原核表达真核基因.docx

蜱铁蛋白基因在大肠杆菌中的克隆和表达分析系别：生物工程 班级：06-4组别：D组组员：广慧娟 学号：06031405关程程 学号：06031404尹晓欢 学号：06031427孙恒一 学号：06031417刘 博 学号：06031413指导教师：刘宝全完成日期：2009-6-29目录一、概述1二、蜱铁蛋白DNA、MRNA、氨基酸序列的获取21、蜱铁蛋白DNA22、蜱铁蛋白mRNA序列23、蜱铁蛋白氨基酸序列3三、蜱铁蛋白相关信息（网站、文献查阅）3四、材料和方法41、材料41.1蜱的饲养及试验动物41.2 质粒和宿主菌株42、方法52.1蜱总RNA的分离及cDNA的合成52.2 引物设计和PCR扩增目的基因72.3目的基因的克隆和测序82.4铁蛋白基因的原核表达及亲合纯化102.5 WesternBlot方法检测微小牛蜱铁蛋白（文献查阅）12五、相关说明：131、表达载体的选择132、克隆载体与表达载体的区别133、如何提高外源基因片段在原核细胞中的表达量13参考资料13一、概述蜱是一类以吸血为生的节肢动物，蜱类不仅在人、畜体上刺吸血液，造成宿主的血液损失，而且引起皮肤奇痒，伤口发炎、水肿等多种反应。更重要的是，作为人和动物的许多病原的传播媒介，包括细菌、真菌、病毒、立克次体、螺旋体和寄生原虫等多种病原。微小牛蜱也是兽医上常见的体外寄生虫,是传播牛疾病最多的一种蜱,可传播牛巴贝斯虫病、牛双芽巴贝斯虫病和牛边缘边虫病。据联合国粮农组织(FAO)统计，世界上有80%的牛被侵袭，仅硬蜱给畜牧业造成的损失，全球每年就高达70亿美元。长期以来，药物灭蜱一直是蜱及蜱传播疾病的主要控制手段，由于蜱抗药性出现、食品安全和环境污染等问题,目前的药物控制已显现出它严重的局限性,迫切需要寻找新的防制策略。1995年研制出微小牛蜱的肠抗原Bm86的重组疫苗，它的成功使人们确信，免疫控制是目前最有希望的方法之一。但该疫苗不足之处也十分明显，该疫苗的局限性激励有关学者寻找其他分子。生物技术和信息技术的快速发展为蜱的功能分子的研究提供了有力的手段。从现有的研究看，蜱体内具有多种疫苗侯选价值的分子，例如，蜱铁蛋白、抗凝血分子。、免疫调节分子等。蜱功能分子的具有良好的开发前景：1、作为抗蜱疫苗的应用，现在从蜱体分离出的许多抗原分子例如微小牛蟀Bm86以及本实验分离的半胱氨酸蛋白铁蛋白具有一定的免疫保护作用。2、抗病原传播疫苗的应用。蜱的危害不仅是作为寄生虫，更重要的作为传播病原的媒介。如果能够用从蜱体分离出的特定病原的抗原对宿主进行免疫，使蜱叮咬宿主后，降低或使蜱丧失媒介能力，则能达到阻断病原的传播。3、寻找抗药性对策。蜱抗药性问题一直是药物灭蜂的一个突出问题，且大量化学药物的使用容易造成环境污染和食品污染。研究表明，蜱体内一些酶分子是与抗药性产生相关的，因此，这些分子的研究有助于寻找抗药性对策。铁是一种重要的营养元素，但它的富集能致毒。铁蛋白是普遍存在于生物体内的一种保守性较高的多功能多亚基的生物蛋白，其作用是贮存铁和对生物体内铁含量进行调控，因此在生物体内铁含量过多时起到解毒的作用。1蜱是以吸血为生的寄生虫，宿主红细胞中含有大量的铁，据研究，蜱是利用铁蛋白及其相关蛋白功能来处理大量的铁以消除对自身的毒性。因此铁蛋白是蜱体内一种十分重要的功能分子，为了进行抗蜱疫苗的研制，本研究对微小牛蜱铁蛋白编码基因进行克隆、测序、表达和分析。二、蜱铁蛋白DNA、mRNA、氨基酸序列的获取1、蜱铁蛋白DNA1 GTTTTGCTTC AACAGTGATT GAACGAGCAT CGCCAAACGT GCTCTCTCTC TCTTCCGATC 61 CTTTCTCGCT AAATTAATCT TGAAGTACAG TTTGAGATCC CGTCCGCCAA GCAGCCGAAG 121 AAGATGGCCG CAACTCAGCC CCGTCAGAAC TACCATGTCG ATTGCGAAGC CCGCATCAAC 181 AAGCAGATCA ACTTGGAACT CTACGCGAGC TACGTCTACA CATCAATGGC CTACTACTTC 241 GATCGCGATG ATGTGGCACT GCCGGGATTC CACAAGTTCT TCAAGAAGAG CAGCGATGAG 301 GAGCGTGAGC ATGCCCAGAA GCTGATGAAG TATCAAAACA TGCGCGGAGG GCGCGTGGTG 361 CTGCAGGCGA TACAGAAGCC ATCGCGGGAC GAATGGGGCG CAGGCTTGGA CGCCATGCAG 421 GCTGCACTTG AGCTGGAGAA GACTGTCAAC CAGTCACTGC TGGACTTGCA CAAGCTGGCA 481 AACGATCATA ATAACGCTCA GCTGTGCGAC TTCCTGGAAA GCGAGTACCT GGAAGAGCAG 541 GTGAAGGCTA TCAAGGAGCT GTCTGACTAC GTGACCAACC TGAAGCGTGT TGGCCCTGGC 601 CTCGGAGAGT ACATGTTTGA CAAGGAGACC CTATCAGACT GA 注：红色序列代表步骤2.2.1中所设计的引物序列 蓝色序列代表步骤2.4.2中所设计的引物序列2、蜱铁蛋白mRNA序列GUUUUGCUUCAACAGUGAUUGAACGAGCAUCGCCAAACGUGCUCUCUCUCUCUUCCGAUCCUUUCUCGCUAAAUUAAUCUUGAAGUACAGUUUGAGAUCCCGUCCGCCAAGCAGCCGAAGAAGAUGGCCGCAACUCAGCCCCGUCAGAACUACCAUGUCGAUUGCGAAGCCCGCAUCAACAAGCAGAUCAACUUGGAACUCUACGCGAGCUACGUCUACACAUCAAUGGCCUACUACUUCGAUCGCGAUGAUGUGGCACUGCCGGGAUUCCACAAGUUCUUCAAGAAGAGCAGCGAUGAGGAGCGUGAGCAUGCCCAGAAGCUGAUGAAGUAUCAAAACAUGCGCGGAGGGCGCGUGGUGCUGCAGGCGAUACAGAAGCCAUCGCGGGACGAAUGGGGCGCAGGCUUGGACGCCAUGCAGGCUGCACUUGAGCUGGAGAAGACUGUCAACCAGUCACUGCUGGACUUGCACAAGCUGGCAAACGAUCAUAAUAACGCUCAGCUGUGCGACUUCCUGGAAAGCGAGUACCUGGAAGAGCAGGUGAAGGCUAUCAAGGAGCUGUCUGACUACGUGACCAACCUGAAGCGUGUUGGCCCUGGCCUCGGAGAGUACAUGUUUGACAAGGAGACCCUAUCAGACUGA23、蜱铁蛋白氨基酸序列 1 maatqprqny hvdcearink qinlelyasy vytsmayyfd rddvalpgfh kffkkssdee 61 rehaqklmky qnmrggrvvl qaiqkpsrde wgagldamqa alelektvnq slldlhklan 121 dhnnaqlcdf leseyleeqv kaikelsdyv tnlkrvgpgl geymfdketl sd三、蜱铁蛋白相关信息（网站、文献查阅）1、通过NCBI检索可知蜱铁蛋白基因全长642bp，编码区为124642nt，编码172个氨基酸残基。在其mRNA5未翻译区(5一UTR)的茎环结构存在铁应答元件(IRE):ttttgcttcaacagtgattgaacgagc，位置在第228个碱基处。2、该蛋白预测的分子量为19.7gkDa，等电点为4.24 3、蜱铁蛋白，是分解代谢性存储器蛋白，由二十四个亚基组成，在中心核区能够鳌合达4500个亚铁离子。4、密码子偏爱性表UUU 14.1( 3) UCU 18.8( 4) UAU 4.7( 1) UGU 0.0( 0)UUC 23.5( 5) UCC 9.4( 2) UAC 42.3( 9) UGC 9.4( 2)UUA 0.0( 0) UCA 18.8( 4) UAA 4.7( 1) UGA 4.7( 1)UUG 14.1( 3) UCG 9.4( 2) UAG 0.0( 0) UGG 4.7( 1)CUU 14.1( 3) CCU 4.7( 1) CAU 14.1( 3) CGU 14.1( 3)CUC 18.8( 4) CCC 4.7( 1) CAC 9.4( 2) CGC 23.5( 5)CUA 4.7( 1) CCA 9.4( 2) CAA 4.7( 1) CGA 4.7( 1)CUG 56.3( 12) CCG 14.1( 3) CAG 56.3( 12) CGG 4.7( 1)AUU 9.4( 2) ACU 9.4( 2) AAU 9.4( 2) AGU 0.0( 0)AUC 18.8( 4) ACC 9.4( 2) AAC 42.3( 9) AGC 18.8( 4)AUA 4.7( 1) ACA 9.4( 2) AAA 0.0( 0) AGA 0.0( 0)AUG 28.2( 6) ACG 0.0( 0) AAG 75.1( 16) AGG 0.0( 0)GUU 4.7( 1) GCU 18.8( 4) GAU 32.9( 7) GGU 0.0( 0)GUC 14.1( 3) GCC 28.2( 6) GAC 32.9( 7) GGC 18.8( 4)GUA 4.7( 1) GCA 28.2( 6) GAA 32.9( 7) GGA 14.1( 3)GUG 32.9( 7) GCG 9.4( 2) GAG 51.6( 11) GGG 4.7( 1)3四、材料和方法1、材料1.1蜱的饲养及试验动物蜱的来源:微小牛蝉（用兔体人工饲养获得蜱的单雌蜱群 文献查阅）。1.2 质粒和宿主菌株 E.coli DH5a菌株、pET-28a(+)表达载体和E.coli BL21(DE3)表达菌株1.2.1 E.coli DH5a克隆菌株条件：1.氨苄青霉素抗性缺陷(Amp-), 2.限制修饰系统缺陷：限制性内切酶缺陷(R）：不含限制性内切酶甲基化酶缺陷（M)：不含甲基化酶 选择该宿主原因：该菌株既不具备自身的限制和修饰作用，常用于转化实验1.2.2 pGEM-T easy克隆载体4pGEM-T Easy 载体系统可用于PCR 产物的克隆。这种载体是通过EcoR酶切pGEM-T Easy 载体，并在3末端加入胸腺嘧啶构建的。插入位点3-T 突出端可提高PCR 产物的连接效率，因为3-T 突出端可以防止载体的自身环化，并且为热稳定性聚合酶产生PCR 产物提供一个匹配碱基。pGEM-T Easy 高拷贝数载体包含有T7 和SP6 RNA 聚合酶启动子，其侧翼和多克隆位点区相接，多克隆位点区位于 半乳糖苷酶的 肽编码区内。 肽插入失活允许在指示培养基用颜色直接筛选重组克隆。pGEM-T Easy 载体的多克隆位点区含有一些这样的限制性酶切位点，采用这些酶进行单酶切消化即可释放插入片段。如pGEM-T Easy 载体多克隆区的EcoR、BstZ和Not酶切位点。这种载体也可选用适当的双酶切消化释放插入片段。pGEM-T Easy 载体含有丝状噬菌体f1 复制起始子，可用于制备单链DNA1.2.3 pET-28a(+)表达载体在本实验中所采用的表达载体pET-28a(+)在其多克隆位点上游有一T7启动子、lac操纵子、六个连续组氨酸标记序列和T7标记序列，下游也有一连续组氨酸标记序列，远端有一T7转录终止序列。T7启动子只能被T7RNA聚合酶所识别，因此表达宿主必需具有编码T7RNA聚合酶的基因序列，否则表达系统便无法进行。1.2.4 E.coli BL21(DE3)表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)是一具有编码T7RNA聚合酶的表达宿主菌，在IPTG诱导下，表达宿主体内合成大量的T7RNA聚合酶。在没有IPTG诱导的情况下，载体质粒自身编码的游离乳糖阻遏物能与操纵基因结合，因而抑制融合蛋白的表达。T7启动子一旦被启动，位于其下游的基因便开始大量被转录。由于T7RNA聚合酶的高效转录，同时亦强烈抑制了宿主聚合酶有效转录宿主基因。2、方法2.1蜱总RNA的分离及cDNA的合成2.1.1 蜱总RNA的提取纯化（采用硫氰酸胡酚氯仿抽提法）5基本原理：高浓度强变性剂硫氰酸胡可以破坏细胞结构，溶解蛋白质，失活RNAase,使核蛋白和核酸分离，所以从细胞中释放出来的RNA不会被降解，通过苯酚和氯仿等有机溶剂处理可以去除蛋白质，最终得到纯化、均一的总RNA。操作过程最好在低温（4）或冰上进行。2.1.2 从总RNA中提取mRNA1、亲和层析法 mRNA分子的3，末端有poly(A)，能与Oligo(dT)碱基配对，先用Oligo(dT)联结在纤维素上，放入RNA混合液中让其充分混合，Oligo(dT)便与mRNA分子3，末端的poly(A)配对，使mRNA吸附到纤维素上，然后装柱过滤，带有mRNA的Oligo(dT)联结的纤维素停留在层析柱上，而其他核酸由于不为层析柱吸附而与mRNA分离。2、超离心法2.1.3 RNA浓度的测定(紫外分光光度计测定)基本原理:非常纯的核酸在260nm处有一吸收峰，相对于该吸收峰，蛋白质在280nm处有一个吸收峰，由于蛋白质吸收峰的覆盖，被蛋白质污染的核酸将在260nm处有一增强了的吸收峰，因此分别读取260nm、280nm处的样品吸收峰， A260/280比值可作为纯度指示。RNAA260/280纯品值为2.RNA浓度 = 0D260 x稀释倍数 x 40/10002.1.4 反转录合成cDNA第一链取1g RNA 按3-RACE或5RACE 试剂盒反转录合成cDNA第一链。1、5 RACE l 在反转录酶的作用下，以已知基因片段内部。特异性引物启始cDNA第一条链的合成 l RNase混合物降解模板mRNA，纯化cDNA第一条链。 l 用末端转移酶在cDNA链3端加入连续的dCTP l 以连有oligo(dG) 的锚定引物和基因片段内部特异的nested引物进行PCR扩增，以期得到目的片段，并可用nest PCR进行检测。62 、3RACEl 是在反转录酶的作用下，以连有可以和polyA配对的oligo(dT)的锚定引物启始cDNA第一条链的合成。l 用RNaseH 降解模板mRNA。l 用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR扩增得到目的3片段，并可用nest PCR的方法继续进行检测和扩增。 2.2 引物设计和PCR扩增目的基因2.2.1引物设计:根据已报道的其它蜱种铁蛋白基因5非翻译区保守的铁蛋白应答元件IRE核苷酸序列，应用primer preimer5软件设计上游外引物、下游外引物采用3-RACE试剂盒中通用引物AUAP。上游:5一GTTTTGCTTCAACAGTGATTGAACGAG一3下游:5一GGCCACGCGTCGACTAGTAC一3(通用引物AUAP)引物设计原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，Tm值在72左右可使复性条件最佳2、引物序列的GC含量一般为45-55%3、引物5端可以修饰、引物3端不可修饰。4、引物自身不能有连续4个碱基的互补、引物之间不能有连续4个碱基的互补。72.2.2第一次PCR扩增:以蜱cDNA第一链为模板，用TaqDNA聚合酶、引物等进行第一次PCR扩增。（1）在扩增管中加入以下成份:成份加样量PCRbuffer5mlcDNA第一链(模板)2mldNTPmix1ml上游引物3mlAUAP3mlTag聚合酶1mlddH2035ml总体积50ml（2）混匀，加入3050ml矿物油、离心。（3）94温育3min。（4）2.3目的基因的克隆和测序2.3.1回收目的基因片段上述PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，小心切割目的片段的胶块，采用相关技术进行回收，DNA回收技术主要有以下几种：1、电泳洗脱。即将含有DNA条带的一条琼脂糖放入到电泳仪内的透析袋中，当电流通过凝胶，DNA样品就从凝胶中迁移出来，进入装有缓冲液的透析袋内。82、割下的胶条放在eppendorf管中，将之捣碎并放于-80冰冻5min，取出后迅速放置于37保温10min，如此反复3次能使DNA从胶中游离出来，离心获得上清中即含有目的DNA，可通过沉淀浓缩获得高浓度。对一般的DNA片段回收效率在6080%。操作简单，并不需特殊设备。3、DNA试剂盒回收目的基因 2.3.2 连接将上一步回收的目的片段连接到pGEM-T easy载体上。1、在1.5mL离心管中加入以下成份成份标准反应体系(ml)连接缓冲液5T-easy载体1PCR回收产物2T4DNA连接酶1ddH201总体积102、混匀，室温下温育1小时，或在4放置过夜。2.3.3转化克隆2.3.3.1新鲜感受态细胞的制备大肠杆菌在特殊试剂的处理下，即在低温时（0）被置于低渗的CaCl2溶液时，细菌菌体膨胀成球形，处于感受态，易于接受外源DNA。2.3.3.2 将重组质粒转化E.coli DH5a1、CaCl2法:在CaCl2中温育细胞，接着温和热休克，使温度从冰上的4快速升至41，然后再快速冷却细胞。2、电击法：高压电流穿过含有细菌宿主细胞核质粒载体DNA的溶液，电流导致细菌宿主细胞质膜上通道和孔洞的瞬间迅速打开，质粒载体DNA通过孔道进入宿主细胞。2.3.4 重组子的筛选由于载体上含有氨苄青霉素抗性基因和LacZ基因的部分片段，可以利用蓝白斑筛选含有重组质粒的大肠杆菌菌落。2.3.5 PCR鉴定阳性克隆并测序为避免假阳性，需从蓝白斑中筛选阳性克隆，热裂解粗提质粒，基因特异性引物PCR鉴定;挑取阳性克隆送测序。92.3.5.1碱裂解法抽提质粒基本原理：碱裂解法是利用细菌染色体DNA与质粒DNA结构的大小差异来分离质粒DNA的一种方法。碱性条件可以破坏碱基配对，宿主和质粒DNA的碱基之间的氢键被破坏。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），共价闭合环状的质粒DNA会迅速准确地恢复配对，重新形成全天然的超螺旋分子，而较大的细菌染色体DNA分子则难以恢复，会交联形成不溶于水的絮团结构，缠绕附着在细胞壁上。离心时易被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤即可获得。2.3.5.2 PCR鉴定阳性克隆:用铁蛋白基因特异性引物，以抽提的质粒为模板进行PCR扩增反应，观察是否有特异性条带被扩增，确定目的片段是否插入克隆载体。直接凝胶电泳检测法：利用凝胶电泳检测重组质粒DNA分子的大小，可以证明外援基因片段确以插入载体，带有外源DNA插入序列的重组体DNA电泳时迁移率较非重组质粒要慢。2.3.5.3测序:用牙签挑取经过鉴定的阳性克隆到液体培养基中，一定条件下，摇床培养过夜。培养产物送基因公司测序鉴定。2.3.5.4序列分析所得序列用Gentyx一MAC软件对该基因的开放阅读框、预测氨基酸序列及其分子量大小和等电点进行分析。并登录NCBI与相近物种及其它物种铁蛋白预测氨基酸序列进行Blast，分析氨基酸序列的保守区域。2.4铁蛋白基因的原核表达及亲合纯化2.4.1引物:在铁蛋白基因编码区(ORF)两侧设计引物，使分别带有EcoR l(GAATTC)和Hind lll (AAGCTT)酶切位点。EcoR l上游5一GAATTCATGGCCGCTACTCAGCCC一3Hind lll下游5一AAGCTTGTCGGATAGGGTCTCCTTGTCAAACAT一3102.4.2 PCR扩增:将含铁蛋白全长基因的阳性质粒用ddH2O I:100倍稀释，作为模板，用2.4.1步设计的引物进行PCR扩增。2.4.3 TA克隆:1.5%DNA琼脂糖电泳，切割目的条带，用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，连接到pGEM-T easy载体上，制备新鲜感受态细胞DH5a并转化，进行TA克隆。2.4.4用PCR方法或直接凝胶电泳检测法鉴定阳性克隆2.4.5双酶切:将阳性克隆和空载体细菌分别接种到液体培养基上，一定条件下，摇床培养过夜，碱裂解法抽提质粒，用EcoR I和Hind lll对阳性重组质粒和表达载体pET-28a(+)进行双酶切，获得含粘性末端的目的片段和线状载体。双酶切:成份加样量ml缓冲液4EcoR I1Hind lll1铁蛋白重组质粒DNA34总体积4040反应体系，37酶切2h成份加样量ml缓冲液4EcoR I1Hind lll1pET-28a(+)质粒DNA34总体积4040反应体系，37酶切2h2.4.6 重组表达质粒克隆:酶切充分后，1.5%DNA琼脂糖凝胶电泳，切割目的条带，用DNA胶回收试剂盒分别回收经酶切的目的基因和载体，16条件下，用T4DNA连接酶连接过夜，取适量连接产物转化新鲜感受态细胞DH5a。11连接体系:成份加样量ml10 x 连接缓冲液2.5T4DNA连接酶2酶切pET-28a(+)14酶切的目的基因6.5总体积25ml反应体系25ml体系，16，连接过夜2.4.7重组质粒的鉴定: PCR方法鉴定阳性克隆，过夜培养阳性克隆，提取阳性质粒，制备新鲜感受态细胞BL21(DE3)表达菌，再转化，筛选阳性克隆，抽取阳性重组质粒，进行用EcoR l和Hind lll进行酶切鉴定，并进步测序确证。2.4.8时相表达:取处于对数生长期阳性质粒转化菌和空质粒转化菌，用LB液体培养基作1:100倍分别稀释成10mL，37 220rpm培养3h一4h，使OD600值达到0.6，各加入10omM IPTG 100ml诱导表达。分别取诱导后lh，Zh，3h，4h表达产物500ml，按常规方法进行SDS一PAGE电泳，考马氏亮兰染色，脱色后拍照。2.4.9分离纯化目的蛋白:参考步骤2.4.8，用IPTG大量诱导表达微小牛蜱铁蛋白重组表达细菌，收集诱导表达的菌体，用BugBuster HisBind纯化试剂盒说明书操作，重组蛋白的载体pET-28a(+)两端各带有六个连续组氨酸His，能吸附在树脂中的镍离子上，从而分离纯化出目的蛋白，得到纯化产物后SDS一PAGE电泳鉴定。2.5 WesternBlot方法检测微小牛蜱铁蛋白（文献查阅）12将微小牛蜱铁蛋白重组表达细菌粗提物和空载体细菌粗提物以及预染标准分子量蛋白经15%SDS一PAGE电泳，电转印到硝酸纤维膜上;含5%脱脂牛奶的PBST封闭过夜:用兔抗微小牛蟀唾液抗体作一抗，健康兔血清作为阴性对照，含5%脱脂牛奶的PBST I:1000稀释，反应3h;PBST洗膜三次，每次10min;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作二抗