糖基化产物对正常大鼠尿蛋白排泄和肾脏结构的影响.doc

糖基化产物对正常大鼠尿蛋白排泄和肾脏结构的影响中华内分泌代谢杂志 1998年第4期第14卷 实验研究作者：隋立荣李才苗春生邹雅斌刘景英单位：130021 长春白求恩医科大学应用基础医学研究所关键词： 非酶糖基化；糖基化血清蛋白【摘要】目的为探讨糖基化产物对正常肾脏的特异性损害作用。方法正常大鼠静脉注射体外制备的糖基化血清蛋白(GSP)，为期2个月，观察GSP对大鼠尿蛋白排泄、肾皮质糖基化产物和肾脏形态的影响。结果接受GSP的大鼠血清和肾组织中糖基化终产物(AGEs)水平、肾小球硝基四氮唑蓝(NBT)染色强度、尿蛋白排泄量和尿量均明显高于对照组。光学和电子显微镜观察显示，给予GSP的大鼠肾小球体积明显增大，肾小球系膜区扩大伴有细胞外基质增加，PAS阳性物质沉着增多和肾小球基底膜节段性增厚。结论糖基化产物能引起类似糖尿病肾病的肾脏损害。 Effect of glycation products on urinary protein excretion and renal structure in normal ratsSui Lirong,Li Cai,Miao Chunsheng,et al.Institute of Preclinical Sciences,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun,130021【Abstract】ObjectiveTo explore the specific pathogenic role of glycation products in normal kidney.MethodsGlycation serum protein (GSP) prepared in vitro was administered intravenously to normal rats for 2 months and the effect of GSP on urinary protein excretion and renalmorphologywasobserved.Results Levels of advanced glycation end products (AGEs) in serum and renal tissue, NBT staining intensity in glomeruli, and urinary protein excretion as well as urine volume markedly increased in GSP-treated rats than in the control rats. Light and electron microscopy of kidney from GSP-treated rats revealed a significant increase in glomerular volume, expansion of mesangial area with increased extracellular matrix, increased deposit of PAS-positve materials and segmental thickening of basement membrane.ConclusionGSP can induce renal lesions resembling those seen in diabetic nephropathy. This suggests that protein glycation products play an important role in pathogenesis of diabetic nephropathy.【Key words】Non-enzymatic glycationGlycation serum protein(Chin J Endocrinol Metab, 1998, 14:260262)慢性高血糖引起的蛋白质非酶糖基化和糖基化终产物(AGEs)的形成在糖尿病肾病的发病机制中起一定作用1，2。在体内条件下直接确定糖基化产物对肾脏的致病作用尚有不少干扰因素。为排除这些代谢异常的影响，探讨糖基化产物与肾脏损害之间的关系，本研究给正常大鼠注射体外制备的糖基化血清蛋白(GSP)，观察其对肾脏功能和结构的影响。材料和方法一、材料硝基四氮唑蓝(NBT)，德国Fluka产品，硫代巴比妥酸(TBA)和IV型胶原酶，Sigma公司产品，其他试剂为国产分析纯。雄性Wistar大鼠由本校实验动物部提供。二、方法1.糖基化血清蛋白(GSP)的体外制备：取10只体重约200g大鼠的混合血清，56、30分钟灭活。按血清蛋白2.5mg/ml、葡萄糖0.5mol/L、青霉素和链霉素各100U/ml溶于PBS溶液中，经G6漏斗过滤除菌后，置37密闭避光环境反应2个月。对PBS透析72小时除去葡萄糖，再次过滤除菌，取样检测相对荧光值、5-羟甲基糠醛(5-HMF)水平和葡萄糖含量后分装冻存。对照组大鼠所用混合血清的来源同上，除不加入葡萄糖外，其他成分和处理方法均同GSP(称天然血清蛋白)。透析后加入适量葡萄糖，使之与透析后GSP中葡萄糖浓度相等。2.实验动物分组和处理：用体重250300g大鼠10只，适应饲养1周后按体重随机分为2组：一组经尾静脉注射GSP(GSP组，5只)，另5只大鼠静脉注射天然血清蛋白(对照组，5只)，注射体积为每只大鼠每天0.5ml，逐渐增至1.5ml，每天1次。注射血清蛋白2个月后，连续收集3天24小时尿液，测尿量，叠氮钠防腐，-20保存待测尿蛋白含量。麻醉下眶后血管采血，分离血清并处死动物，肾脏用生理盐水灌洗后立即切除。3.生化指标测定：用邻苯甲胺法检测两种血清蛋白液中葡萄糖浓度，尿蛋白含量用考马斯亮蓝法测定，血清、血清蛋白液和肾组织AGEs水平用荧光光谱法分析，用TBA法测定肾组织5-HMF水平。4.形态学观察：部分肾组织固定于10%中性福尔马林液，常规制作石蜡切片，HE和PAS染色。后者染色强度按0，1，2和3级(分别代表无、轻、中和重)表示PAS阳性物质沉着程度。用Saitoh等3的方法进行NBT组化显色和染色强度判定。按形态计量学原理计算肾小球平均体积。肾脏切除后立即将皮质切成1mm3，戊二醛和锇酸固定，Epon 812包埋，超薄切片用JEM-1200EX电镜观察。5.统计方法：肾小球NBT染色强度和PAS阳性物沉着程度用中位数表示，组间差异显著性用秩和检验。其他数据用表示，组间差异显著性用t检验。结果实验期间所有动物体重增长正常，两组大鼠肾重、体重和肾重/体重比之间无显著差异。GSP和天然血清蛋白液中葡萄糖浓度均为2.6mmol/L。用荧光分光光度计于激发波长370nm和发射波长440nm测定上述两种血清蛋白液的荧光值，用以表示糖基化终产物含量，GSP为35.5，天然血清蛋白为3.0。一、血清AGEs水平、尿蛋白排泄量和尿量结果见表1。GSP处理的大鼠血清AGEs水平明显高于对照组，尿蛋白排泄量和尿量也明显多于对照组。二、糖基化指标和PAS阳性物质沉着程度结果总结于表2。两组大鼠肾皮质5-HMF释放量无显著差异(P0.05)，而GSP处理的大鼠肾皮质AGEs水平、肾小球NBT染色强度和PAS阳表1两组大鼠血清AGEs水平、尿蛋白排泄量和尿量()Tab 1Serum AGEs levels, urinary protein excretion and urinary volume in two groups of rats ()组别Group例数n血清AGEsSerum AGEs(ml-1)尿蛋白排泄量Urinary protein excretion(mg/24hrs)尿量Urinary volume(ml/24hrs)Control56.481.498.31.5247GSP58.521.26*12.22.7*379*注：与对照组比较vs control group，*P0.05表2两组大鼠肾皮质糖基化指标和系膜区PAS阳性物质沉着Tab 2 Glycosylation indexes in renal cortex and mesangial PAS-positive materials in two groups of rats组别Group例数n5-HMF(nmol/mg*pr)AGEs(AU*mg-1*pr-1)NBT染色强度NBT stainingintensityPAS阳性物质PAS-positivematerialControl578.327.501.600.351.41.2GSP574.885.162.720.90*3.0*3.1*注：与对照组比较vs control group，*P0.05,*P0.01性物质沉着程度均明显高于对照组。三、肾脏形态改变形态计量分析结果是，GSP处理的大鼠肾小球平均体积(m3103,845113)明显大于对照组大鼠(577114，P0.05)。光学显微镜下可见注射GSP大鼠肾小球系膜区扩大，PAS阳性物质沉着增多，一些系膜区含较多细胞外基质，但不伴有明显的细胞成分增多。部分毛细血管堵塞。电镜观察可见，接受GSP的大鼠肾小球基底膜呈节段性增厚和较多大小不一的筛孔。上皮足突细胞肿胀，不同程度融合，核外形不规整，染色质呈块状趋进，核周围区扩大。系膜区扩展，胶原成分增多，系膜细胞肿胀或固缩，内质网扩张，核染色质呈高密度凝集于核膜下，核仁裂解。内皮细胞轻度肿胀，部分毛细血管堵塞。注射天然血清蛋白的大鼠肾脏结构基本正常。讨论给予体外制备的GSP可引起正常大鼠尿蛋白排泄增加、肾小球体积增大和肾脏病理学改变。这为糖基化产物可造成肾脏损伤提供了客观证据。AGEs化学结构复杂，迄今尚未完全弄清4。因此在实验中直接应用AGEs比较困难。本研究用正常大鼠混合血清与高浓度葡萄糖在37反应生成糖基化产物，经荧光光谱分析，在激发波长370nm、发射波长440nm上有最大吸收峰，这与文献记载的AGEs的吸收峰一致5。故认为注射的GSP在体内发挥生物学作用的是AGEs。在上述波长光谱分析中，GSP处理的大鼠血清和肾组织相对荧光值均显著高于对照组，提示GSP在循环和肾脏中已达到较高浓度。NBT染色强度可反映糖基化程度3。肾皮质NBT染色强度明显强于对照组。这也表明，GSP进入机体后在肾脏有较高水平。Vlassara6认为，AGEs进入体内后将经肾脏排泄，可部分以共价方式附着在肾组织上，这是AGEs引起肾脏损害的基础。本文中两组动物肾组织中糖基化中间产物(5-HMF)水平无明显差异。这提示，造成给予GSP大鼠肾脏损害的，主要是糖基化终产物，而不是糖基化中间产物。对照组尿蛋白排泄无明显增加，肾脏结构无明显改变，提示GSP对肾脏的损害作用不可能是异体蛋白引起的，而是AGEs本身的有害作用的结果。用GSP处理的大鼠尿蛋白排泄量显著高于对照组，说明这些动物肾小球基底膜通透性明显增大。给予GSP大鼠尿量增加的原因不明，可能由于GSP引起肾小球增大，滤过率增加，原尿通过肾小管相应增快，以致肾小管上皮细胞来不及重吸收。另外我们还观察到，给予GSP的大鼠肾小管也有损伤，可能也影响肾小管重吸收功能。本研究证明，GSP处理的大鼠肾小球体积明显增大，系膜区扩张，PAS阳性物质沉着，细胞外基质成分增多及基底膜节段性增厚等。这些改变与实验性糖尿病肾病的形态改变很相似，类似糖尿病肾病的肾小球病变。系膜区扩张和细胞外基质成分增多是糖尿病肾病的基本病变。最近有研究7证明，正常小鼠用AGEs修饰的血清白蛋白处理后，明显增加肾小球IV型胶原层粘连蛋白的mRNA水平，表明内源生成的AGEs与外源给予的AGEs致病性质一致。本研究所见GSP处理的大鼠肾小球系膜区扩张和细胞外基质增多，可能与GSP具有AGEs相似的作用有关。参考文献1Soulis-Liparota T, Cooper M, Papazoglou D, et al. Retardation by aminoguanidine of development of albuminuria, mesangial expansion, and tissue fluorescence in streptozotocin-induced diabetic rat. Diabetes, 1991,40:1328.2Brownlee M. Glycation products and the pathogenesis of diabetic complications. Diabetes Care, 1992,15:1835.3Saitoh A, Tomino Y, Wang LN, et al. Detection of glycosylation protein of renal tissues using NBT reaction in STZ-induced diabetic rats. Jpn J Nephrol, 1992,34:895.4Vlassara H.