基因突变的蛋白质效应.doc

母源性3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症临床及基因突变分析【摘要】 目的 报告5例母源性3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（maternal 3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency，MCCD），通过基因突变分析证实其临床诊断。 方法 将串联质谱新生儿筛查发现3-羟基异戊酰肉碱（C5-OH）增高的5例新生儿及其母亲纳入研究。用尿气相色谱质谱分析进行MCCD临床诊断；基因突变检测及功能分析明确诊断。 结果 （1）发现5例无症状母亲血C5-OH浓度明显增高，尿3-羟基异戊酸、3-甲基巴豆酰甘氨酸增高，诊断为良性MCCD。其新生儿血C5-OH浓度增高，3例随访后浓度逐步下降或达正常。（2）发现4种MCCC1基因新变异：c.ins1680A（25%）、c.203CT/p.A68V、c.572TC/p.L191P、c.639+5GT和2种MCCC2基因突变c.1406GT/p.R469L（新变异）及 c.592CT/p.Q198X。新变异可能影响蛋白结构和功能。结论 对筛查血C5-OH增高的新生儿母亲应常规检测以诊断母源性MCCD。MCCC1基因突变多见。【关键词】3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症；3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶；基因突变；质谱分析3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（3-Methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency，MCCD）（OMIM 210200/210210）是一种亮氨酸代谢障碍所致的常染色体隐性遗传的有机酸代谢缺陷病，1970年由Eldjarn等首次报道1。因基因MCCC1（MIM*609010）或MCCC2（MIM*609010）突变导致亮氨酸代谢途径中3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶（3-Methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase，MCC）缺乏，3-甲基巴豆酰辅酶A不能转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A而堆积，导致血3-羟基异戊酰肉碱（3-hydroxy-isovalerylcarnitine，C5-OH）增高、尿3-甲基巴豆酰甘氨酸（3-methylcrotonyl-glycine，3-MCG）和/或3-羟基异戊酸（3-hydroxy isovalerate，3-HIVA）代谢产物增多。患者的临床表型变异较大，多数无症状，少数可表现为严重的神经系统受损2。部分发达国家于20世纪90年代初应用串联质谱（tandem mass spectrometry，MS/MS）开展新生儿筛查，统计显示MCCD发生率约为1/36 0002-4。国内研究相对滞后，我们自2003年起率先在国内开展MS/MS新生儿筛查，对血C5-OH浓度增高的新生儿，常规对其父母进行MS/MS分析，迄今已发现5例母源性MCCD。而国内除个别MCCD病例报道外5-6，尚未见母源性MCCD及基因研究报道。本文报道5例母源性MCCD临床、生化表型及转归，以及基因突变分析结果，以从分子生物学水平证实其临床诊断。1 对象与方法1.1 对象 2003年至2012年9月，我们对491 700名新生儿采用MS/MS进行遗传代谢病筛查，发现60余例新生儿血C5-OH浓度高于正常切值0.6 mmol/L，对其父母进行MS/MS分析，发现5例母亲（22 31岁）血C5-OH浓度明显增高（5.11 21.77）mol/L，其中4例伴游离肉碱（free carnitine，C0）降低（2.6 6.76）mol/L。5例母亲平素体健、孕期及分娩均无临床症状；分娩的新生儿筛查时血C5-OH浓度增高（1.63 11.43）mol/L，临床无症状（表1）。1.2 方法1.2.1 临床诊断及随访：（1）采用尿气相色谱质谱仪（gas chromatography mass spectrometry，GC/MS）对血C5-OH增高相关的有机酸代谢病进行诊断与鉴别诊断；（2）生物素酶活性测定以排除生物素酶缺乏；（3）生化检测包括乳酸、血氨、肝肾功能、血气、酮体等；（4）每3月 1年对5例新生儿随访，评估临床症状、生长及智能发育等，复查血MS/MS、尿GC/MS，了解临床转归。1.2.2 基因分析 基因突变检测 在知情同意的原则下，采集外周血抽提父母及新生儿、50个正常对照者基因组DNA；参考文献7和Primer Premier 5软件设计引物，扩增MCCC1基因19个外显子和MCCC2基因17个外显子及两端内含子序列；按常规方法和反应条件进行PCR扩增、测序，Chromas软件进行突变分析（参考MCCC1 GenBank：NM_020166.3；MCCC2 GenBank：NM_022132.4）。基因新变异分析：（1）正常对照者100个等位基因的相关片段测序分析以排除多态性可能。（2）PCR-限制性片段长度多态性分析（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）：采用BstX、AlwN两种限制性内切酶对c.203CT/p.A68V、c.572TC/p.L191P错义突变酶切分析。（3）逆转录PCR测序：提取患者RNA，经试剂盒TaKaRa PrimeScript RT Master逆转录成cDNA进行测序分析，以验证剪切突变c.639+5GT。（4）采用软件Clustal（1.81）对不同物种MCCC1和MCCC2氨基酸序列比对分析，以了解新型错义突变位点氨基酸的保守性。（5）PolyPhen-2（http//pph2）、SIFT（/）、UniProt（/）和PDB（/pdb/home/home.do）软件分析新变异是否对蛋白质的结构和功能产生影响。2 结 果2.1 临床诊断及随访2.1.1 母亲MCCD诊断 5例母亲血MS/MS检测结果显示C5-OH浓度增高或伴C0降低，血异戊酰烯肉碱、丙酰肉碱、丙酰肉碱/乙酰肉碱浓度均正常；4例尿GC/MS结果显示3-MCG增高为2.18 272，3-HIVA增高为3.86 499（表1），无3-羟基丙酸、甲基枸橼酸、3-羟基-3-甲基戊二酸、3-甲基戊烯二酸、2-甲基-3-羟基丁酸及酮体等排出；生物素酶活性正常；根据上述排除其它C5-OH增高相关的有机酸代谢病，结合临床无症状，诊断为良性MCCD。2.1.2 子女诊断及随访 5例新生儿筛查时血C5-OH浓度（1.63 11.43）mol/L，出生2周召回时降至（1.01 9.37）mol/L（下降36.14%），2例尿GC/MS分析显示3-HIVA或3-MCG略高，结合临床无症状、生化检查正常，诊断为母源性MCCD。例1和例2分别于生后2.2岁及4月随访时，血C5-OH降至正常；例4生后1.5月末次随访时，血C5-OH由11.43 mol/L降至5.81 mol/L（下降49.17%）；例2生后3周复查尿GC/MS时，尿3-HIVA降至正常；例4尿3-MCG仍微量排出；余2例未复查血尿。所有新生儿末次随访年龄（1-38）月时仍无临床症状，生长及智能发育正常。2.2 基因分析2.2.1 基因突变 4例母亲及子女接受了基因分析：突变检出率为87.5%（7/8）；共检出4种MCCC1突变：其中c.ins1680A突变频率最高，占25%（2/8），其他3种为c.203CT/p.A68V、c.572TC/p.L191P以及c.639+5GT，均未见报道。共检出2种MCCC2突变：c.1406GT/p.R469L（未报道）及c.592CT/p.Q198X（已报道）。 4例子女均携带来源于母亲的一个杂合突变。（表1，图1）表1 5例MCCD母亲及子女生化和基因突变结果 病例血C5-OH浓度血C0浓度尿3-HIVA尿3-MCG母突变1母突变2子女突变子女转归（C5-OH浓度）母 子/女母 子/女母 子/女母 子/女核苷酸改变 突变效果核苷酸改变 突变效果 117.16 4.666.76 ND499 N60 Nc.203CT* p.A68V*c.ins1680A* 插入突变同突变12.2岁降至正常 25.11 1.63N N20.3 8.72.18 Nc.572TC* p.L191P*c.639+5GT* 剪切突变同突变14月降至正常 35.62 2.346.55 ND3.86 N35 Nc.592CT p.Q198X c.1406GT* p.R469L* 同突变1未随访 421.77 11.434.36 N12.59 N272 1.33c.ins1680A* 插入突变同突变11.5月下降49 % 510.99 4.852.6 NND NND NNDNDND未随访 正常值0.6 mol/L10-60 mol/LT突变型和野生型逆转录测序； 1d：例3母子MCCC2突变；1e：例4母女MCCC1突变2.2.2 基因新变异分析 正常对照者100个等位基因中未检出5种新变异，排除多态性可能。 PCR-RFLP分析：新变异c.203CT和c.572TC用BstX、AlwN两种内切酶进行酶切，结果提示BstX将对照者及父亲酶切产生136 bp、117 bp两个片段，c.203CT突变的等位基因由于不能被酶切而产生1个253 bp片段，故携带此杂合突变的母子将酶切产生253 bp、136 bp和117 bp 三个片段（图2a）；AlwN将对照者酶切成137bp、128 bp两个片段，c.572TC突变的等位基因不能被酶切而产生1个265 bp片段，携带此杂合突变的母子经酶切产生265 bp、137 bp和128 bp三个片段，未获得父亲DNA（图2b）。图2 PCR-RFLP酶切图 2a：BstX对例1 c.203CT突变酶切；2b：AlwN对例2 c.572TC突变酶切；P：母亲患者；Z：子女；F：父亲；N：对照者 剪接突变c.639+5GT经逆转录cDNA反向测序，结果显示外显子6出现148个碱基杂合缺失而引起剪接错误（图1c）。不同物种氨基酸序列比对：2种MCCC1错义突变（c.203CT/p.A68V，c.572TC/p.L191P）及1种MCCC2错义突变c.1406GT/p.R469L经6个不同物种与人类基因相应位点氨基酸比对分析，MCCC1第68、191位和MCCC2第469位均为高度保守氨基酸（图3）。图3 3种新错义突变在不同物种中的氨基酸序列比对 PolyPhen-2、SIFT、UniProt和PDB分析 3种新型错义突变经PolyPhen-2评分0.9 1，SIFT评分均为0，突变导致蛋白的侧链结构发生变化，可能改变蛋白构象而致病：（1）c.203CT/p.A68V突变位于生物素羧化作用部位（蛋白质活性部位），突变导致68位丙氨酸变为缬氨酸，侧链结构改变并与73位缬氨酸主链形成新氢键，氨基酸残基较野生型增大（图4a）；（2）c.572TC/p.L191P突变位于ATP结合和生物素羧化作用部位（蛋白质活性部位）且位于肽链-螺旋结构区，突变导致191位亮氨酸变为脯氨酸，侧链结构改变并与187位丝氨酸主链形成新氢键，氨基酸残基较野生型减小（图4b）；（3）c.1406GT/p.R469L突变位于羧基转移酶部位，突变导致469位精氨酸变成亮氨酸，侧链结构改变与468位丙氨酸主链间氢键消失，氨基酸残基较野生型减小且具有更强的疏水性，电荷显中性（野生型带正电）（图4c）。图4 蛋白质二级结构图 红色：突变位点氨基酸主链；粉色：侧链；绿色虚线：氢键；粉色虚线：突变产生的新氢键；4a：c.203CT/p.A68V野生型和突变型；4b：c.572TC/p.L191P 野生型和突变型；4c：c.1406GT/p.R469L野生型和突变型3 讨论MCCD的临床表型差异较大，又分为有症状型，无症状型和母源型3种。严重者在新生儿期表现为喂养困难、阵发性呕吐、腹泻，抽搐、嗜睡、昏迷、呼吸暂停、生长发育迟缓、肌张力异常等；临床以无症状型多见2-4；母源型较少，即母亲为MCCD，因其增高的C5-OH通过母乳或胎盘传输给新生儿8，导致新生儿筛查时血C5-OH增高，对父母检测后才发现母亲是MCCD患者。有些母亲患者在禁食或高蛋白质饮食下、尤其在孕期可出现肌病、肝酶增高、脂肪肝和易疲劳等症状。Gibson等9率先报道了4例MCCD母患共14次孕期及分娩史，其中仅1例曾出现上诉症状。Koeberl等10报道4例MCCD母患，除1例曾在高蛋白饮食后出现呕吐外，其余均无症状。母源性MCCD新生儿通常生后筛查时血C5-OH浓度不同程度增高，随访一段时间可恢复正常9-11。本文在国内首次报道了5例母源性MCCD，母亲为良性MCCD，受影响的新生儿出生3天血C5-OH不同程度增高，随访后逐步下降或达正常（最长随访至3岁），均无症状，生长及智能发育正常，诊断为母源性MCCD（暂时性）。因此，对新生儿筛查发现血C5-OH增高者，需常规对其母亲检测以诊断母源性MCCD。MCCD与下列4种C5-OH增高疾病的鉴别主要依靠尿GC/MS。（1）多种酰基辅酶A羧化酶缺乏症：除尿3-HIVA及3-MCG增高外，3-羟基丙酸、甲基枸橼酸、甲基巴豆酰甘氨酸及酮体增高12；（2）3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症：尿特异性3-羟-3-甲基戊二酸增高；（3）3-甲基戊二酰辅酶A水解酶缺乏症：3-甲基戊烯二酸、3-甲基戊二酸增高；（4）b-酮硫解酶缺乏症：大量酮尿及2-甲基-3-羟基丁酸增高。我们报告的MCCD母亲患者及其子女的血、尿质谱分析均排除了上述其他4种有机酸代谢病。无临床症状的MCCD患者无需治疗。对于有症状者可给予限制亮氨酸、蛋白质饮食，而甘氨酸或生物素治疗通常无效；对于伴游离肉碱缺乏者需要补充左旋肉碱；急性发作期患者应给予葡萄糖、纠酸、维持电解质平衡等治疗13。MCCC1和MCCC2基因突变均可导致MCCD。MCCC1定位3q25-27区，包含19个外显子，长度为2580 bp，编码725个氨基酸多肽。MCCC2定位5q12-q13.1区，包含17个外显子，长度为2304 bp，编码563个氨基酸多肽。MCCC1包含共价连接生物素的辅基及碳酸氢盐和ATP的结合位点，MCCC2则包含酰基辅酶A酶作用物的结合位点即主要结合甲基巴豆酰辅酶A3。目前已报道MCCC1和MCCC2基因突变各60余种14-16，c.1155AC（p.R385S）为较常见的热点突变。2012年韩国首次报道c.838GT（p.D280Y）为其热点突变，日本于2007年也报道1例携带此突变17。本研究发现3例母亲携带2个基因突变，1例仅找到1个杂合突变，可能因另一突变隐藏于非编码区无法经PCR直接测序检出或其他不确定因素造成；新生儿均携带来自母亲的1个杂合突变，为杂合子。MCCC1突变为MCCD患者较常见的突变。已报道突变c.592CT/p.Q198X见于1例无症状新生儿筛查发现的MCCD患者，该突变位于羧基转移酶位点使198位谷氨酰胺变为终止密码子，影响了蛋白结构和功能17。已发现的5种新变异均被证实可能对蛋白结构和功能产生影响：c.203CT/p.A68V突变将产生新的氢键，氨基酸残基较野生型增大，可能无法匹配蛋白质的核心区域而影响蛋白的活性；c.572TC/p.L191P突变也产生新的氢键，氨基酸残基较野生型减小，可能引起蛋白核心区域空缺，且突变后脯氨酸破坏-螺旋结构，对蛋白质结构造成严重影响；c.1406GT/p.R469L突变引起氢键消失，氨基酸残基较野生型减小，疏水性增强，电性改变可能造成和其他分子相互作用消失；c.ins1680A引起突变位点后第9个氨基酸提前出现TAA终止密码子造成蛋白结构改变；剪切突变c.639+5GT使外显子6杂合缺失引起剪切错误，造成蛋白结构改变。因此，上述5种未报道的变异很可能是致病新突变，需进一步体外蛋白功能表达研究验证。已有的研究提示MCCD表型和基因型间无明确的相关性，调控基因和环境因素等也可能影响表型。例如，较常见的MCCC1突变p.R385S可导致严重的临床表型，但也可无症状，故难以通过基因型预测临床表型3,11。因本研究病例较少，临床无症状，难以分析基因型和表型的关联性，尚需累积更多的病例进行分析。参考文献1 Eldjarn L, Jellum E, Stokke O, et al. -Hydroxyisovaleric aciduria and -methylcrotonylglycinuia:a new 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