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第十三章 细胞的衰老与凋亡 教学目的：1 掌握细胞衰老与凋亡的概念2 探讨细胞衰老及凋亡的机理教学重点：影响细胞凋亡的因素教学难点：细胞凋亡的机理讲授法第一节 细胞衰老概 述 细胞衰老的研究只是整个衰老生物学（老年学，人类学）研究中的一部分。所谓衰老生物学（biology of senescence）（或称老年学，gerontology）是研究生物衰老的现象、过程和规律。其任务是要揭示生物（人类）衰老的特征，探索发生衰老的原因和机理，寻找推迟衰老的方法，根本目的在于延长生物（人类）的寿命。多细胞有机体细胞，依寿命长短不同可划分为两类，即干细胞和功能细胞。干细胞在整个一生都保持分裂能力，直到达到最高分裂次数便衰老死亡。如表皮生发层细胞，生血干细胞等。一、 早期的细胞衰老研究100年前，魏斯曼曾提出种质不死而体质会衰老和死亡的学说，后来，Carrel和Ebeling认为细胞本身不会衰老,衰老是由于环境的影响造成的。特别是20世纪40-50年代，由于L系小鼠细胞和Hela细胞系的建立，又使细胞不死性的观点更加巩固。直到60年代初，Hayflick等人的出色工作对细胞不死的观点彻底动摇了。二、Hayflick界限Hayflick通过对不同生物的胚成纤维细胞的体外培养，发现物种寿命和培养细胞寿命之间存在着确切的相互关系。Hayflick巧妙的设计实验，进一步证明了决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部环境。取老年男性个体的细胞（间期无巴氏小体）和年轻女性个体的细胞（间期有巴氏小体）进行单独或混合培养，并统计其倍增次数。结果发现，混合培养中的两类细胞的倍增次数与各自单独培养时相同，即在同一培养液，当年轻细胞旺盛增殖的同时，年老细胞就停止生长了；年轻细胞的胞质体与年老的完整细胞融合时，得到的杂种细胞不能分裂；年老细胞的胞质体与年轻的完整细胞融合时，杂种细胞的分裂能力几乎与年轻细胞相同。充分说明决定细胞的衰老是细胞核，而不是细胞质。体外培养的细胞，不是不死的，而是有一定寿命的，它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限。即Hayflick界限。从而引出了细胞最高分裂次数的问题。三、细胞在体内条件下的衰老在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生；正常情况下终生保持分裂的细胞，其分裂能力也表现出随着有机体年龄的增高而下降；衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长；衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老；骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞增殖速度也趋缓慢.四、衰老细胞结构的变化（一）生活细胞的基本特征（二）衰老细胞结构的变化1 细胞核的变化：核膜内折，染色质固缩，核仁不规则。2 内质网的变化：年轻动物：RER 发育好、排列有序；年老动物：RER弥散、总量减少。3 线粒体的变化：数量随龄减少，体积随龄增大。由于线粒体是细胞呼吸和氧化的中心，有人称它是决定细胞衰老的生物钟。而有些研究者则认为线粒体不是衰老的启动者，而是受害者。4 致密体（脂褐质）的生成：是由溶酶体或线粒体转化而来的。它是自由基诱发的脂质过氧化作用的产物。5 膜系统的变化：目前资料表明，膜的改变确实与衰老有密切关系，年轻的功能健全的细胞膜是典型的液晶相。6 细胞骨架体系的变化：7 高尔基体和溶酶体的变化：数量随衰老明显增多。8 蛋白质合成的变化：合成速率降低。五、细胞衰老的分子机制（原因及假说）从古到今，人们对衰老的机理有各种各样的理解，提出了数不清的假说和理论，据统计，迄今为止曾提出过的衰老假说和理论竟多达300种以上！这数百条思路，除了完全的谬误之外，多是从不同角度和深度反映了衰老这一复杂过程的某一侧面或层次。直到90年代以来，其分子机制的研究才有了重大进展，比如单基因的突变导致寿命的显著延长、端粒和端粒酶与细胞衰老关系的发现等。下面介绍60年代起开始出现的一系列衰老理论。（一）氧化性损伤学说（自由基理论）Harman50年代（1956）提出。认为衰老的一条重要的途径是因自由基脂质的过氧化而引起细胞功能的多方面异常。（二）端粒与衰老 发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的“有丝分裂钟”学说（Harley,1990）。端粒由富含G、C简单重复顺序所组成，其长度随细胞衰老过程而逐渐缩短，但端粒酶却可维持端粒的长度。（三）rDNA与衰老 酵母染色体外rDNA 环（ERC）的积累，导致细胞衰老。（四）沉默信息调节蛋白复合物与衰老 Sir complex 存在于异染色质区，其作用在于阻断所在位点DNA转录。（五）SGS1基因、WRN基因与衰老 SGS1基因和WRN基因同源,编码解旋酶;酵母sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均9.5代:24.5代）; wrn突变引发早老症。（六）发育程序与衰老（七）线粒体DNA与衰老 Sen-DNA(80年代);mtDNA突变积累与细胞衰老有关。（八）衰老因子积累说，亦称“蛋白质合成差错成灾说”Megbegeeb（1962）orgel（1973）提出，认为有缺陷的酶干扰复制、转录、翻译等水平错误积累直至成灾（九）基因调节Smith假说衰老细胞+年轻细胞异质双核细胞（年轻细胞核DNA合成受抑制）衰老细胞+Hela细胞异核体（衰老细胞被诱导合成DNA）说明：1衰老细胞产生了DNA合成抑制剂，穿过胞质，影响正常年轻细胞核中DNA合成。2Hela细胞则不受这种抑制剂的影响，相反，它们产生DNA合成起始因子，并诱导衰老细胞核的DNA合成。大脑的衰老中心：近年来：Franks，Finch等，提出在大脑存在一个“衰老控制中心”，这就是神经内分泌轴（下丘脑垂体内分泌系统）调控机体各种生理功能。六、细胞死亡细胞死亡是细胞衰老的结果，是细胞生命现象的终止。包括急性死亡（细胞坏死）和程序化死亡（细胞凋亡）。细胞死亡最显著的现象，是原生质的凝固。事实上细胞死亡是一个渐进过程，要决定一个细胞何时已死亡是较因难的。除非用固定液等人为因素瞬间使其死亡。那么，怎样鉴定一个细胞是否死亡了呢？通常采用活体染色法来鉴定。如用中性红染色时，生活细胞只有液泡系染成红色，如果染料扩散，细胞质和细胞核都染成红色，则标志这个细胞已死亡。七、关于人类的衰老和寿命问题人类寿命有无极限？极限是多少？抗衰老，求长寿，古往今来，人之常情，时至今日，更为人们所关注。研究表明：1哺乳动物自然寿命为生长发育期的57倍，借此推论，人类完成生长发育约在2022周岁，自然寿命应是100150岁。2哺乳动物的自然寿命为性成熟的810倍。3海弗里克（Hayflick）：人体细胞可进行50次左右有丝分裂，每次细胞周期为24年，这样推论，人的寿命应在120岁左右。1 遗传与人类寿命：先天性，父辈主宰。父、母享有高寿，其子女往往也是高寿者。2 寿命与性别有关：人寿保险公司统计说明，性动物性动物，女人男人，为什么？众说纷纭。3 环境与人类寿命：后天因素多样错综复杂。体魄、环境、心理、社会、营养、疾病等。其中营养及体力活动较为重要。4 职业与人类寿命： 职业作为一种重要的社会因素，对人类寿命有一定的影响。日本统计，从事管理工作人员，平均寿命最长，依次为国家机关工作人员、专业技术人员、商业工作人员、农业工作人员、一般生产工人、体力劳动者、矿工。总得说来，近20年来，细胞衰老的研究取得了长足的进步，但离开真正揭示细胞衰老的本质，还要走很长的路。一旦揭开了细胞衰老的秘密，那么延缓衰老，延长寿命将成为可能，但辩证唯物主义告诉我们，真正的长生不老是不可能的。我们研究了解细胞衰老死亡规律，目的并不是为了避免死亡，而是要延缓细胞衰老的到来。我们讴歌生命，也不必诅咒死亡，有生必有死，无死亦无生，我们不赞成死亡，但长生不死是进化和发展的敌人。但愿我们每个人都能较长时间生活在这个美好的世界，为人类的进步与文明做更多的贡献。第二节 细胞凋亡(Apoptosis)一、细胞凋亡的概念及其生物学意义概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，所以也常常被称为细胞编程死亡（programmed cell death,PCD）。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。这一假说是基于Hayflick界限提出的：1961年Hayflick根据人胚胎细胞的传代培养实验提出。指细胞在发育的一定阶段出现正常的自然死亡，它与细胞的病理死亡有根本的区别。生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用。例如：蝌蚪尾的消失，骨髓和肠的细胞凋亡，脊椎动物的神经系统的发育，发育过程中手和足的成形过程。二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征（一）细胞凋亡与坏死(necrosis)二者的主要区别是，细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（apoptotic bodies），凋亡小体则为邻近的细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。相反，在细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏，细胞内容物，包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段，释放到胞外，导致炎症反应（二）细胞凋亡的形态学特征1 凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布。2 凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体。3 凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化（三）细胞凋亡的生化特征1 细胞凋亡的主要特征是形成大小为180200bp特征性的DNA ladders。2 凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶tTGtissue Transglutaminase）积累并达到较高水平。（四）诱导细胞凋亡的因子1 物理性因子：包括射线（紫外线，? 射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等。2 化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子?（TNF?），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等。（五）细胞凋亡的检测形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法彗星电泳法（comet assay）流式细胞分析：根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。三、细胞凋亡的分子调控机理（一）Caspase家族与凋亡1 Caspase家族 Caspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为Cysteine aspartic acic specific protease，即Caspase。2 Caspase活化 Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化。3 胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径（凋亡信号通路）当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptor protein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡。下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNA Ladder；裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。（二）Bcl-2、线粒体与细胞凋亡（待修改补充）Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡。Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域，可与线粒体及内质网膜相结合。Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个