁殖过程中偶尔发生两种不同遗传型核融合，这样就形成了杂合二倍体。提高形成杂合二倍体的频率：如紫外线照射、提高培养温度d、重组体的形成并单倍化杂合二倍体在繁殖过程中在同源染色体两个染色单体之间进行有丝分裂交换（体细胞重组）单倍重组体比较稳定，但自发的单倍化频率较低，可在培养基中加入对氟苯丙氨酸，可促进体细胞重组，提高分离子出现频率e 、重组体遗传性状的分析原生质体融合：用脱壁酶将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用聚乙二醇(PEG)促进原生质体发生融合，从而获得融合子，它保持原细胞的一切活性2、过程：a、选出标记菌株要求亲株性能稳定，大多采用营养缺陷型或抗药性标记。b、两亲株分别制备原生质体细菌和放线菌采用溶菌酶酵母菌可采用蜗牛酶或纤维素酶霉菌用蜗牛酶或几丁质酶、纤维素酶等破壁后的原生质体必须置于高渗溶液中，以防破裂c、亲株原生质体融合PEG助融，PEG聚合度1000-6000范围，最终浓度为50%，d、原生质体再生涂布在再生培养基上，原生质体可再生细胞壁，并恢复其繁殖能力e、融合子的选择依靠遗传标记，于选择培养基中进行选择，两个遗传标记能互补，就可确定为融合子分子育种：是运用体外DNA技术获得目的基因，再借助于载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，从而使一个细胞的优秀性状转移给另一个细胞的方法。定向育种。菌种保藏1、定期移植保藏法斜面菌种低温保存，每隔一定时间重新移植培养一次特点：操作简单、保存时间短（2-6个月）、易发生变异2、矿油（液体石蜡）保藏法在斜面培养或穿刺培养上加一层液体石蜡，液体石蜡可以防止失水干燥，隔绝空气，降低菌种细胞代谢速率。适用于各类微生物，尤其是不形成芽孢或孢子的真菌。保藏期1-8年以上3、沙土保藏法将细土与沙按1：2(WW)混合，经灭菌后，将微生物孢子附着在上面进行干燥，然后加以保存。抗生素工业生产中应用最广。可保存1-数年4、真空冷冻干燥保藏法 细胞加入保护剂，在真空条件下冰冻，使样品中的水分直接升华为蒸汽，达到干燥状态。保藏期可达1-20年以上5、液氮冷冻保藏法液氮（-196）。最可靠长期保存方法（1-10年以上）。缺点是需要特殊设备。培养基：人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物的营养物质。组成： C 源、N 源、无机盐（包括微量元素）、水、生长因子和前体等成分生理酸性物质：经微生物代谢后能形成酸性物质的无机N源生理碱性物质：经微生物代谢后能形成碱性物质的无机N源正确使用生理酸碱性物质，可以稳定、调节培养基的pH值磷：含量的控制对发酵产抗生素有重大影响。过低不利于菌体生长，过高可抑制抗生素的合成。许多抗生素只能在低于对生长最适的无机磷酸盐浓度下产生。例如，0.3-500 mmol/L磷酸盐可促进细胞良好生长,而10 mmol/L磷酸盐往往会抑制抗生素的合成抗生素合成的前体概念：在抗生素生物合成中，菌体用来构成抗生素分子而本身结构又没有显著改变的物质如苯乙酸是青霉素用来构成青霉素G分子中的苯乙酰基，而苯乙酸的结构无显著变化前体的作用:1、 提高产量2、 控制合成方向3、 对产生菌有毒定向生物合成：在发酵过程中通过添加某种特定的前体物质，使微生物的生物合成朝着将这些前体物质掺入到抗生素分子的某一特定部位，而产生过量的含有这种前体的抗生素方法前体的分类:1、 内源性:半胱氨酸（青霉素）2、 外源性:苯乙酸(青霉素G)、苯氧乙酸(青霉素V) 、丙酸盐(红霉素)培养基的种类一、按配方成分分类1.天然培养基：原料为一些天然动植物产品，具体成分不太明确，如蛋白胨、玉米浆。优点：营养丰富，价格便宜，适合于大规模培养微生物。 缺点：成分不稳定、不清楚2.合成培养基：用高纯度的化学试剂配制，对其组分很了解优点：成分精确、重复性好缺点：价格较贵、配制较烦二、按培养基形态分类1、 固体培养基：适用于菌种的分离和保存2、 半固体培养基：用于鉴定菌种，观察细菌的运动特征3、 液体培养基：是发酵工业大规模使用的培养基三、按用途分1、孢子培养基用途：供菌种繁殖孢子用的，能产生大量优质孢子要求：能够使菌种发芽生长快，产生大量优质孢子，并且不会引起菌种变异营养不要太丰富（特别是有机N源）无机盐的浓度要适量常用的有麸皮培养基、小米培养基、琼脂斜面等2、种子培养基用途：用作摇瓶种子及种子罐的营养成分，供孢子发芽、生长繁殖菌丝用要求：营养丰富且易于吸收N源和维生素的含量高，但总浓度以略稀薄为宜与发酵培养基成分的一致性3、发酵培养基用途：供菌丝迅速生长繁殖和合成抗生素用的。要求：营养适当丰富和完全pH要适当而稳定，特别在抗生素分泌期如果发酵培养基组成不合适，有可能使菌体朝着繁殖大量菌丝的方向发展，使抗生素合成受到抑制；或者因营养不良，导致菌丝体过早自溶，从而缩短抗生素分泌期；或者因营养不当，使菌体产生异常代谢等4、补料培养基单一补料培养基复合补料培养基影响培养基的质量1、 原材料的质量：品种、产地、加工方法、贮存条件2、 水质影响：对于发酵工厂来说，恒定水源很重要。3、 灭菌操作：糖在高温下易与氨基酸和其他含氨基物质发生反应，形成5-羟甲基糖醛和棕色类黑精，对微生物有一定毒性。磷酸盐与碳酸盐之间，磷酸盐、镁盐和铵盐也发生化学反应形成沉淀。蛋白质在高温下变性，维生素在高温下失活。4、 培养基黏度的影响：黏度影响氧的传递。稀配方，能降低成本、灭菌容易、且能使氧传递容易而有利于目的产物的合成。培养基配制的原则1、 碳源、氮源种类确定：注意快速利用和慢速利用的碳源氮源相互配合，发挥各自优势，避其所短。2、 微生物对培养基中碳氮比的要求：氮源过多，菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物积累；氮源不足，菌体繁殖量少，影响产量。碳源过多，则容易形成较低pH，不足则易引起菌体衰老和自溶。因为碳源既作为碳骨架参加菌体和产物的合成又作为能源，比例要求高。3、 对培养基pH的要求：注意生理碱性物质和生理酸性物质的配比，以及pH缓冲剂的加入和搭配。灭菌及染菌的防治致死温度：极限温度致死时间：致死温度时杀死全部微生物的时间。培养基及有关设备的灭菌方法：工业上常用蒸汽灭菌法1. 实罐灭菌（实消）：培养基预热、培养基灭菌、冷却2. 空罐灭菌（空消）3. 连续灭菌（连消）：培养基通过连续灭菌装置，进行快速连续加热灭菌，并快速冷却，再立即输入预先经过空罐灭菌后的发酵罐中，与分批灭菌相比，需要较高的温度和较短的时间。装置：配料罐，连消塔，维持罐，冷却管步骤：培养基预热：将料液预热到60-75，避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声连续灭菌：在连消塔里完成维持灭菌温度：使料液在灭菌温度下保持5-7分钟冷却：冷却到40-50度发酵附属设备及管路灭菌：附属设备：空气过滤器、补料系统、消沫剂系统，管道空气过滤器：使用前必须用蒸汽彻底灭菌，灭菌后立即将过滤介质吹干备用补料罐：视物料性质而定影响加热灭菌的因素：1. 灭菌物体含菌量的影响2. 压力容器中残留空气的排放3. 灭菌对象pH的影响4. 加热与散热速度空气除菌1. 加热灭菌2. 静电除菌3. 介质过滤除菌（最常用）介质过滤除菌过滤介质按孔隙大小分两类：1. 绝对过滤介质：孔隙小于微生物2. 深层过滤介质：孔隙大于微生物（用的较多）深层过滤介质分两类：1 如棉花纤维、玻璃纤维、合成纤维和颗粒状活性炭，需填充一定厚度2 将过滤材料制成纸、板或管状如超细纤维滤纸、金属烧结板，无需填充很厚深层过滤介质的除菌机理：沉降作用，扩散现象，惯性碰撞，截留作用，静电吸附发酵染菌的原因及对策一、种子带菌对策：转种时注意无菌操作二、设备及附件渗漏化学腐蚀对策：选用耐腐材料电化学腐蚀对策：阴极保护法磨蚀对策：细加工三、培养基灭菌不彻底对策：灭菌注意事项四、空气染菌对策：空气灭菌注意事项五、噬菌体污染对策：重新高压灭菌、保持车间清洁发酵过程的控制微生物发酵的生产水平取决于生产菌种本身的特性和合适的环境条件发酵过程主要控制参数与微生物发酵有关的参数，可分为三类：一、物理参数1. 温度（）2. 压力（Pa）3. 搅拌转速（r/min）4. 搅拌功率（kV）5. 空气流量V/（V min），简称VVM6. 黏度二、化学参数1. pH值2. 基质浓度 3. 溶解氧浓度4. 产物浓度三、生物参数1. 菌丝形态 2. 菌体浓度参数检测方法：1、传统检测：以手工的方式完成，耗时又耗资，使生产周期延长，不能及时反映发酵状况2、在线测量：检测装备在空间上集成在制造系统中，制造过程与检测过程没有时间滞后或只有短时间延时优点：及时、省力，且可从烦琐操作中解脱出来，便于计算机控制缺点：应用困难（发酵液的性质复杂），对设备要求高发酵过程中的代谢变化微生物培养有：分批培养、分批补料培养和连续培养三种方式。工业上大都采用分批培养和分批补料培养，特别是分批补料培养。1、分批培养：指在一封闭培养系统内含有初始限制量的基质的发酵方式1）停滞期 在刚开始接种后的一段时间，几乎未见菌体浓度的增加工业上要求尽可能缩短停滞期：使用适当种龄的种子和接种量2）对数生长期 在此期内的生长速率最大，细胞数目呈指数生长3）稳定期 生长速率逐渐减速直至停止，许多次级代谢产物(抗生素)在此期合成，也称为生产期2、补料分批发酵（Fed-batch culture，FBC）：在分批培养过程中，间隙或连续地补加新鲜培养基的培养方法优点：维持很低的基质浓度，可去除快速利用碳源的阻遏效应；维持适当的菌体浓度，不至于加剧供氧的矛盾；延长次级代谢产物的生产时间；避免培养基有毒代谢产物的积累应用最为广泛3、连续发酵（连续流加培养）：培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的发酵液，由于营养物质的供应与消耗相平衡，培养系统成为稳定状态优点：能维持低基质浓度，可以提高设备的利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间，便于自动控制缺点：培养时间长，难以保证纯种培养；菌种变异可能性较大，故在工业规模上很少采用基质的影响及其控制基质：培养微生物的营养物质。一、C源种类和浓度的影响及控制1、种类的影响迅速利用碳源：较迅速参与代谢，利于菌体生长，但有时会存在分解代谢物阻遏效应缓慢利用碳源：被菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成在发酵工业上，发酵培养基常采用含迅速和缓慢利用的混合碳源 2、浓度的影响C源浓度过低：生长缓慢C源浓度过高：分解代谢物阻遏效应C源浓度的控制：经验性方法-采用中间补料的方法（补糖时间、补糖量、补糖方式）；动力学法-生长速率、糖比消耗速率、生产速率二、N源种类和浓度的影响及控制迅速利用N源：如氨基酸、（NH4）2SO4和玉米浆等，可促进菌体生长，但浓度太大不利于抗生素合成缓慢利用N源：如黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉等，对延长抗生素的分泌期、提高产物的产量有好处发酵培养基一般是选用快速和慢速利用的混合N源发酵生产中常需要补加N源，方法有：补加有机N源 ：酵母粉、玉米浆、尿素等补加无机N源(双重作用）： 氨水，硫酸铵三、磷酸盐浓度的影响和控制微生物生长良好：0.32-300 mmol抗生素合成良好：1.0 mmol明显抑制：10 mmol磷酸盐浓度的控制：采用生长亚适量浓度（对菌体生长不是最适合但又不影响产物合成的量）温度的影响及其控制一、温度对发酵的影响影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质： 影响酶活性，影响目的产物合成的方向影响发酵液的物理性质：发酵液的黏度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解和吸收速率等二、影响发酵温度变化的因素Q发酵=Q生物 + Q搅拌 Q蒸发 Q显 Q辐射Q生物：产生菌本身会产生的热量Q搅拌：搅拌带动发酵液作机械运动产生的热Q蒸发：空气进入发酵罐后就和发酵液广泛交换，产生热交换，引起水分蒸发。水分蒸发带走以及排出的气体夹带部分显热（ Q显）散失到外界。Q辐射：因罐内外温差不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射发酵热随菌株培养基成分和发酵时间不同而不同：菌株对营养物质利用的速率越大，培养基成分越丰富，生物热就越大发酵旺盛的生物热大于其他时间的生物热抗生素高产批号的生物热高于低产批号的生物热。三、发酵温度的确定和控制最适温度:既适合菌体生长又适合抗生素合成的温度生长和合成的矛盾:在2%乳糖、2%玉米浆和无机盐的培养基中对青霉素产生菌进行发酵中,最适菌体生长温度:30 ，最适青霉素合成的温度:24.7 发酵温度的确定:考虑因素：发酵阶段、菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段方法：变温发酵，折中温度的控制由于发酵过程中释放大量发酵热，需要冷却情况较多一般情况下，将冷却水通入发酵罐的夹层或蛇形管中，进行热交换降温如果气温较高，冷却水的温度又高，可采用冷冻盐水进行循环式降温 pH的影响极其控制一、pH对发酵的影响1. 改变酶的活力2. 影响菌体对基质的利用速度3. 改变代谢途径,增加副产品的形成4. 对产物稳定性的影响二、发酵过程中pH值的变化情况1、变化原因：培养基中的营养物质的利用及某些物质的积累2、变化规律：在生长阶段，相对于接种后的起始pH值来说，发酵液的pH值有上升或下降的趋势在生产阶段，一般发酵液的pH值趋于稳定，维持在最适产物形成的pH范围(pH7.0-7.5)在自溶阶段，细胞内蛋白酶积累和活跃，引起培养液中的氨基氮等的增加，致使pH上升3、引起发酵液pH值下降的主要原因：培养基中C/N比例不当，C源过多通气不足或菌体生长过于旺盛消沫剂加得过多生理酸性物质过多4、引起发酵液pH值上升的主要原因：培养基中C/N比例不当，氮源过多生理碱性物质的过多中间补料液中氨水或尿素等碱性物质加入过多菌体生长异常，产生自溶三、发酵pH值的确定和控制1、不同微生物对pH值的要求不同：大多数细菌的最适pH值为6.5-7.5霉菌的最适pH值为4.0-8.0酵母菌的最适pH值为3.8-6.0放线菌的最适pH值为6.5-8.02、微生物生长的最适pH值和发酵产物形成的最适pH值往往不同青霉素合成最适pH值为6.2-6.3 （6.5-7.2）链霉素合成最适pH值为6.7-7.3 （6.3-6.9） 3、pH的控制调节培养基的原始pH值生理酸性或生理碱性物质的使用缓冲剂的使用（碳酸钙、磷酸盐）中间补料溶氧的影响及其控制在抗生素生产的有氧发酵中,保证足量的溶解氧浓度是发酵控制的主要因素之一。氧在水中的溶解度很小，在25和1105Pa时，空气中的氧在水中溶解度仅0.25mol/m3左右,能维持微生物菌体15-20s的正常呼吸供氧方式：在实验室中，摇瓶机；中间实验规模和生产规模，通入无菌空气并同时进行搅拌通气和搅拌的目的：1. 提供微生物生长和代谢所需的氧(溶解氧）2. 微生物在培养液中处于悬浮状态3. 提高代谢产物的传递速度发酵过程溶解氧浓度的变化 1、溶氧浓度临界溶氧浓度：不影响微生物呼吸和产物形成所允许的最低氧浓度最适氧浓度：溶解氧浓度对生长或产物合成的最适的浓度范围微生物发酵的最适氧浓度与临界氧浓度是不同的发酵应保持在临界氧浓度以上,最好处于最适氧浓度范围，这样便可减少批次之间的波动和更有效地利用空气动力。需氧发酵并不是溶氧愈大愈好。溶氧较高虽然有利菌体的生长和产物的合成，但当溶氧水平太大,有时会抑制产物的形成。2、溶解氧浓度的变化规律在发酵前期：需氧超过供养，溶氧明显下降，溶氧曲线出现一个低谷。过了生长阶段，一般需氧量略有减少，溶氧随之上升，次级代谢产物开始形成发酵中后期，溶氧浓度明显受工艺控制手段的控制在发酵后期，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明显地上升3、发酵异常时的溶氧变化污染好气性杂菌、噬菌体菌体代谢发生异常某些设备或工艺故障影响溶解氧浓度的因素1、供氧方面：通气量的大小；搅拌转速和功率；发酵液的性质；温度；压力2、需氧方面：菌体生长速度；菌体浓度；中间补料；异常情况补料的作用及其控制一、补料分批发酵作用1、可以控制抑制性底物的浓度 在许多发酵过程中，微生物的生长是受到基质浓度的影响,高浓度营养物对大多数微生物生长不利2、可以解除或减弱分解代谢产物阻遏在微生物合成初级或次级代谢产物中，有些合成酶受到易利用碳源或氮源的阻遏，特别是葡萄糖，它能够阻抑多种酶或产物的合成，如青霉素、赤霉素等。这种阻遏作用不是葡萄糖的直接作用，而是由葡萄糖的分解代谢产物引起的(葡萄糖效应）3、可以使发酵过程最佳化二、补料分批培养的补料类型和控制1、补料类型1）按补料方式：连续流加、不连续流加、多周期流加每次流加方式：快速流加、恒速流加、指数速率流加、变速流加2）按体积：变体积、恒体积3）按反应器数目：单级、多级4）按补加成分：单组分补料、多组分补料2、补料控制1）反馈控制 组成：传感器、控制器、驱动器 直接方法 间接方法2）无反馈控制3、放料和补料法三、补料内容：基础培养基碳源： 补糖（葡萄糖）氮源： 补充有机氮源、通氨、尿素微量元素补水：降低发酵浓度及其表观黏度四、流加补料的原则控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展在生物合成阶段有足够而又不过多的营养物质，维持正常代谢和合成产物的需要泡沫的影响及其控制一、泡沫形成的原因1. 通气和搅拌2. 代谢气体溢出3. 培养基中蛋白质类表面活性剂的存在二、泡沫的分类1. 机械性泡沫2. 流态泡沫三、泡沫形成的危害1. 影响装料系数2. 引起逃液3. 引起染菌4. 引起菌丝粘壁四、起泡的方式保持恒定发酵早期起泡后稳定下降，以后保持恒定发酵前期泡沫稍微下降后又开始回升逐渐上升综合方式五、泡沫的消长规律1、影响因素通风、搅拌培养基的成分、配比灭菌方式2、消长规律随着微生物代谢活动而不断变化六、泡沫的控制1、减少形成： 调整培养基的成分 改变某些物理化学参数 改变发酵工艺方式2、消除已形成的七、消除泡沫的方法1、机械消沫1)分类罐内消沫：消沫桨罐外消沫：将泡沫引出罐外，通过喷嘴的加速作用或离心力来消除泡沫2)特点优点：减少培养液性质的复杂性、减少污染机会缺点：非治本2、消沫剂消沫1)分类天然油脂类：双重作用、效果有限化学消沫剂：聚醚类、效果非常好2）用量：通过实验确定3）消沫剂的扩散：载体 ，并用，乳化抗生素产生菌的代谢调节控制菌体代谢类型：1. 分解代谢和合成代谢2. 初级代谢和次级代谢初级代谢:能使营养物质转变成机体的结构物质和对机体具有生理活性的物质,或是为机体生长提供能量的一类代谢初级代谢产物：微生物生长和繁殖所必须的物质，如蛋白质、核酸等，具有保守性次级代谢:存在于某些生物中,并在一定的生长期内出现的一种代谢类型次级代谢产物：指由微生物次级代谢产生的与微生物的生长、繁殖无关的一类物质，如抗生素、酶抑制剂等，具有特异性微生物的代谢是由各种酶所催化的，因此，代谢的调节，实质上，主要是通过控制酶的生成和功能而实现的一、酶生成的调节主要形式有诱导生成、酶生成阻抑（终产物阻抑、分解代谢物阻抑）1、诱导生成按酶生成的方式：诱导酶；组成酶(糖酵解途径中的酶)1）诱导酶：诱导剂诱导酶（共存亡）诱导剂：底物及其结构类似物乳糖操纵子模型，乳糖作为诱导物，诱导-半乳糖苷酶的生成甲硫代半乳糖苷（乳糖结构类似） -半乳糖苷酶生成顺序诱导：诱导剂1酶1底物分解的产物（诱导剂2）酶2 底物分解的产物（诱导剂3）2）由于酶诱导生成调节，避免了能量和代谢物的浪费3）诱导酶组成酶有利于代谢产物的大量积累2、酶生成的阻抑由于某种化合物的存在而阻止了酶的合成。分为终产物阻抑与分解代谢物阻抑1）终产物阻抑起阻抑作用的化合物是某一合成途径的终产物，节约了大量的能量和原料:在已合成足够需要的物质时，或有外源加入该物质时，就停止生成其有关合成的酶类；而当该物质缺乏时，又开始生成这些酶（反馈阻抑）2）分解代谢物阻抑：被菌体迅速利用的底物其分解产物对许多酶合成的抑制作用葡萄糖效应其实就是一种碳分解代谢调节作用葡萄糖效应，指大肠杆菌培养于葡萄糖和乳糖的培养基中，菌体出现两次生长旺盛期，这是大肠杆菌首先利用葡萄糖进行生长繁殖，在葡萄糖耗尽后，过一段时间才开始利用乳糖其他能被快速利用的碳源、氮源、磷源也具有类似效应3、酶生成调节机制:操纵子学说二、酶功能的调节既酶活性调节(细调)，使得不需要的酶立即停止活动，当需要时又可立即恢复,又称为反馈抑制1、分类单一终产物的反馈抑制顺序反馈抑制合作反馈抑制累加反馈抑制同功酶抑制2、反馈抑制的机制调节酶学说:被反馈抑制的酶有两个结合位点，一个是和酶的底物结合，称为活性中心，另一个和终产物结合，称为调节中心。当终产物和调节中心结合后，引起酶的结构改变，使酶的活性中心结构也随之改变，不能和底物结合，而失去催化活性应用:菌种选育改变调节中心次级代谢物生物合成的调节一、次级代谢物生物合成的特征1、抗生素产生菌的生命活动过程分为两个时期，即营养生长期和次级代谢产物形成期2、抗生素产生菌的生长期向生产期转变时，在形态学和生理学上会发生一些变化3、一种微生物能够合成多种在结构上完全不同的次级代谢产物,不同的微生物也能够合成相同的次级代谢产物4、一种微生物的次级代谢产物大多是一组具有相似结构的化合物原因:酶的特异性不强后果:分离纯化困难对策:菌种选育和发酵控制5、抗生素的生物合成过程是一种由多基因控制的代谢过程。这些基因不仅位于微生物的染色体、也可位于质粒(不稳定性)二、初级代谢与次级代谢的关系1、生化代谢次级代谢产物都是以初级代谢产物为母核衍生来的次级代谢产物和初级代谢产物在代谢调控上互相影响两个代谢有不同的酶系2、遗传代谢初级代谢和次级代谢都是受到核内DNA控制，并且次级代谢还受到核外遗传物质的控制抗生素下游加工过程:提炼提炼过程包括三个方面：1）发酵液的预处理和过滤2）提取过程3）精制过程1、发酵液的成分:抗生素(0.1-0.5%) 、大量菌体、菌种代谢物、未利用培养基2、预处理是抗生素分离纯化的第一道工序3、预处理的目的：在抗生素提取精制之前,除去干扰物质经预处理，增加抗生素的水溶性（pH值）了解抗生素存在的部位发酵液：大部分抗生素分泌到胞外，经过液固分离，得澄清发酵液，进一步纯化，得到纯品菌体内：一些抗生素如多烯类的制霉菌素、两性霉素、曲古霉素累积于菌丝体中，且水溶性很小，取其滤饼，再用其他溶剂萃取发酵液预处理的去除杂质：去除可溶性黏胶状物质，包括核酸、杂蛋白、不溶性多糖等去除无机盐，包括Fe3+、Ca2+、Mg2+等为达到预处理目的，经常将发酵液pH调节至酸性或碱性如四环类抗生素由于能和钙、镁、钡等离子形成不溶性的络合物，故大部分沉积在菌丝内，用草酸酸化后，就能产生草酸钙沉淀，使四环类抗生素从菌丝体中转入水相中。酸化剂：盐酸、硫酸、磷酸、草酸等选择时应考虑：适合抗生素产品性能，对设备腐蚀性，价格低廉、来源方便常用的是草酸：酸性温和、腐蚀性小，并能与发酵液中碱土金属结合成沉淀而析出，起释放抗生素作用碱化剂：氢氧化钠、碳酸钠、氨水等，最常用氢氧化钠：因来源便宜，价格便宜，不污染环境等，但腐蚀性大。碱化时可与铁离子生成氢氧化铁以及部分蛋白沉淀除去。一、菌丝体及蛋白质的处理1、等电点沉淀蛋白质为两性物质，在等电点时，在水中溶解度最小，能沉淀除去。蛋白质等电点都在酸性范围内，pH4.0-5.52、变性沉淀最常用的方法是加热，适合于对热稳定的抗生素，加热可加速蛋白凝聚，还能使液体黏度降低，加快过滤速度在链霉素生产中，采取pH3.0情况下，加热70，维持30min以凝固蛋白质，过滤速度可提高3倍，黏度降低到原来的1/6 3、加各种沉淀剂沉淀蛋白质能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐等形成沉淀。在碱性溶液中，能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀4、加入凝聚剂某些无机盐可使细胞、细胞碎片及蛋白质等胶体颗粒发生凝聚作用而被去除。常用的凝聚剂：Al2（SO4）3 18H2O、AlCl3 6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等。5、加入絮凝剂发酵液中加入絮凝剂如壳聚糖、海藻酸钠、明胶等，形成粗大的絮凝团，有助过滤。6、吸附利用吸附作用能有效去除杂蛋白。四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾K2Zn3Fe（CN）62的胶状沉淀，将蛋白与菌体去除7、酶解法去除不溶性多糖如淀粉酶将培养基中多余的淀粉水解成单糖，降低发酵液黏度，提高滤速二、高价金属离子的去除高价金属离子：Ca2+、Mg2+、Fe3+等Ca2+ ： 加入草酸，生成草酸钙（一举两得：沉淀、凝固），但草酸价格较贵，应注意回收Mg2+ ： 加入三聚磷酸钠Na5P3O10 ，与Mg2+形成络合物，消除Mg2+的影响用磷酸盐也能大大降低Ca2+、 Mg2+浓度Fe3+ ： 加入黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀Fe3+ + K4Fe（CN）6 Fe4Fe（CN）63+ 12 K+影响液-固分离的因素1、菌体种类和浓度不同，其粘度有很大差别真菌：菌丝较粗大，容易过滤放线菌：菌丝细多分枝，较难过滤细菌：细小悬浮物，非常难过滤2、不同的培养基组分和用量也影响粘度黄豆饼粉、花生饼粉作氮源，用淀粉作碳源会使粘度增大发酵液中未用完的培养基较多或发酵后期用油作消沫剂也会使过滤困难3、正确选择发酵终点和放罐时间一般发酵进入自溶阶段，抗生素产量才能达到高峰，但菌丝自溶使发酵液变粘4、染菌的发酵液粘度也会增高溶媒萃取法：用一种溶媒根据抗生素在两种溶媒中溶解度不同将抗生素从另一种溶媒中提取出来，这两种溶媒相互不溶或部分混溶。一、单级萃取：料液F和溶剂S在混合器中充分混合用分离器得到萃取液L和萃余液R二、多级萃取1、多级错流萃取（多级顺流萃取）料液经萃取后的萃余液再用新鲜萃取剂进行萃取特点：第一级的萃余液R1作为第二级的料液，第二级的萃余液R2作为第三级的料液，每次萃取都用新鲜的萃取剂S1、S2、S3。同理还可进行n级萃取。优点：萃取较完全缺点：溶剂消耗量大，萃取液平均浓度比较稀总结：当分配系数相同，并且萃取剂总用量相同时，二级萃取得率比单级萃取收得率要高。简言之，在萃取剂用量一定的情况下，萃取次数愈多，则萃取愈完全2、多级逆流萃取在第一级中加入料液F，萃余液顺序作为后一级的料液，而在最后一级加入萃取剂S，萃取液顺序作为前一级的萃取剂，料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反特点：1）第一级的萃余液R1作为第二级的料液，第二级的萃余液R2作为第三级的料液，依次类推；2）而萃取剂S只在最后一级加入，最后一级的萃取液L3作为第二级的萃取剂，第二级的萃取液L2作为第一级的萃取剂。结论：二级逆流萃取的效果比二级错流萃取的效果更好，溶媒用量更少，收得率更高实际生产中情况极复杂，实际收得率一般比理论得率要低乳化是影响溶媒萃取的主要因素。影响萃取操作的一些因素1、乳化作用2、pH ：影响弱酸或弱碱性抗生素的分配系数，而分配系数又直接和收率有关；影响抗生素的溶解度；溶液的pH也影响药物的稳定性3、温度的影响：抗生素在高温下不稳定，萃取一般在低温下进行；随温度升高，有机溶剂与水之间的互溶度增大，从而萃取效果降低4、盐析作用：加入盐析剂如（NH4）2SO4、NaCl等可使抗生素在水中溶解度降低，而易于转入溶媒中去；另一方面也能减少有机溶媒在水中的溶解度5、带溶剂：带溶剂是指其能和抗生素形成复合物，而易溶于溶媒中，并且此复合物在一定条件下又要容易分解；某些抗生素水溶性很强，在有机溶媒中溶解度很小，如要采用溶媒萃取法提取，可借助于带溶剂。6、溶媒的选择根据类似物容易溶解类似物的原则，应选择与抗生素结构相近的溶媒。价廉、毒性小、来源广泛易得在抗生素工业生产中最常用的是乙酸乙酯、乙酸丁酯和丁醇等乙酸丁酯：流体力学性能最好、应用最广泛的一种萃取剂，大多数抗生素均用它进行提取，其水溶性大使其使用价值大大降低。离子交换法：是利用离子交换树脂将抗生素吸附在树脂上,然后在适宜的条件下将抗生素洗脱下来，达到浓缩纯化的目的。优点：树脂无毒性且可反复再生使用、少用或不用有机溶剂、设备简单缺点：生产周期长、成品质量有时较差、pH变化大、对pH稳定性不佳的抗生素不适用离子交换树脂：是具有良好化学稳定性、不溶于酸、碱和有机溶剂的固态高分子化合物，具有离子交换能力一、组成：1、骨架：网状、由不能移动的多价高分子基团构成，使树脂具有溶解度和化学稳定性2、活性离子：为可移动的离子，其在骨架中的进进出出，就发生了离子交换现象二、分类树脂的主要性能是由可交换的功能团中的活性离子决定的按照活性基团的种类分为：强酸、弱酸、强碱、弱碱、中强酸。三、树脂的命名国际上迄今还没有统一的规则，国外多数是以厂家或商家的牌号、代号来表示，我国在60年代后逐步规划统一的命名法是： 1-100号 强酸性离子交换树脂 101-200号 弱酸性离子交换树脂 201-300号 强碱性离子交换树脂 301-400号 弱碱性离子交换树脂实际上包括三个过程：外部扩散，内部扩散，化学交换反应影响交换速度的因素：1）颗粒大小：树脂颗粒减小无论对内部扩散控制或外部扩散，都有利于交换速度的提高2）交链度：降低树脂交链度，能提高交换速度3）温度：温度上升，交换速度增快4）离子的化合价：化合价愈高，扩散速度愈慢，离子在树脂中扩散时，存在和树脂骨架中的库仑力。离子化合价愈高，引力愈大，扩散速度就愈小5）离子的大小：离子小，交换速度快分子筛：利用大分子和小分子在某种树脂上的交换速度不同，大分子在树脂中的扩散速度慢，因为大分子会和树脂碰撞，而达到分离的目的，这种树脂称为分子筛6）搅拌速度：增加搅拌速度可使交换速度增加，主要通过增加外部扩散速度，但太快会打碎树脂，增加是有一定限度的7）溶液浓度：浓度增大时，交换速度可增加，但幅度将愈来愈小，最后达一极限值离子交换过程的选择性选择性:某种树脂对不同离子交换亲和能力的差别指标:KBA（B离子取代树脂上A离子的交换常数）,K值越大，就愈易吸附B离子1、离子的水化半径离子的体积愈小，则越易吸附，而离子在水溶液中的大小应用水化半径来表征，水化半径小的离子越易吸附2、离子的化合价在低浓度条件下，普通温度时，离子的化合价愈高，愈易被吸附利用离子交换树脂提取链霉素时，树脂能优先吸附Str3+3、介质的酸碱度pH对各种树脂的影响是不同的。如弱酸性树脂，在酸性和中性下，它的电离度很小，H+不易游离出来,交换容量很低，只有在碱性的条件下，才能起交换作用4、交链度、膨胀度和分子筛一般交链度大，膨胀度小的树脂选择性比较好增大树脂的铰链度，有机大分子便不能进入树脂内部，但无机离子不受阻碍，利用这一原