抗感吡虫啉褐飞虱种群抑制消减杂交cDNA文库的构建.doc

抗感吡虫啉褐飞虱种群抑制消减杂交cDNA文库的构建 fl国水稻科学(Thin JR s(i)，2O1226 (1)2126httPtf|ricesci I)()1103969jissn1OO17216xx01005抗感吡虫啉褐飞虱种群抑制消减杂交eDNA文库的构建21张珏锋何月平陈建明陈列忠(浙江省植物有害，卜物防控霞点实验室省部共建国家重点实验培育基地浙江省农、科学院植物保护与微生物研究所，浙江杭州3l0021；通讯联系人，Emailchenjm63yahooCOFI I)Construction ofSuppression SubtractiveH ybridizationcDNA Libraryof Imidaclopridresistant andIm idaclopridsusceptible BrownPlanthopper ZHAN(、j-J Uefeng，H EYueping，CHEN Jianming，CHEN Iiezhong(State KeyLaboratory BreedingBaser ZhejiangSustainahle Pesl and1)isease(7ontt“Institute0f PlantProtectiol1and MrJ obiologZh tangAtademY0厂A r(ultural S(iem，Hangtou310021。 (ina；(、rr7l，author，E mail(，lenjm63yahoo(1ilt(”)ZHANG Juefeng，HE Yueping，(；HEN Jianming，el a1Construction ofsuppression subtractivehybridization eDNAlibrary Of im idacloprid resistant and imidaclopridsusceptible brown planthopperChin JRice Sci，xx，26 (1)2126AbstractThe forwardand reverse subtracted eDNAlibraries ofimidacloprid resistantandimidaclopridsusceptible brown planthopper(Nilaparvata lugensSti l1)populations wereconstructed by suppression subtractivehybridization(SSH)，and therelative genesregulated byimidacloprid wereclonedThe resultsshowed that120positive clonesnhtained represented92different singlegenes。 in which17shared higherhomology withknown proteingenes ofantmain inthe(；enBankThese singlegenes involvedsignal transduetion，biotic andabiotic stress，reproduction，and etcKey wordsimidacloprid；Nilaparvala lugens；suppression subtraclivehybridization；gene clone张珏锋，何月平，陈建明，等抗感吡虫啉褐飞虱种群抑制消减杂交eDNA文库的构建中国水稻科学，2O12，26 (1)2126摘要采用抑制消减杂交(SSH)法构建了对吡虫啉敏感和抗吡虫啉褐虱种群的正反差减c1)NA文库，克隆了受吡虫啉调控的午fj关基。 结果表明，筛选到的】2O个刚性兜隆代表92个瓦不重复的单丛因，其中l7个与动物的已知蛋自毖凶存在较高的源性。 筛选剑的单毖因，分别涉及信号传导、生物及诈牛物胁迫、牛殖等。 关键词吡虫啉；褐飞虱；抑制消减杂交；牲凶克隆351l23；S4823A1OO172l6(2()12)01-002106褐飞虱(Nilapart U(dta lugIS StM)是我国和东南亚国家水稻生产的一种重要远距离迁飞性害虫。 在我国每年发生面积约1300万2000万hm，约占水稻种植面积的50，年均损失稻谷lO亿15亿kg。 日前在生产上，化学农药仍是防治褐飞虱的主要手段之一ll。 吡虫啉是第一个成功开发的新烟碱类杀虫剂，对同翅目昆虫(如飞虱、蚜虫等)具有防效好、持效期长等优点。 由于长期频繁使用吡虫啉，导致褐飞虱对吡虫啉产生严重抗药性，其抗药性增加了70475倍。 因此，延缓和治理褐飞虱的抗药性是我国水稻生产中急需解决的重要课题。 研究发现，褐飞虱对吡虫啉产生抗性的机制可能与酯酶(羧酸酯酶)、谷胱甘肽S一转移酶和细胞色素P450单加氧酶等解毒酶的解毒作用增强，乙酰胆碱受体(nAChR)敏感性下降有关”。 刘泽文等进一步研究认为，抗吡虫啉褐飞虱种群nAChR的功能亚基Nl0c1和Nlu3抗性相关点Y151S的氨基酸突变，但抗吡虫啉褐飞虱种群体内足否存在其他特异表达基因，以及这些基因在褐飞虱对吡虫啉抗性发展中起何作用2叭卜0316；修改稿收到日期2O110826基金项目竭家f1然科学金资助项卜1 (30771411)；浙江省fj然科学基金资助项目(Y3o7125)；罔家科技支撑汁划资助项目(20()6BAI)o8Ao103)；浙江省科技创新队资助项I=_l(20l oI5()O28)。 22仍不清楚。 抑制消减杂交(suppression subtractivehybridization，SSH)技术”是以消减杂交和抑制PCR相结合而发展起来的一种克隆新基因的方法，效率高且具有高度的敏感性，即使低丰度的mRNA也能被检出，一次SSH反应可以同时分离几十或成百个差异表达基因。 本研究通过将抗吡虫啉褐飞虱种群和敏感褐飞虱种群的cDNA进行相互SSH，构建褐飞虱抗感吡虫啉差异表达的消减cDNA文库，并大规模筛选抗性差异表达基因，旨在为褐飞虱抗吡虫啉相关基因的功能调控研究提供参考。 1材料与方法11材料供试品种为感虫TN1，分批分期播种。 当秧苗生长至45叶期移栽到大田，肥水管理按常规进行，取分蘖期稻株移入盆钵中备用。 供试虫源对吡虫啉敏感褐飞虱种群由浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所植保工程研究室提供，在不接触任何药剂的条件下一直用TN1水稻苗饲养繁殖；抗吡虫啉褐飞虱种群由敏感种群在室内用吡虫啉连续筛选50余代获得，抗性倍数已达400倍以上。 室内饲养条件为温度26C05l C、光照时间14h、相对湿度8O5，取成虫羽化48h内的雌成虫用于试验。 12方法】21样品总RNA提取以对吡虫啉敏感的褐飞虱种群为Tester，抗吡虫啉褐飞虱种群为Driver。 总RNA采用AxyPrep MultisourceTotal RNAMiniprep Kit(Axygen)试剂盒进行提取，溶于30f fI Tris缓冲液中，如果电泳呈现出28S和18S两条特异性条带，表明总RNA完整且质量较高，可用于后续研究。 122cDNA第l链的合成吡虫啉敏感褐飞虱种群(Tester)和抗吡虫啉褐飞虱种群(Driver)RNA(1020f ig总RNA)10uI，Fs()ligo(20ftmolI)05uI，TsI a(2O,molI)O5,IdNTPs(10mmolI)10f fI，5cDNA第1链缓冲液20f fI，DTT10,I，RNA酶抑制剂(40UI)o25f fI，SuperScript II反转录酶(200uI)075I。 RTPCR反应条件如下42C下6O min；70C下l5min。 I【R产物采用9O p-ITris(5mmolI，pH80)溶解。 中国水稻科学(Thin J尺s(i)第26卷第1期(xx年1月)123双链eDNA的扩增反应采用下列引物进行吡虫啉敏感褐飞虱种群(Tester)和抗吡虫啉褐飞虱种群(Driver)双链cDNA的合成反应正向引物SP6T7序列为5，_CAT TTA(；GTGACACTATAGAGTA ATAC(；ACTCA CTATAGGG一3；反向引物3ap序列为5，_TGGTT GGACTCGGTTTGGACG一3l”1。 最佳循环数的确定去离子水325I，10Buffer5,I，dNTPs(25SP6T7(10f fmoll)l mmolI)8f fI，正向引物L，反向引物3ap(10mo|I)l IJ，模板DNA2L，Taq酶(50Uf fI)05I。 95C下l min；X个循环(95C下30s；60C下30s；68C下6min)；X一2O、 25、30。 最佳循环数确定后PCR去离子水130I，10缓冲液20f fI，dNTPs(25mmolI)32I，正向引物SP6T7(10,t oolI)40f fI，反向引物3ap(10,molI)40“L，模板DNA Tester(Driver)cDNA8I，Taq酶(50utI)20ptI。 采用QIAquick PCRPurification Kit(Qiagen)进行纯化回收，35I洗脱液进行后续实验。 124外转录实验分别采用RiboMax Iarge ScaleRNA Production SystemSP6和RiboMax Iarge ScaleRNA ProductionSystemT7(Promega)进行Tester和Driver RNA合成，然后采用RNeasy MinEluteCleanup Kit(Qiagen)进行纯化。 125抗性种群组Tester逆转录实验200I PCR管中加入下列试剂体外转录抗性种群组RNA(05pgpd)l L，T7()ligo d(T)(20f fmolI)05f fI，dNTPs(10mmoll)10tll，5cDNA第1链缓冲液20xl，DTT10L；RNase(40U“L)025f fl，SuperScript n反转录酶(200UI)075I，力口入DEPCH()充至010fI。 RTPCR条件如下42下60min；70C下l5min。 126Driver和Tester杂交反应消减体系(10I)包括1o杂交缓冲液1fI，Tester cDNA(体外转录)2I，I)river RNA(15f ig)3I，加入DEPCH()补足到10III。 反应条件为88C下2min，变性，55C下杂交16h。 127DSN酶消化反应酶切体系(20ptI体系)包括10DSN缓冲液20L，I)SN(02Ul)(Evrogen)10上L，I)EI CH()170III。 在新管中配制以上试剂，预热到张珏锋等抗感吡虫啉褐虱种群抑制消减杂交eDNA文库的构建65C，加入上述消减产物(10I)中，65C下反应3O r ain。 反应后加入15I EDTA (100)以及20I SDW，68C下l0min终止反应。 128消减产物的纯化和扩增PCR扩增包括3个步骤。 第1轮PCR去离子水3417I，10缓冲液50f fI，dNTPs(25mmolI)80f fI，S()I引物(10f fmolI)033f fl，PI引物(10f fmoll)10I，消减产物DNA10f fI，Taq酶(5UI)05f fI。 PCR条件如下95C下1r ain；25个循环(95下30S；60C下3O S；68C下5min)。 第2轮PCR去离子水l625f fI，10缓冲液25f fI，dNTPs(25r etoolL)40f fI，PI引物(10f fmolI)10f fl，第1轮PCR产物(稀释10倍)l f fI，Taq酶(5UuI)025f fI。 PCR条件如下95C下1r ain；28个循环(95C下30S；6O C下30S；68C下5min)。 第3轮PCR去离子水3470I，10缓冲液50f fI，dNTPs(25mmolI)80f fl，SalT7P引物(10f fmolI)08“I。 第2轮PCR(稀释10倍)l10肚I，Taq酶(5UuI)o5o ffI。 PCR条件95C下l min；27个循环(95C下30S；60C下30S；68C下5r ain)。 】29消减产物的连接、转化和测序消减产物PCR扩增后采用QIAquick GelExtraction Kit(Qiagen)切胶回收500bp以上的片段，然后和pUCmT载体连接，通过M13F(5，_GTAAA AC(；AC(；(CA(一3)和M13R(5r_CA(AAACA GCTATGAC一3)【“进行PCR筛选检测。 1210消减效率检测采用敏感种群组双链cDNA和抗性种群组双链cDNA以及消减后PCR产物各50ng为模板，进行PCR扩增。 2结果与分析21RNA的提取和电泳检测总RNA溶于3O ffl Tris中，结果显示电泳呈现出28S和18S两条特异性条带，l8S和28S rRNA带型完整，边缘清晰锐利(图1)，表明提取的总P,NA没有发生降解，总RNA完整且质量较高，可用于后续研究。 22双链cDNA的扩增反应电泳检测显示，褐飞虱双链eDNA条带呈弥散型，长度约分布于50040o0bp，中问有若干较亮28S18S1一敏感种群(Tester)；2一抗性种群(Driver)。 1，Susceplible populatkm(Tester)；2，Resistant populalion(Driv er)图l总RNA电泳Fig1The results of totalRNA eIectr0phoresis条带，表明不同大小和丰度的mRNA都得到了有效的扩增，在100bp(引物二聚体、多聚体)附近无亮带，表明引物聚合物较少(图2)。 23消减产物的连接、转化和测序结果在第3轮PCR中，通过对不同循环数PCR扩增产物电泳结果测试，最终确定消减PCR最佳循环数为27。 构建好差减杂交文库后，从正反向文库中随机挑选26个克隆进行PCR检测。 结果表明，差减文库中克隆的插入片段长度分布范围在2002000bp(图3)。 这说明，cDNA片段与载体的连接效率好，文库中阳性克隆所占比例较高。 24消减效率检测为进一步检测差减的效率，分别以差减及未差减PCR产物为模板，用内参基因GAPDH?进行PCR扩增，分别在l 5、2O、25和30次循环结束时从反应体系中吸取5ffI电泳检测。 电泳结果显示，与未差减组P(R产物相比，差减cDNA的第2轮PCR产物在扩增30个循环后才可见较弱的条带，表明差减产物中组成型表达基因的丰度已大大下降，说明具有很高的差减效率(图4)，达到建库的要求。 25测序及同源性分析所测序列在GenBank数据库中进行同源性查找。 结果表明，筛选到的l20个阳性克隆代表92个互不重复的单基因，其中17个与动物的已知蛋白基因存在较高的同源性。 筛选到的单基因，分别涉及信号传导、生物和非生物胁迫以及生殖等(表1)。 1500b p1000b p500b pMTr；LI ll5K；1敏感种洋(2( 1、25羁】f)个循朋。 rl-p11洋(2(】、2j干lJ30个循纠)、，MT ra llS I5KI，；i n、sl t()_1111i c l“C01)ri(I s_J SC(、I)川(20!I【】、v(，h-s)l。 “If(、s1t【J6111i i dU hq；r idr c s i s l(202SI【、r tlt、_)图2双链c1)N A的扩增反应F ig2A mp l i fi ed reac t i o no f d ou hl est ra n d ed eD N A图3部分消减产物转化结果I?i23Iv；i ns forlll；l l i o n resuI l solp art ial snl)t ra el inn plq nh lcls3讨沦消减杂交(S Sf)足一种高效分离篾肄太达展?的力法。 fII仃S SH义H构建I f I，徭高质量的R N 八、1000b p750b p500b p250b p100b pM1敏感种群舣链c1)N A扩增纳玳；2抗忡种群烈锚LI)N A扩增i果；卜?ti减J“物扩增结粜。 iA mpl i f ied resu h s0f dlif沁clr r su bs1fd 本研究住R NA的质糙和拨头连接效率方IfI均L达到r建厍的婴求，保证_r一J筛选的信息量；所构建的文库巾fJj减杂交组的(j八，D H基因扩增产物的出现比未淌减杂交组延迟5个以I循环，晚叫抗感吡虫啉褐飞虱干叶1群-11兵有的垠i Z经被高度抑制。 ，吡虫啉f1用f士fq碱乙眦胆碱受休”“，1扰昆虫神经系统的刺激传导，引起神经迎路的阻塞。 比虫乙眦川I l碱受体的胞内胴耍“I磷酸化作川来完成fi的氮坫酸贱坫娃彳r小同的膦酸化他点?。 小研究所克隆的儿类受吡虫啉删控的甚I II1Lj信I传导卡I I天的琏?包括跨膜丝钣酸货门牌、(；【、R I受体(；生门钠联受体、受体卡ll父l大If结合篮“。 11ij行是细胞信l，传导途释t卜fI勺噩婴成员，从卜游接受信号通过将卜游成pI!磷酸化将价5j传至卜游成员，最终将影响细胞的，1i列!状态，或将价，?细胞卡亥转移片激沂+系列坫?的表达，jl起细胞的，川反心。 (；篮r_】耦联训受体为7次跨腆生II受体胞外结构域谚圳胞外衍I，分严j川j之结合胞内结构域j(；赁r1梢联删1，州父喃活亿细胞内产，卜第价使，从?将胞外价0跨膜传递划胞I J,l。 ，(；货印卯叩岬卯0000050753张珏锋等抗感吡虫啉褐琶虱种群抑制消减杂交cDNA文库的构建表1抗吡虫啉相关基因的特性Table ICharacteristics ofgenes relatedto imidaclopridresistance白耦联型受体包括多种神经递质、肽类激素和趋化因子的受体，在味觉、视觉和嗅觉中接受外源理化凶素的受体亦属(蛋白耦联型受体。 上述三者数量及活性的变化足乍物感受并传导外界信号的重要分子，是叫物适应环境的重要手段。 研究结果推测褐虱在取食经吡虫啉处理的水稻植株后，吡虫啉的某些有毒物质引起褐虱体内基【六J表达的变化及细胞生理状念的改变均通过以I途径的信号通路完成。 这种改变最终导致褐虱形成_r抗吡虫啉品系。 已有研究表明，溴氰菊酯、三畔磷和吡虫啉等杀虫剂亚致死剂量和不同温度条件下刘褐飞虱卵黄蛋白合成具有一定的影响。 本研究中所克隆到的卵黄蛋白基因验证了前述研究，推测由于褐飞虱的卵黄蛋白合成于脂肪体，有口f能吡虫啉等杀虫刹通过破坏昆虫的脂肪体从而抑制卵黄蛋白的合成。 在分离到的受吡虫啉诱导的基L大J巾，有一类牛物和非牛物的胁迫有关，殳1乙醛脱氢酶。 该酶是26一种含锌酶类，在人体血清中是急性肝实质细胞损伤诊断有价值的指标，正常人或无继发性肝病患者的血清酶活力为阴性。 因此，可推断吡虫啉对褐飞虱造成了实质性的损伤，诱导该基因的表达，参与解除吡虫啉中化合物的毒性。 研究还发现有一类功能的基因也受吡虫啉的调控。 这表明在吡虫啉的作用下，褐飞虱体内转录组水平发生了深刻变化，增强了褐飞虱适应吡虫啉的能力，如果长期在吡虫啉诱导之下，最终会产生抗吡虫啉褐飞虱种群，因而推测吡虫啉诱导是导致褐飞虱抗性水平变化的重要外因，而虫体内基因表达水平的变化是导致药抗性改变的重要内因。 参考文献1程遐年，吴进才，5飞褐飞虱研究引治北京中国农l fn版社，xxE23李汝铎，r锦华胡国文，等褐虱及其种群管理卜海复旦人学出版社，l996128一l3d3程家安，朱金良，祝增荣，等稻【f1飞虱灾变与环境调控环境昆虫学报xx30 (2)I76一I82d王彦华，李永平，陈进，等褐虱对吡虫啉敏感性的时空变化及现实遗传_；fJ中国水稻科学，xx22 (4)421426r51iu ZW，W iIliamsonM S1ansdell SJA nicotinicacetylcholine receptormutation conferringtargetsite resistancetO imidacloprid inNilupa,一，“lug，j(brown planthopper)Pro(Natl A(ad Sci USA，xx，102 (24)842084256唐振华，陶黎明，李忠害虫对新烟碱类杀虫剂的抗药性及其科学出版社图书介绍中国水稻科学(Chin JR sc)第26卷第l期(xx年1月)781)1011治卿策略农药学学报，20o6，8 (3)l95202彦华，沈晋良，E呜华褐飞虱抗药性机理及其治理研究进展农药科学管理，xx，26 (4)2428刘洋义，张懿熙，姚香梅，等褐飞虱对吡虫啉的抗性机理和靶标分子毒理学昆虫学报，xx，53 (6)6836881)iatchenko I1au YFCamptell AP，et a1Suppression su1)t ractive hybridizationA methodfor generating differentially regulatedor tissuespecific cI)NA prnles andlibrariesPrf)Nttl，A(ad&iUSA，1996936O25-60301)ai ZMZhu XJ，Yang WJFulllength normalizationsubt racfivehybridizationAnovel methi)(I forgeneratingdifferentially expressedc1)NAsM olBtotehnol，xx，43 (3)25763Peng RHXiong ASXu Y，el a1Kamchatka crabduplexspecific nucleasem edialedt ranscriplomesubtraction reelh