植物组织培养.doc

第一章 植物组织培养的基础知识组织培养的概念植物组织培养是指将植物的离体器官（如根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（如花药、胚珠、形成层、皮层、胚乳等）、细胞（如体细胞、生殖细胞花粉等）以及去除细胞壁的原生质体，甚至幼小的植株，放在无菌条件下，在人工控制的环境条件下，培养在培养基上对其进行克隆，使其生长、分化并成长为完整植株的过程。 可称为离体培养或试管培养。组织培养的生理依据1细胞全能性学说植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。 全能性只是一种可能性。要把这种可能性变为现实性必须满足两个条件：一是要把这些细胞从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来，也就是说必须使部分细胞处于离体的条件下。二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。全能性体现的两个过程一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。再分化的过程有两种方式： 一是器官发生方式 二是胚胎发生方式 2.激素（植物生长调节剂）调控植物生长调节剂是培养基中的关键性物质，用量极少，但起着十分重要明显而调控作用。植物生长调节剂包括生长素、细胞分裂素及赤霉素等多种，它们在植物组织培养中具有不同的作用。（1）生长素用于诱导愈伤组织的形成，体细胞胚的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽和不定芽的产生。常用的生长素:2,4二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸 （NAA）、吲哚乙酸（IAA）和吲哚丁酸（IBA）等。作用强弱顺序:2，4-DNAAIBAIAA。(2)细胞分裂素 促进细胞分裂与分化，延迟组织衰老，增强蛋白质合成，促进侧芽生长及显著改变其他激素作用的特点。常见的细胞分裂素有：2异戊烯腺嘌呤（2-iP）、玉米素（ZT）、6苄基氨基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、苯基噻二唑基脲（TDZ） 。作用强弱顺序: TDZ 2ipZT6BAKT。 (3) 赤霉素在植物组织培养中应用的仅有GA3一种，它是一种天然产物，能促进已分化芽的伸长生长。其他植物生长调节剂: 如脱落酸（ABA）、乙烯利（CEDP）等在植物组织培养中也有一定的应用。 生长素/细胞分裂素的比值: 大时有利于根的形成，这时生长素起主导作用；比值小时，则促进芽的形成，这时细胞分裂素起主导作用。 外植体（脱分化）愈伤组织（再分化）器官或胚胎完整植株组织培养的类型1培养方式：固体培养；液体培养：震荡培养、旋转培养、静置培养、纸桥培养2培养材料：植物培养、胚胎培养、器官培养、愈伤组织培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养 (1)愈伤组织培养将外植体接种在培养基上，由于植物生长调节剂的存在，其细胞脱分化形成愈伤组织，然后通过再分化形成再生植株。愈伤组织是一种最常见的培养形式，因为除茎尖分生组织和一部分器官以外，其他的几种培养形式最终也都要经过愈伤组织才能再生植株。愈伤组织的形态发生途径：胚胎发生途径器官发生途径 (2)器官培养器官培养是通过培养器官的类别来分类的。培养的是什么器官，就称为什么培养。如根、茎、叶、花、果实、种子的培养。(3)胚培养 胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。胚培养用途：1.拯救胚2.研究胚的发育营养研究3.一些特殊的领域的研究。 (4)细胞和原生质体培养细胞培养：将植物的单个细胞或细胞团分离出来，放在培养基上进行培养。 原生质体培养：指将植物细胞的细胞壁通过物理或化学的方法去除，然后再进行培养。原生质体培养的最大用处是体细胞杂交。 组织培养的历史虽然组织培养技术的蓬勃发展只是近50年来的事。但它的整个历史可以追溯到上世纪初。从那时起到现在，组织培养的发展过程大致可以分为三个阶段：萌芽阶段（从20世纪初至20世纪30年代中）奠基阶段（从20世纪30年代末到20世纪50年代中）快速发展阶段和应用阶段（从20世纪50年代到现代）萌芽阶段（从20世纪初至20世纪30年代中）在Schleiden和 Schwann所提出的细胞学说的推动下，德国植物生理学家Haberlandt于1902年提出了高等植物的器官和组织可以不断分割,直至分到单个细胞观点和细胞全能性观点。 1904年Hannig在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚，并使这些胚在离体条件下长到成熟。后来，Laibach（1925，1929）把由亚麻种间杂交形成的不能成活的种子胚剥出，在培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性； 1922年，美国的Robbins和德国的Kotte分别报道培养离体根尖获得某些成功，这是有关根培养的最早的实验。奠基阶段（从20世纪30年代中至20世纪50年代末）30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素-一种天然的生长调节物质。 1934年，White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的离体培养实验首次获得了真正的成功。起初，他在实验中使用的培养基包含无机盐、酵母浸出液和蔗糖。后来（1937），他用3种B族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，取代酵母浸出液获得成功。此合成培养基后被称为White培养基。 Gautheret（1934）在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现，虽然在含有葡萄糖和盐酸半胱氨酸的Knop溶液中，这些组织也可以不断增殖几个月，但只有在培养基中加入了B族维生素和IAA以后，山毛柳形成层组织的生长才能显著增加。 这些实验揭示了B族维生素和生长素的重要意义，又直接导致了1939年Gautheret连续培养胡萝卜根形成获得首次成功。同年，white由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜也建立了类似的连续生长的组织培养物。 Gautheret，White和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。 40年代和50年代初期，活跃在植物组织培养领域里的研究者以Skoog为代表，研究的主要内容是利用嘌呤类物质处理烟草髓愈伤组织以控制组织的生长和芽的形成。Skoog（1944）和崔徵等（1951）发现，腺嘌呤或腺苷不但可以促进愈伤组织的生长，而且还能解除培养基中生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成，从而确定了腺嘌呤与生长素的比例控制芽和根形成的主要条件之一。这些实验结果导致了激动素和以后利用激动素和生长素在组织培养中控制器官分化工作开展。50年代开始以后的10年中，引人注目的植物组织培养的研究进展有以下6项：1952年，Morel和 Martin首次证实，通过茎尖分生组织离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无毒植株。 19531954年，Muir进行单细胞培养获得初步成功。并对分离的单细胞进行了 “看护培养”。实现Haberlandt培养单细胞可能性的这一设想。1955年，Miller等由鲱鱼精子DNA中分离出细胞分裂素，并把它定名为激动素（kinetin）。具有和激动素类似活性的合成的或天然的化合物已有多种，它们总称为细胞分裂素（cytokinin）。应用这类物质，我们就有可能诱导已经成熟和高度分化的组织（如叶肉和干种子胚乳）细胞进行分裂。1957年，Skoog和Miller提出了有关植物激素控制器官形成的概念。指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数，通过改变培养基中这两类生长调节物质的相对浓度可以控制器官的分化：这一比率高时促进生根，低时促进茎芽的分化。二者浓度相等时，组织则趋向于以一种无结构的方式生长。后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。 19581959年，Reinert和Steward分别报道，在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。这是一种不同于通过芽和根的分化而形成植株的再生方式。现在知道有很多物种都能形成体细胞胚。在有些植物任何部分都可以得到体细胞胚，如胡萝卜和毛茛上。迅快发展阶段（从20世纪60年代至现在）（l）原生质体培养取得重大突破1960年Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。 1971年，Takebe等在烟草上首次。由原生质体获得了再生植株，这不但在理论上证明了除体细胞和生殖细胞以外，无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上可以为外源基因的导入提供理想的受体材料。1972年，Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种，后来在有性亲合及有性不亲会的亲本之间，不同作者又获得了若干其他的体细胞杂种。 （2）花药培养取得显著成绩1964年，Guha和Maheshwari报道，在南洋金花中通过离体花药培养由小孢子直接发育成胚。1967年，Bourgin和Nitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。由于单倍体在突变选择和加速杂合体纯合化过程中的重要作用，这一领域的研究在整个70年代得到了迅速发展，获得成功的物种数目增加到180余种，其中包括很多种重要的栽培植物。烟草、水稻和小麦等的花培育种在中国取得了引人注目的成就。 （3）微繁技术得到广泛应用1960年，Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法。繁殖系数极高。由于这一方法有巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起“兰花工业”。目前，用这种方法繁殖的兰花至少已有35个属150余种。除兰花外，在其他很多观赏植物和经济作物（如甘蔗和草莓等）中，快繁也已达到了工厂化消生产规模，在若干作物中与通过整尖培养进行脱毒相结合，产生了可观的经济效益。 组织培养的应用在自花授粉作物杂交育种中，或在异花授粉作物自交系选育过程中，采用花药培养技术不但可缩短杂合体组合化所用的时间，而且还可以节省土地面积。假定两个杂交亲本在n个独立遗传的位点上彼此不同。通过花药培养，在理论上只要有2n个Fl代花粉植株，就有可得到一个所需要的基因组合，而利用传统有种方法，则至少要有4n个F2植株才能得到这样一个组合。 在某些雌雄异株植物（如石刁柏）中，若把花药培养技术包括到制种程序中去，在后代就有可能得到均匀一致的单性群体，这在有些情况下，可以显著提高经济效益。在远缘杂交中，通过离体授粉或原生质体融合，有能克服受精前障碍，通过幼龄合子胚培养可以克服受精后障碍，通过体细胞融合还有可能制造出细胞质杂种。对于病毒病，可通过茎尖培养消除病毒。这对解决马铃薯种薯退化问题能发挥重要的作用，在其他植物中也可用以建立无毒原种。通过离体诱导不定芽或促进腋芽生枝，可对很多重要的园艺植物和名贵花卉、树种进行快速繁殖。 应用在细胞水平上进行突变体选择的技术，可以在一定程度上使高等植物的育种程序微化，从而大大提高选择效率。在自花授粉作物杂交育种中，或在异花授粉作物自交系选育过程中，采用花药培养技术不但可缩短杂合体组合化所采的时间，而且还可以节省土地面积。 假定两个杂交亲本在n个独立遗传的位点上彼此不同。通过花药培养，在理论上只要有2n个Fl代花粉植株，就有可得到一个所需要的基因组合，而利用传统有种方法，则至少要有4n个F2植株才能得到这样一个组合。 在某些雌雄异株植物（如石刁柏）中，若把花药培养技术包括到制种程序中去，在后代就有可能得到均匀一致的单性群体，这在有些情况下，可以显著提高经济效益。对于无药可治的病毒病，可通过茎尖培养消除病毒，这对解决马铃薯种薯退化问题能发挥重要的作用，在其他很多植物中地可用以建立无毒原种。通过离体诱导不定芽或促进腋芽生枝，可对很多重要的园艺植物和名贵花卉、树种进行快速繁殖。应用在细胞水平上进行突变体选择的技术，可以在一定程度上使高等植物的育种程序微生物化，从而大大提高选择效率。节省时间和土地面积，并且不受季节的限制。体细胞无性系变异是除有性杂交和理化诱变之外的第三个变异来源，这种变异在育种中的利用价值已经引起人们的广泛注意。通过用人工种皮包被体细胞胚制造人工种子。为某些稀有和珍贵物种的繁殖提供了一种高效的手段。特别是在无性繁殖植物中，通过对茎尖分生组织等离体材料进行超低温保存，不但可以大大节省空间，而且还不致受到病虫害的侵袭、并便于无毒种质的国际交换。第二章 实验室构建和操作技术第一节 实验室设计与设备一、实验室设计准备间、缓冲室、接种室、培养间、驯化室、温室 二、设备、仪器（一）设备超净工作台、烘箱、光照培养箱、高压灭菌器、体式显微镜、倒置显微镜、冷光源 、电磁搅拌器、摇床、空调机 、除湿机、冰箱、酸度计、电子天平（0.0001g，0.01g）、电热蒸馏水发生器（二）各类器皿1器皿的类型（1）培养器皿：三角瓶、培养瓶、圆形培养瓶、果酱瓶、试管、L形管和T形管 （2）分注器 （3）刻度移液管（4）微量移液器（5）细菌过滤器（三）器械用具打孔器、镊子、解剖刀、接种针、剪刀、电热灭菌器第二节 外植体的选择与培养一、 外植体的选择植物体的各个部位，如根、茎（鳞茎、茎段）、叶（子叶、叶片）、花瓣、花药、胚珠、幼胚、块茎、茎尖、维管组织、髓部等。植物种类不同，同一植物不同器官，同一器官不同生理状态，对外界诱导反应的能力及分化再生能力是不同的。选择适宜的外植体需要从植物基因型、外植体来源、外植体大小、取材季节及外植体的生理状态和发育年龄等方面加以考虑。 植物基因型植物基因型不同，组织培养的难易程度不同。草本植物比木本植物易于通过组织培养获得成功，双子叶植物比单子叶植物易于组织培养。木本植物中，猕猴桃较易再生植株；而干果类、松树、柏树等就比较困难。植物基因型不同，组培再生途径也不同。如十字花科及伞形科中的胡萝卜、芥菜、芫荽等易于诱导胚状体。茄科中的烟草、番茄、曼陀罗，易于诱导愈伤组织。 外值体来源生长健壮无病虫害的植株上选取发育正常的器官或组织作为外植体，离体培养易于成功。因为，这部分器官或组织代谢旺盛，再生能力强。同一植物不同部位之间的再生能力差别较大，如同一种百合鳞茎的外层鳞片比内层鳞片再生能力强，下段比中段、上段再生能力强。因此，最好对所要培养的植物各部位的诱导及分化能力进行比较，从中筛选合适的、最易再生的部位作为最佳外植体。 对大多数植物来说，茎尖是较好的外植体，由于茎形态已基本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗的重要途径，如月季、兰花、大丽花、非洲菊无病毒苗的生产等。但茎尖往往受到材料来源的限制，为此可以采用茎段、叶片等作为培养材料，如菊花、各种观赏秋海棠、黄花夹竹桃等。另外，还可根据需要选择鳞茎。球茎、根茎类（如麝香百合、郁金香等），花茎或花梗（如蝴蝶兰），花瓣、花蕾（如君子兰），根尖（如雀巢兰属），胚（垂笑君子兰），无菌实生苗（吊兰）等部位作为外植体进行离体培养。外值体大小外植体的大小，应根据培养目的而定。如果是胚胎培养或脱毒，则外植体宜小；如果是进行快速繁殖，外植体宜大。但外植体过大，杀菌不彻底，易于污染；过小离体培养难于成活。一般外植体大小在0.51.cm为宜。具体说叶片、花瓣等约为0.5cm2，茎段则长约 0.5mm，茎尖分生组织带一两个叶原基 0.20.3 mm大小等。取材季节离体培养的外植体最好在植物生长的最适时期取材，即在其生长开始的季节里取样，若在生长末期或已经进入休眠期取样，则外植体会对诱导反应迟钝或无反应。如苹果芽在春季取材成活率为 60，夏季取材下降到 10，冬季取材在 10以下。百合鳞片外植体，春、秋季取材易形成小鳞茎，夏、冬季取材培养，则难形成小鳞茎。外值体的发育年龄外植体的生理状态和发育年龄直接影响离体培养过程中的形态发生。一般认为，沿植物的主轴，越向上的部分所形成的器官其生长的时间越短，生理年龄也越老，越接近发育上的成熟，越易形成花器官；反之越向基部，其生理年龄越小。如在烟草的培养中，植株下部组织产生营养芽的比例高，而上部组织产生花器官的比例高。一般情况下，越嫩，年限越短的组织具有越高的形态发生能力，组织培养越易成功。 二、外植体的灭菌（一） 外植体灭菌的一般步骤1预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌。2将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中，注入75%的酒精溶液埋没材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗一次。3. 将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠)(含有几滴活化剂Tween20或Tween 80)，使材料完全浸没在消毒液中，盖上盖，把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。在灭菌期间须把玻璃瓶摇动23次。 4消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，重复34次。（二）常用灭菌剂的使用及其效果（三）各种外植体的灭菌方法（1）茎尖、茎段及叶片等的消毒植物的茎、叶部分多暴露于空气中，有的具有茸毛、油脂、蜡质和刺等，在栽培上又受到泥、肥中的杂菌污染，所以消毒前要经自来水较长时间的冲洗。消毒时要用70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗23次，然后按材料的老、嫩和枝条的坚实程度，分别采用2%10%的次氯酸钠溶液浸泡1025min，若材料有茸毛最好在消毒液中加入几滴吐温-80，消毒后用无菌水冲洗3次后方可接种。（2）果实及种子的消毒根据清洁度，用自来水冲洗1020分钟，甚至更长时间。再用纯酒精迅速漂洗一下。果实用2%次氯酸钠溶液浸 10min后，用无菌水冲洗23次，就可取出果实内的种子或组织进行培养。种子则要先用10%次氯酸钠浸泡 2030min甚至几小时。对难以消毒的还可用0.l%升汞或1%2%溴水消毒5min。进行胚或胚乳培养，对种皮太硬的种子，可先去掉种皮，再用4%10%的次氯酸钠溶液浸泡810min，经无菌水冲洗后，即可取出接种。 （3）花药的消毒用于培养的花药，实际上多未成熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒就可以了。一般用70%酒精浸泡数秒，然后用无菌水冲洗23次，再在漂白粉清液中浸泡10分钟，经无菌水冲洗23次即可接种。（4）根及地下部器官的消毒根和地下部器官生长于土中消毒较为困难。除预先用自来水洗涤外，还应用软毛刷刷洗，用刀切去损伤及污染严重部位，吸水纸吸干后，再用酒精漂洗。可采用0.1%0.2%升汞浸510min或2%次氯酸钠溶液浸1015min，然后以无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干后可接种。三、外植体的接种和培养（一）无菌操作 植物组织培养的接种是把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织细胞，并把它们转放到无菌培养基上的全部操作过程，是一种无菌技术。整个操作的过程，一切用具、材料、培养基、培养室、工作人员的衣物都要无菌。在操作过程中引起的污染，主要是由材料本身带菌和工作人员本身引起的。 （1）接种室的消毒植物组织培养技术实际上是一种无菌操作和无菌培养技术，做好接种室的消毒是至关重要的。污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子，因此，每次接种前半小时应进行地面的清洁卫生工作，并用70酒精喷雾使空气的灰尘沉降。用紫外线灯照射20分钟。接种前工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗。 （2）工作人员要求入无菌室前，要洗手。入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。（3）材料的切取切取和接种较大的材料肉眼观察即可操作分离，较小的材料需在双筒解剖镜下操作。分离工具一定要放好，切割动作要快，防止挤压使材料损伤而失败。 接种时要防止交叉污染的发生，通常在无菌滤纸上切取材料。将用过而已污染的滤纸继续使用，或已用过的工具未及时消毒而再继续使用，极易产生一连串的交叉污染现象。因此，刀和镊子等接种工具使用一次应放入95%的酒精中浸泡，然后灼烧放凉备用。接种的具体操作左手拿试管或三角瓶，用右手轻轻取下包纸，以纸上的灰尘飞扬，造成污染。将试管或三角瓶的口靠近酒精灯火焰，瓶口倾斜，这时将管口外部在灯焰上燎数秒钟，将灰尘杂物等固定在原处，然后用右手的小指和无名指配合手掌面慢慢取出棉塞或橡皮塞。动作要慢，以免气流冲入瓶中造成污染。将瓶口在灯焰上旋转灼烧，然后用镊子将外植体送入瓶中，材料在培养容器内的分布要均匀，以保证必要的营养面积和光照条件。茎尖、茎段等基部插入固体培养基中、叶片通常将叶背接触培养基(极性)。镊子灼烧后放回支架 ，这时将棉塞在火焰上旋转的烧数秒钟，塞回瓶口，所有的材料接种完毕，包扎好包纸，作好标记，注明材料接种名称、接种日期。（二）外植体培养温度：常保持在232，夜温低12光照时数：大多数情况下为16h（暗培养不需要光照，例如起始培养的前几天不需要光照）光照强度：10003000lx，白色荧光灯，光的作用是满足形态建成的需要（诱导）。相对湿度：培养室的相对湿度一般不控制。根据需要适当调整培养间湿度 定期检查和细胞学观察进行培养的材料，应定期检查，特别是接种后的37天内，要每天检查，主要是检查其污染情况，发现污染材料，应及时处理掉。没有污染的就是得到的无菌材料。如果它们能生长，增殖，并通过继代培养，就建立了无菌培养系。细胞学观察一般每隔35天观察一次，可用肉眼观察其形态变化，也可用显微镜进行观察，如平板培养可进行定点观察，液体培养可用倒置显微镜观察，观察到的结果及时记录。四、外植体的成苗途径1外植体先形成愈伤组织，再分化成完整的植株。（1）在愈伤组织上同时长出芽和根，以后连成统一的轴状结构（较少），育成植株；（2）在愈伤组织中先形成茎，后诱导成根，再发育成植株；（3） 在愈伤组织中先形成根，再诱导出芽，得到完整植株。但在培养中一般先形成根的，往往抑制芽的形成；而相反，一般先产生芽的，则以后较易产生根。2胚状体发生组织培养中再生植株可通过与合子胚相似的胚胎发生过程，即形成胚状体，再发育成完整植株。胚状体可以从以下几种培养物产生：直接从器官上发生；愈伤组织发生；从游离单细胞发生；从小孢子发生。 3.外植体经诱导后直接形成根与芽，发育成完整的植株如茎尖、花芽、叶片、花托、鳞片等组织直接产生小苗，形成小苗（芽）之前也形成少量的愈伤组织。侧芽进行分化和增殖，如菊花、倒挂金钟。在叶外植体的周围再分化出芽，如烟草从鳞茎分化芽或小鳞茎，如百合，水仙4原球茎型大部分兰花的培养属于这一类型。原球茎是一种类胚组织，培养兰花类的茎尖或腋芽可直接产生原球茎，继而分化成植株，也可以继代增殖产生新的原球茎，这取决于培养条件和培养基。不定芽形成-多细胞参与；胚状体形成过程-单细胞参与五、污染的原因及其预防措施（一）污染 是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。污染的原因：从病源菌细菌及真菌两大类污染的途径：1外植体带菌2培养基及器皿灭菌不彻底3操作人员未遵守操作规程等。细菌污染：菌斑呈黏液状物。除材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成成批接种材料被细菌污染外，操作人员的不慎也是造成细菌污染的重要原因。因此接种人员的手应经常用 70酒精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。真菌污染：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后310d才能发现，造成真菌污染的原因多为周围环境的不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养瓶的口径过大、操作不慎等。（二）污染的预防措施1防止材料带菌的措施（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养（2）避免阴雨天在田间采取外植体（3）对于材料内部污染的材料采取特殊方法。 2外植体的灭菌多次灭菌法；多种药液交替浸泡法3金属器械的灭菌： 金属器械一般用火焰灭菌法，即把金属器械放在 95的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。金属器械也可以用干热灭菌法灭菌，即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。4布质制品的灭菌：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的布质品，放入高压灭菌器中，在压力为108kPa，温度为121的情况下，灭菌2030min5无菌操作室的灭菌：无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2的新洁尔灭或 70的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使用前用70的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。6操作人员 六、外植体的褐变及其防止措施（一）褐变的原因1.基因型2.外植体的生理状态3.培养基的成分：无机盐浓度；植物生长调节物质；外植体脱分化条件；转移时间过长。（二）褐变的防止措施1.选择适宜的外植体2.最佳培养基3.连续转移 4.加抗氧化剂5.活性炭 七、培养物的玻璃化现象及其预防措施（一）玻璃化现象 玻璃化苗外形与正常苗有显著差异。其叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低。产生玻璃化苗的因素：激素浓度；琼脂用量；温度；离子水平；光照时间；通风条件等。 （二）产生原因：1激素浓度：激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高（或细胞分裂素与生长素比例高），易导致玻璃化苗的产生。一是培养基中一次性加入过多细胞分裂素，比如 6BA、ZT等；二是细胞分裂素与生长素比例失调；三是在多次继代培养时愈伤组织和试管苗体内累积过量的细胞分裂素。 2琼脂浓度：培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重。随着琼脂浓度的增加，玻璃化苗比例减少。3温度：适宜的温度可以使试管苗生长良好。4光照时间：不同的植物对光照的要求不同，满足植物的光照时间，试管苗才能生长正常。大多数植物在1012h光照下都能生长良好，光照时数大于15h时，玻璃化苗的比例明显增加。5通风条件：气体交换的好坏取决于生长量、瓶内空间、培养时间和瓶盖种类。在一定容量的培养瓶内，愈伤组织和试管苗生长越快，越容易形成玻璃化苗。如果培养瓶容量小，气体交换不良，易发生玻璃化。愈伤组织和试管苗长时间培养，不能及时转移，容易出现玻璃化苗。组织培养所用瓶盖有棉塞、锡箔纸、滤纸、封口纸、牛皮纸、塑料膜等，其中棉塞、滤纸、封口纸、牛皮纸通气较好，玻璃化苗的比例较低。 6离子水平：植物生长需要一定的矿物质营养，但是，如果营养离子之间失去平衡，试管苗生长就会受到影响。植物种类不同，对矿物质的量、离子形态、离子间的比例要求不同。如果培养基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会增加。（三）预防措施1适当控制培养基中无机营养成分；2适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度；3适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度；4增加自然光照，控制光照时间；5控制好温度；6改善培养器皿的气体交换状况；7.在培养基中添加其他物质，加入间苯三酚或根皮苷或其他添加物，可有效地减轻或防治试管苗玻璃化。如添加马铃薯法可降低油菜玻璃苗的产生频率；0.5mgL多效唑或10mgL的矮壮素可减少重瓣丝石竹试管苗玻璃化的发生；1.52.5g/L的聚乙烯醇防治苹果砧木玻璃化 。加入 0.3的活性炭还可降低玻璃苗的产生频率。 第三节 试管苗的驯化及管理一、试管苗的特点1试管苗的生态环境高温且恒温；高湿；弱光；无菌。2试管苗的特点 （1）试管苗生长细弱，茎、叶表面角质层不发达；（2）试管苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿体的光合作用较差；（3）试管苗的叶片气孔数目少，活性差；（4）试管苗根的吸收功能弱。 二、试管苗的驯化驯化的目的：在于提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能力，促使试管苗健壮，最终达到提高试管苗的移栽成活率。驯化的原则：应从温度、湿度、光照及有无菌态等环境要素进行，驯化开始数天内，应和培养时的环境条件相似；驯化后期，则要与预计的栽培条件相似，从而达到逐步适应的目的。驯化的方法：驯化一般在试管苗移栽前进行，首先进行移栽前的驯化锻炼即炼苗，其具体方法是将长有完整试管苗的试管或三角瓶由培养室转移到半遮荫的自然光下进行锻炼，在自然光下恢复植物体内叶绿体的光合作用能力和健壮度，并打开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度，转向有菌，这样幼苗周围的环境就会逐步与自然环境相似。三、试管苗的移栽1常规移栽法 2直接移栽法 3嫁接移栽法：指选取生长良好的同一植物的实生苗或幼苗作砧木，用试管苗作接穗进行嫁接的方法。四、提高试管苗移栽成活率的途径1试管苗的生理状况2植物生长调节物质3无机盐浓度4活性炭 5环境因子6移栽过程中试管苗从无菌向有菌逐渐过渡 第三章 培养基第一节 培养基成分一、培养基的组成无机营养、维生素类、氨基酸、有机附加物、植物生长调节剂、糖类、水、琼脂 无机营养植物组织细胞和整体植株一样，生长时需要一定的无机元素，若这些元素或多或少以至完全缺乏，都会影响细胞的生长和分化。无机物中有13种是植物必须的，即N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl。 I 虽然不是植物必需元素，但几乎所有的培养基中都添加I，有些培养基中还加入钴“Co”镍“Ni”等元素，这些元素加入培养基利于植物组织细胞的在离体条件下生长和发育。 氨基酸氨基酸是蛋白质的组成成分，也是一种有机氮化合物。常用的有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸以及多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。有机氮作为培养基中的惟一氮源时，离体组织生长不良，只有在含有无机氮的情况下，氨基酸类物质才有较好的效果。维生素类能明显地促进离体组织的生长。培养基中的维生素主要是B族维生素，如硫胺素（维生素B1）、吡哆醇（维生素B6）、烟酸（维生素B3，又称维生素PP）、泛酸（维生素B5）、生物素（维生素H）、钴胺素（维生素Bl2）、叶酸（维生素B11）、抗坏血酸（维生素C）等。有机附加物：有机附加物包括有些成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳(CM)、香蕉泥、番茄汁(TJ)、马铃薯泥、苹果汁、生梨汁、西瓜汁、酵母提取液（YE）、麦芽浸出物（ME）等。 糖 类糖在植物组织培养中是不可缺少的。它不但作为离体组织赖以生长的碳源，且还能使培养基维持一定的渗透压（一般培养基渗透压维持在1.54.1MPa）。渗透压对细胞的增殖和胚状体的形成都有十分明显的影响。一般多用蔗糖调节渗透压，其浓度为15，也可用砂糖、葡萄糖或果糖等。琼 脂在固体培养时，琼脂是使用最方便、最好的凝固剂和支持物。琼脂以色白、透明、洁净的为佳。琼脂是一种高分子的碳水化合物，从红藻等海藻中提取，仅溶解于热水，成为溶胶，冷后（40以下）即凝固为固体状的凝胶。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸、过碱也会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。 植物生长调节物质植物生长调节物质对愈伤组织的诱导、器官分化及植株再生具有重要的作用.培养基中的关键物质: 主要包括生长素和细胞分裂素。细胞分裂素细胞分裂素有天然的和人工合成的。常用的有TDZ、玉米素（ZT）、苄氨基腺嘌呤（6BA）、激动素（KT）等。主要生理作用：1促进细胞分裂和扩大（与生长素促进细胞伸长作用不同）2可使茎增粗，而抑制茎伸长3抑制衰老。 活性炭（AC）活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，如防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。这在兰花组织培养中效果更明显。活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根。活性炭对物质吸附无选择性，因此使用时应慎重考虑，不能过量，一般用量为0.10.5。 活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应。 二、培养基的pHpH培养基的pH因培养材料不同而异，大多数植物都要求在pH5.65.8的条件进行组织培养。在培养过程中，培养基的pH不是一成不变的，往往随着培养基的水分和养料的消耗，pH会发生一些变化。配制培养基时，常用0.lmolL的NaOH和0.lmolL的HCl来调节培养基的pH。 pH的高低会影响琼脂的凝固能力。三、培养基的种类、配方及其特点（一）培养基种类据其营养水平分：基本培养基、完全培养基 据其态相分： 固体培养基、液体培养基据其作用分：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基据培养物的培养过程分：初代培养基、继代培养基 组织培养中常用的培养基主要有：MS、 White、 N6、 B5、 Heller、 Nitsch、 Miller （二）常用培养基的特点1MS培养基 这是目前应用最广泛的一种培养基。它的特点是无机盐的浓度高，具有高含量的氮、钾，尤其硝酸盐的用量很大，同时还含有一定数量的铵盐，这使得它营养丰富，不需要添加更多的有机附加物，就能满足植物组织对矿质营养的要求，有加速愈伤组织和培养物生长的作用，当培养物久不转移时仍可维持其生存。 MS培养基大量元素NH4NO3：1650 mg/L KNO3：1900 mg/L MgSO4 . 7H2O：370 mg/L CaC12.2 H2O：440 mg/L KH2PO4：170 mg/L MS培养基的微量元素MnSO4.4 H2O：22.3 mg/L KI：0.83 mg/L H3BO3：6.2 mg/L ZnSO4.7H2O：8.6 mg/L CuSO4.5 H2O：0.025 mg/L Na2MoO4.2 H2O：0.25 mg/L CoC12.6 H2O：0.025 mg/LMS培养基的铁盐FeSO4.7H2O：27.8 mg/L Na2EDTA：37.3 mg/LMS培养基的有机物烟酸：0.5 mg/L 盐酸吡哆醇（VB6）：0.5 mg/L 盐酸硫胺素（VB1）：0.1 mg/L 甘氨酸：2 mg/L 肌醇：100 mg/L2. White培养基又称 WH培养基是1943年由White设计的，1963年做了改良。特点：无机盐浓度较低。它的使用也很广泛，无论是生根培养还是胚胎培养或一般组织培养都有很好的效果。3N6培养基 特点： KNO3和（ NH4）2SO4含量高，不含钼。目前在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养。 4B5培养基 特点：含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。铵盐可能对不少培养物的生长有抑制作用，但它适合于有些植物如双子叶植物特别是木本植物的生长培养基的选择在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好先由一种已被广泛采用的基本培养基（如MS或B5）开始。当通过一系列的实验，对这种基本培养基做了某些定性和定量的小变动之后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基。在改动一种培养基的时候，无机成分和有机成分应当分别处理。 在培养基中最常改动的因子是生长调节物质，尤其是生长素和细胞分裂素。开始时，可以选择一种基本培养基，以及不同浓度的激素，比如说，各有5种不同浓度（0，0.5，2.5，5，10molL）的某种生长素（例如 NAA）和某种细胞分裂素（例如6-BA）。这两种激素5种浓度的所有可能组合，即构成了一个具有25项处理的实验。由这25项处理中选出最好的一个，然后在保持浓度不变的情况下，再试验其他种类的生长素和细胞分裂素。当改变细胞分裂素的种类时，保持生长素不变，反之亦然。例：2种激素5种浓度的实验组合四、培养基的配制（一）母液的配制和保存经常使用的培养基，可先将各种药品配成浓缩一定倍数的母液，放入冰箱内保存，用时再按比例稀释。母液要根据药剂的化学性质分别配制。一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素、氨基酸等母液，其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。 大量元素的母液可以配制成10倍、20倍。微量元素可配成50或100倍浓度的混合母液。KI可以单独配成母液。铁盐也容易发生沉淀，需要单独配制。一般硫酸亚铁（FeSO47H2O）和乙二胺四乙酸钠（Na2EDTA）配成100倍浓度的铁盐螯合剂比较稳定，不易沉淀。氨基酸可以和维生素一起配成100或200倍液，也可将它们中的几种有机成分分别配制。植物生长调节物质也可以分别配制成母液，储存于冰箱。一般浓度为0.11mgml。IAA、NAA、IBA、2,4-D之类生长素，可先用少量0.lmol/L的HCl 或95的酒精溶解， KT、BA等细胞分裂素则可用少量0.lmol/l的NaOH加热溶解，然后加水定容 。 （二）培养基的配制方法将配制好的母液按顺序排列，先取适量的蒸馏水放入容器，然后依次用专用的移液管按需要量吸取各种母液，并混合在一起。再将琼脂（事先加热溶解）和糖加入其中，最后加蒸馏水定容至所需体积。随即用0.lmol/l的NaOH和HCl将pH调至所需的数值，然后分装到培养瓶中。培养基的pH大多数植物都要求在pH5.65.8 计算：制做3L MS+6-BA2mg/l+NAA0.1mg/l+蔗糖3%+琼脂0.6% 需要母液各多少？大量元素母液（10倍） ？微量元素母液（100倍） ？铁盐母液（100倍） ？有机物质母液（100倍） ？6-BA母液 ( 1mg/ml) ？NAA母液( 0.1mg/ml) ？蔗糖 ？琼脂 ？母液取用量（mL）配制的培养基体积（mL）/母液的扩大倍数激素母液用量(ml)=激素使用浓度(mg/l)培养基配制体积(L)/激素母液浓度(mg/ml)（三) 培养基的灭菌培养基一般采用湿热灭菌法，压力108kPa、温度为121时，维持20min，即可达到灭菌的目的。若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失效。但时间过短，不能保证灭菌的效果，易引起培养基污染。培养基储藏在410的条件下。过滤灭菌某些生长调节物质（如GA3、ZT、IAA、ABA）、尿素以及某些维生素等，遇热时容易分解，不能进行高压灭菌。当使用这类化合物时，可将除这种化合物之外的全部培养基装于一个三角瓶中进行高压灭菌，然后置于超净工作台上的无菌条件下使之冷却。然后将这些化合物溶液通过滤膜过滤灭菌，再将之加入经高压灭菌过的培养基中。如果是要制备固态培养基，须待培养基冷却到大约40时（即恰在琼脂凝固之前）再这些遇热分解化合物；如果是要制备的是液体培养基，则待培养基冷却到室温后再加。在进行溶液过滤时，可使用孔径为0.22m或更小的细菌滤膜。将滤膜安在适当大小的支座上，以铝箔包裹起来，或装入一个大小合适的有螺丝盖的玻璃瓶内，进行高压灭菌。过滤器的灭菌温度非常重要，不应超过121 。固体培养基和液体培养基的特点固体培养基的特点：使用简便，一般用于组织、愈伤组织、短枝、茎尖等材料的培养。特别适合植物的快速繁殖。缺点：一块外植体只能部分接触培养基，不能浸没在培养基中，结果培养物上下部因接受养分不匀而形成差异，不易使细胞群体保持一致。液体培养基：提供比较均匀的营养，而且细胞的增殖速度快，一般用于细胞，原生质体的培养，也可用于愈伤组织的培养，胚状体等材料的继代培养。第四章 植物细胞培养第一节 单细胞培养细胞培养的概念：人工培养从植物或培养物上游离的细胞或小细胞团的实验方法观点：(Haberlandt：) 高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞首次进行离体细胞培养关于单离植物细胞培养实验我愿意指出：在我的培养实验中，虽然经常观察到细胞的明显生长，但从未观察到细胞分裂。发现单细胞培养的条件，将是未来培养试验的难题。1. 取材问题高度分化的细胞。2. 培养基问题过于简单，没有诱导成熟细胞分裂所必须的生长激素一、单细胞的分离由完整的植物器官分离单细胞；由培养组织(如愈伤组织)中分离单细胞1、由完整的植物器官分离单细胞叶片是分离单细胞的最好材料机械法、酶解法机械法第一种方法：用刀片刮叶片研究者和时间：Ball&Joshi (1965)Noggle (1967)Joshi &Ball (1968)研究材料：花生成熟叶片具体方法：取叶片、撕去下表皮、露出叶肉细胞、用解剖刀刮下细胞第二种方法：叶片研碎、离心取叶片、加研磨介质、研碎成粉、过滤、离心只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞取叶片、加果胶酶、过滤离心机械法和酶解法比较机械法：1细胞不受到酶的伤害2不用质壁分离3细胞产量低4细胞易破