实验一 蛋白质含量测定方法的研究.doc

实验一 蛋白质含量测定方法的研究生物093 孙文雅 09020403061、 研究背景 蛋白质是存在于生物体中的一类重要的生物大分子物质，其结构及功能的多样性决定了它在生命活动的各个领域中都有极其重要的作用。因此，对于探究生命活动的奥秘，首先要明确的内容之一即是生命活动的主要承担者-蛋白质的结构与功能与生命活动的内在联系。蛋白质含量测定技术是蛋白质分离提纯流程中的基本环节。缺少这一技术的辅助，我们就无法明确得知某种蛋白质的存在，也就无法完成分离提纯的最终目的。目前，测定蛋白质含量的方法主要有四种：Folin-酚法、考马斯亮蓝（G-250）法、紫外法以及凯氏定氮法，其中最常用的是前三种。然而为什么对同一类甚至同一种物质的测定会存在多种不同的方法呢？通常情况下，技术及方法的发展依赖于人们的需求，如果一种方法即可满足人们对于蛋白质含量测定的需要，那么其他的方法也就没有其存在的必要性了；也就是说，如果多种测定方法并存而且同时为人们所用，那么就说明仅仅一种方法并不能满足人们对于蛋白质含量测定的需要，每一种方法必然都有其特殊的适用范围及缺陷。那么，面对多种方法，我们在实际工作中又要如何进行选择呢？选择的依据又是什么呢？首先考虑到生物体内不同蛋白质组成成分、结构及性质的多样性，这可能是决定蛋白质含量测定方法多样性的原因；另外，这几种方法又都是针对蛋白质区别于其他物质的特殊性质进行测定的，因此，利用蛋白质的不同于其他物质的特殊物理、化学等性质便成为了我们测定蛋白质含量的首要原理，那么在实验中值得我们注意的问题就是在蛋白质含量测定过程中如何保证蛋白质以外的物质的干扰作用最小，得到较为准确的结果了。2、 实验原理分别用Folin-酚法、考马斯亮蓝（G-250）法和紫外法对同一蛋白质样品进行蛋白质含量测定，比对实验结果，从而分析比较几种方法。1、 Folin-酚法：利用Folin-酚试剂中的磷钨酸与磷钼酸在碱性条件下被蛋白质中存在酚羟基的氨基酸还原生成蓝色的钼蓝与钨蓝络合物而呈蓝色反应的原理，根据生成的络合物颜色深浅的比对，结合做出的标准曲线，对样品蛋白质的含量进行定量测定。2、 考马斯亮蓝（G-250）法：根据考马斯亮蓝（G-250）与蛋白质结合后由红色变为蓝色，结合物在2min左右达到平衡并在1h内保持稳定且所测定蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收值与蛋白质含量成正比的原理，利用测得的光吸收值以及做出的标准曲线对样品蛋白质含量进行定量测定。3、 紫外法：根据含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质因其结构中存在共轭双键，具有吸收紫外光的性质，且在280nm波长处存在最大吸收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比这一原理，根据吸收值的不同，做出标准曲线，对样品蛋白质含量进行测定。3、 仪器与试剂1、仪器 （1）托盘天平 （2）722分光光度计（上海精密科学仪器有限公司） （3）UV9600紫外分光光度计（北京瑞丽分析仪器公司）2、 试剂 （1）1mg/ml BSA（牛血清白蛋白）标准溶液 （2）Folin-酚试剂甲、乙 （3）考马斯亮蓝G-250溶液 （4）待测液1（500g/ml BSA标准液）3、实验材料 绿豆芽下胚轴4、 操作步骤1、 待测液2的制备：使用托盘天平称取1.5g绿豆芽下胚轴（已掐头去尾的），放入加过少许石英砂的研钵中研磨成均匀浆状物，用蒸馏水少量多次清洗研钵将匀浆全部转移至50ml容量瓶中约至40ml，颠倒浸提10min后定容并混匀，过滤后得到滤液即为待测液2。2、 Folin-酚法 （1）使用1mg/ml BSA标准溶液稀释成250g/ml BSA原液； （2）取12只干净试管并依次标号，并按照下表要求配制所需溶液： 管号123456789101112250g/mlBSA原液（ml）00.20.40.60.81.0待测液1各0.2ml待测液2各1mldH2O1.00.80.60.40.20各0.8ml （3）上述溶液配好之后，在各试管中加入5ml的试剂甲，混匀后室温下静置不少于10分钟； （4）分别在各试管中加入0.5ml的试剂乙，立即震荡混匀，并在室温下静置30min，在静置过程中打开所要用的722分光光度计预热约20分钟； （5）调节722分光光度计波长为650nm，将配制的溶液依次加入比色杯中，调节好分光光度计，在650nm波长下测量吸光度，空白对照1号溶液要始终放置在分光光度计中，而且每测量一组溶液前都要调节透光度为100%、吸光度为0，注意，每次倒入新的待测溶液前都要对比色杯进行至少1次的润洗，以确保结果的精确度； （6）记录实验数据，绘制标准曲线，取样品溶液吸光度的平均值，在标准曲线上查得待测液的蛋白质浓度。3、考马斯亮蓝（G-250）法 （1）使用1mg/ml BSA（牛血清白蛋白）标准溶液稀释成100g/ml BSA原液； （2）取12只干净的试管并依次标号，按照下表要求配制所需溶液：管号123456789101112100g/mlBSA（ml）00.20.40.60.81.0待测液1各0.1ml待测液2各1mldH2O1.00.80.60.40.20各0.9ml （3）再取5只干净试管，分别标号（与上表试管标号进行区分），并依次配置下列溶液。管号1234561000g/mlBSA原液（ml）用上表第1管0.20.40.60.81.0dH2O0.80.60.40.20 （4）在上述的各个试管中分别加入5ml G-250溶液，混匀后室温下静置约2分钟； （5）使用722分光光度计测量每支试管中溶液在595nm下的吸光度；分光光度计使用具体步骤同Folin-酚法。 （6）记录数据，绘制标准曲线，取样品溶液吸光度的平均值，在标准曲线上查得待测液的蛋白质浓度。4、紫外法 （1）给试管标号，并按照下表要求配制所需溶液：管号12345678910111213141mg/mlBSA原液（ml）00.51.01.52.02.53.04.0待测液1各4ml待测液2各2mldH2O4.03.53.02.52.01.51.00各2ml （2）使用UV9600紫外分光光度计测量18号试管中溶液在280nm波长下的吸光度，然后再测量914号试管中溶液在280nm及260nm波长下的吸光度； （3）记录数据，绘制标准曲线，取样品溶液吸光度的平均值，在标准曲线上查得待测液的蛋白质浓度。5、 数据整理1、Folin-酚法管号123456789101112250g/mlBSA原液（ml）00.20.40.60.81.0待测液1各0.2ml待测液2各1mldH2O1.00.80.60.40.20各0.8mlOD65000.1200.2260.3390.3980.4980.2100.2130.2190.4400.4480.4412、 考马斯亮蓝G-250法管号123456789101112100g/mlBSA原液（ml）00.20.40.60.81.0待测液1各0.1ml待测液2各1mldH2O1.00.80.60.40.20各0.9mlOD5950.0000.2140.3670.5430.7100.8150.4760.4470.4970.4560.4410.452管号1234561000g/mlBSA原液（ml）用上表第1管0.20.40.60.81.0dH2O0.80.60.40.20OD5950.0000.9171.3001.3661.4321.434 3、紫外法管号12345678910111213141mg/mlBSA原液（ml）00.51.01.52.02.53.04.0待测液1各4ml待测液2各2mldH2O4.03.53.02.52.01.51.00各2mlOD2800.0000.0520.1340.2100.2920.3670.4540.6020.2750.2660.2650.5880.6640.585OD260-0.1650.1590.1570.7160.8190.718六 实验结果计算1、 Folin-酚法根据实验数据所作出的浓度-消光值的标准曲线由回归方程y=0.0020x+0.0180可以计算712号试管中样液的蛋白含量。根据计算公式待测液1中蛋白质含量（g/ml）=由标准曲线所得蛋白质含量（g/ml）试管中所配样液总体积（ml） 所取待测液1的体积（ml）将7、8、9号试管中溶液的蛋白质含量代入，得到原本待测液1的实际蛋白含量并取平均值作为待测液1的蛋白含量值，列入下表中： 7号试管蛋白含量=96.0g/ml1.0ml0.2ml=480g/ml 8号试管蛋白含量=97.5g/ml1.0ml0.2ml=487.5g/ml9号试管蛋白含量=100.5g/ml1.0ml0.2ml=502.5g/ml管号789平均值蛋白含量（g/ml）480487.5502.5490根据计算公式 待测液2中蛋白质含量（%）=计算所得蛋白质量（g/ml）所取待测液2的体积（ml）所取体积含有的样品质量（g）10号试管蛋白含量=0.7025%11号试管蛋白含量=0.7155% 12号试管蛋白含量=0.7045% 待测液2的蛋白含量及平均值为管号101112平均值蛋白含量（%）0.70250.71550.70450.70752. 考马斯亮蓝G-250法由数据画出的浓度-消光值的标准曲线：由回归方程y=0.0082x+0.0316可以计算712号试管中样液的蛋白含量，根据计算公式 待测液1中蛋白质含量（g/ml） =由标准曲线所得蛋白质含量（g/ml）试管中所配样液总体积（ml）所取待测液1的体积（ml）将7、8、9号试管中溶液的蛋白质含量代入，得到原本待测液1的实际蛋白含量并取平均值作为待测液1的蛋白含量值，列入下表中： 7号试管蛋白含量=54.195g/ml1.0ml0.1ml=541.95g/ml 8号试管蛋白含量=50.695g/ml1.0ml0.1ml=506.95g/ml 9号试管蛋白含量=56.756g/ml1.0ml0.1ml=567.56g/ml管号789平均值蛋白含量（g/ml）541.95506.95567.56538.82根据计算公式待测液2中蛋白质含量（%）=计算所得蛋白质含量（g/ml）所取待测液2的体积所取体积含有的样品质量（g）10号试管蛋白含量=0.1720%11号试管蛋白含量=0.1561% 12号试管蛋白含量=0.1689% 待测液2的蛋白含量及平均值为管号101112平均值蛋白含量（%）0.17200.15610.16890.16913、 紫外法由紫外法数据画出的浓度-消光值标准曲线：由回归方程y=0.0002x-0.0280可以计算79号、1012号试管中样液的蛋白含量。根据计算公式 待测液1中蛋白质含量（g/ml）=F1/dOD280D 式中：F为校正因子，d为石英比色杯的厚度（cm），D为溶液的稀释倍数8号试管蛋白含量 =1.1671/10.2752（mg/ml)=458.3（g/ml) 9号试管蛋白含量 =1.6721/10.2662（mg/ml)=443.3（g/ml）10号试管蛋白含量 =1.6871/10.2652（mg/ml)=447.1（g/ml） 待测液1的蛋白含量及平均值为管号789平均值蛋白含量（g/ml）458.3443.3447.1449.6 待测液2中蛋白质含量（g/ml）=F1/dOD280D 式中：F为校正因子，d为石英比色杯的厚度（cm），D为溶液的稀释倍数10号试管蛋白含量 =0.8121/10.5882（mg/ml)=477.5（g/ml) 11号试管蛋白含量 =0.8111/10.6642（mg/ml)=538.3（g/ml）12号试管蛋白含量 =0.8141/105852（mg/ml)=476.2（g/ml）待测液2中蛋白质含量（%） =计算所得蛋白质含量（g/ml）所取待测液2的体积（ml）所取体积含有的样品质量（g）10号试管蛋白含量 =477.5（g/ml）1ml（1.550）g100%=1.592% 11号试管蛋白含量 =538.3（g/ml）1ml（1.550）g100%=1.794% 12号试管蛋白含量 =476.2（g/ml）1ml（1.550）g100%=1.654% 待测液2的蛋白含量及平均值为管号101112平均值蛋白含量（g/ml）477.5538.3476.2497.3蛋白含量（%）1.5921.7941.6541.680 如下是汇总全班数据所得平均结果：待测液1（g/ml）待测液2（%）Folin-酚法5200.66考马斯亮蓝G-250法5110.12紫外法4741.47七 实验结果分析（1） 对待测液1蛋白质含量的测定及计算结果与待测液1本身浓度的真值500g/ml相差不大，说明三种方法对于蛋白质含量的测定均具有可行性。（2）依据待测液1的测定结果来看，Folin-酚法和考马斯亮蓝G-250法这两种使待测液显色的方法测得的结果均偏高，而紫外法的测定结果则明显偏低此差别可能与仪器的精确度有关。（3）各种方法对待测液2蛋白质含量的测定结果差别很大。比较待测液1与待测液2的组成成分可知，待测液1是纯牛血清蛋白溶液，不存在其他类的生物分子，而待测液2是由绿豆芽下胚轴这种生物材料研磨得到的，除含有多种蛋白质外，还含有其他水溶性的生物分子，这些不在测量范围内的存在于生物体内的物质势必会对测量结果造成很大影响；而且，由于各种方法测量原理不同，这些非蛋白干扰因素的影响造成的干扰大小也不同；故在具体进行实验时，未能排除这些干扰因素导致各种方法的结果有较大偏差。7、 结论及展望（一）实验结论在本次实验中，我们利用了三种方法对纯蛋白质溶液和一种生物材料进行了蛋白质含量的测定。通过实验，我归纳得出了以下结论：1、 Folin-酚法、考马斯亮蓝G-250法和紫外法对于纯蛋白质溶液中蛋白质含量的测定均具有可行性，而且可以保证较高的准确度。但由于每种方法的原理不同，造成实验误差的原因也存在差异。因此，各种方法虽然都能够较准确的测定蛋白质含量，但测量结果仍存在差异。2、 通过比较记录的待测液1、2的原始数据发现，平行测定的数据中，Folin-酚法和考马斯亮蓝法各数据的差异较大，而紫外法的差异极小，可见紫外法对于同一种物质的测定结果具有较高的稳定性，而另外两种方法则稍差。3、 在测定生物材料的蛋白质含量时，非蛋白干扰因素对于蛋白质含量的测定有很大影响，而且对于不同的方法来说影响是不同的，这与各种方法的实验原理是密切相关的。（二）展望生物体是繁杂的生物分子所构成的集合体，其成分的复杂性是测定某种生物分子含量的极大障碍，各种干扰因素的影响使得测定结果往往存在极大偏差，就如本次实验对绿豆芽下胚轴蛋白质含量的测定中，三种测量方法所得的结果就大相径庭，根本无法得到其真实的含量值。尽管对于生物材料的测定存在很多的困难，但随着理论的发展和技术的革新，人们也已经找到了每种方法在测定蛋白质时的适用范围，尽量使非蛋白干扰因素的影响降到最低，以获取科学可信的实验数据。八、思考题及质疑 1、比色法测定物质含量的原理及特点是什么？（1） 原理 比色法是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律（A=bc）为基础的。目视比色法是事先配制浓度逐渐递变的标准色阶，并在同样的条件下使样品显色，通过比对样品溶液与标准色阶的颜色差异，找到与样品溶液最接近的标准溶液，依据此标准溶液的浓度，从而计算推测样品溶液的浓度。光电比色法同样是事先配制一系列标准色阶，然后使用分光光度计测量这些溶液的光吸收值，绘制成标准曲线，并在同样条件下测量样品溶液的光吸收值，由标准曲线上读出样品的浓度。（2） 特点比色法常用于微量组分的测定，具有简单、快速、灵敏度高等特点；但比色法的相对误差一般较大，不过由于绝对误差很小，测定结果绝对准确度是可以保证的。2、 比色测定法中为什么要设空白？设空白时要注意什么？（1）为了减少系统误差。用空白管调整零位时，仪器和试剂等造成的系统误差就可以减小到最低程度。（2）设空白时要注意保证空白管中所加试剂除待测溶液外其他含量均一致，而且每次测量前均需使用空白对照调节吸光度为0及透光度为100%。3、请分析一下比色法中生物材料的处理上合适的稀释倍数是如何确定的以及对测定结果的影响。（1）在测量样品溶液时，首先测定所配原液的吸光值，倘若吸光值超过标准溶液的量程，则说明原液浓度过大，此时将原液稀释一倍，继