不同環境因子對Pseudomonas fluorescens 降解酚污染物之效率.doc

鍾翠萍 顏沛欣 莊瑞鑫 不同環境因子對Pseudomonas fluorescens降解苯酚污染物之效率不同環境因子對Pseudomonas fluorescens降解酚污染物之效率鍾翠萍、顏沛欣、莊瑞鑫*元智大學化學工程系Efficiencies of Phenol Biodegradation by Pseudomonas fluorescens with Different Environmental FactorsTsuey-Ping Chung, Pei-Shin Yan, Ruey-Shin Juang*Department of Chemical Engineering, Yuan Ze University, Chung-Li 320, Taiwan*Fax: +886-3-4559373E-mail: .tw摘 要本研究主要是探討Pseudomonas fluorescens CCRC 14347菌種降解酚的情形。首先對不同生長時期之Pseudomonas fluorescens做酚降解實驗，結果顯示Late-exponential stage降解100 ppm酚的降解效率最好。接著收集Late-exponential stage的菌體，改變對其可能影響最大的四個環境因子（pH值、操作溫度、碳源（Glucose）、氮源(Ammonium sulfate)），測定酚的降解效率。配合使用實驗設計之應答區面法（亦即Box-Behnken法），將上述每個因素各選擇五個適當條件，經由二階二次多項式加以回歸最適化後，可得知各因素的影響程度及相互效應。統計分析結果顯示，此種回歸模式有不錯的吻合性，其R2值(Correlation coefficient)高達0.9358，至於F值(Fishers F test)則為14.59。最後，本文亦確定溫度及pH值兩環境因子對降解酚效率之重要性，此外並討論了其最佳的操作條件。關鍵詞：P. fluorescens、酚、降解、環境因子、實驗設計、應答區面法、回歸模式 莊瑞鑫 元智大學化學工程系教授TEL: (03) 4638800轉555E-mail: .tw鍾翠萍 元智大學化學工程系學生顏沛欣 元智大學化學工程系學生第七屆生化工程研討會論文集1. 前言苯酚(Phenol)是造紙、煉焦、煉油、塑膠、紡織等廢水中的主要污染物，美國環保署把苯酚列入優先污染物和65種有毒污染物名單，台灣環保署也把酚列入水污染之管制項目。苯酚的污染會傷害棲息地中的動植物，導致食物鏈中有毒化學物質的攝取和累積，濃度過量時，會引起人類慢性中毒，或微量的苯酚（超過0.002 mg/L）與消毒用的氯結合時，形成的氯酚是致癌物質，對人類的健康有嚴重的威脅。清除工業廢水中酚的方法包括：微生物降解、萃取、活性碳吸附、和化學氧化等，其中利用微生物進行降解，發展生物復育技術以清除環境中的有機污染物，不僅能減少對環境的衝擊，亦可得到經濟的效益；因此當細菌被用來清除受污染的環境時，微生物分解芳香族類化合物的基礎研究受到人們深切的關注 3。2. 材料與方法2.1 微生物菌種Pseudomonas fluorescens（菌號14347，批號12-17-98，培養基11，溫度30 oC）菌種由食品工業發展研究所菌種保存及研究中心所提供。2.2 培養基及試劑(1) Pseudomonas fluorescens之培養基(Basal medium)：Yeast extract 3.0 g/L，Malt extract 3.0 g/L，Peptone 5.0 g/L，Dextrose 10.0 g/L，Agar 15 g/L 1。(2) Pseudomonas fluorescens之營養鹽(Minimal medium)：KH2PO4 0.42 g/L，K2HPO4 0.375 g/L，(NH4)2SO4 0.244 g/L，NaCl 0.015 g/L，CaCl22H2O 0.015 g/L，MgSO47H2O 0.05 g/L，FeCl36H2O 0.054 g/L 1。2.3 設備紫外線-可見光譜儀：Jasco V-550型，日本分光株式會社。高溫殺菌鍋：AutoClave TH-104 DG型，造鑫實業已有限公司。無菌操作台：Horizontal laminar flow table type TH-22型，造鑫實業已有限公司。恆溫振盪水槽：Water bath incubator BT47型，Yamato有限公司。2.4 菌株酚降解效率之測定將購得之Pseudomonas fluorescens菌種培養於固態Basal medium上，30 oC培養約24 h，使用白金接種環，取單一菌落，接種於液態Basal medium中以30 oC、120 rpm恆溫水浴槽預培養至各生長期，於各選定時間取樣，經離心(2000 rpm、5 min)後，沉澱物加入PBS清洗，在相同條件再離心5 min，將菌體加入含酚100 ppm Minimal medium之中，溫度30 oC；攪拌速度100 rpm水浴培養，於適當時間間隔取出菌液，以UV測量在波長600 nm之菌株O.D.值及在500 nm下利用4-氨基安替比林法測定苯酚之含量。2.5 環境因子效應實驗設計及分析方法實驗前先調配Minimal medium，然後外加藥品探討改變環境因子的變化對降解的影響，配製方法如表1。將預培養後的菌株放入實驗前已經預處理含苯酚100 ppm Minimal medium之中，溫度30 oC；攪拌速度100 rpm水浴培養，於適當時間間隔取出菌液，以UV測量在波長600 nm之菌株O.D.值及在500 nm下利用4-氨基安替比林法測定苯酚之含量。3. 結果與討論3.1各生長期之生物降解由圖1可知細菌生物量隨時間的增生情況，Log stage自第1小時、Late-exponential stage自第1小時、及Stationary stage自第3小時開始增生，最大增生速度及發生時間分別為：Log stage第11小時1.9 x 10-2 OD/h、Late-exponential stage第12小時2.07 x 10-2 OD/h、Stationary stage第15小時1.58 x 10-2 OD/h。計算各期的降解速率如圖2，各期降解最大速率及時間分別為: Log stage在第5小時到達降解最大速率40.04 ppm/(h OD)、Late-exponential stage在第4小時到達降解最大速率70.83 ppm/(h OD)及Stationary stage在第7小時到達降解最大速率36.17 ppm/(h OD)。由以上之實驗結果選取分解速率最快，預培養不添加Phenol的Late-exponential期作為Pseudomonas fluorescens生物降解Phenol之實驗的細胞來源。3.2 迴歸模式統計分析表2是Pseudomonas fluorescens降解Phenol效率的實驗值及由統計軟體依據實驗值計算而得的預測值。本設計方法中，若個別環境因子的參數及它們的組合參數，集中或是小於5%代表它是重要的影響因子，所以我們由表3中得知Temperature和pH值是最重要的，代表影響降解Phenol效率最大的環境因子是溫度，其次是pH值。Regression model的係數計算結果被列於表4，它包含了3個線性，3個2次方程式和3個互相影響的條件和1組空白條件。降解效率可當作是可變的變數之方程式的特徵，被分析的是其階乘設計的結果。由表4可知，實驗的R2 = 0.9358、標準偏差值(Root MSE/Dep Mean) = 14%，效果還不錯。4. 結論綜合以上研究結果，可歸納出下列幾點:(1) 本研究結果發現Lateexponential stage的細胞生長速率最大加上其活性大、分解速率最快、反應時間最短，因此Late-exponential stage作為往後Pseudomonas fluorescens生物降解Phenol之實驗的細胞來源。(2) 統計分析結果顯示，這四個環境變因中，影響降解效果最顯著的是Temperature，其次是pH。預測值之R2 0.9358、F 14.59、標準偏差值14%。(3) 經由實驗設計法，找出最佳操作條件為pH值7，溫度30 oC、Glucose 0.6 g/L、Ammonium sulfate 0.6 g/L，其降解率達97%。參考文獻1 Alvaro, A. M. G., Rui, A. R. and Alirio, E., Phenol biodegradation by Pseudomonas putida DSM548 in a batch reactor, Biochem. Eng. J., 6 45-49 (2000).2 Annadurai, G., Lee, D. J. and Juang, R. S., Box-Behnken studies on dye removal from water using chitosan and activated carbon adsorbents, J. Chin. Chem. Engrs., 31, 609-615 ( 2000).3 陳大裕，固定化微生物處理酚類廢水研究，碩士論文，元智大學化工研究所，中壢，1995。4 林春志，Pseudomonas fluorescens分解芳香族碳氫化合物之研究，碩士論文，中央大學環境工程研究所，中壢，1997。5 沈俊男，真菌固定化系統處理酚類污染物之研究，碩士論文，中央大學環境工程研究所，中壢，1995。6 張家豪，纖維床生物反應器處理甲苯氣體污染物之研究，碩士論文，中央大學環境工程研究所，中壢，1999。表1、實驗軟體設計數據pH溫度 (oC)葡萄糖 (g/L)硫酸銨(g/L)14250.60.6210250.60.634350.60.6410350.60.657300067301.20773001.287301.21.294300.601010300.60114300.61.21210300.61.21373000.61473000.6157301.20.6167301.20.61743000.618103000.6194301.20.62010301.20.6217250.60227350.60237250.61.2247350.61.2257300.60.6267300.60.6277300.60.6287300.60.6297300.60.6表2、Experimental and theoretical predicted valu