构建无背景的选择性感染噬菌体.doc

构建无背景的选择性感染噬菌体 1000-8861 (xx)05-0484-03构建无背景的选择性感染噬菌体陈颖,李海,吴文言(中山大学生命科学院生物医药中心,广州510275)xx-07-07;修回日期xx-12-05基金项目国家自然科学基金资助项目 (30271580)作者简介陈颖(1980-),女,广东广州市人,硕士生,主要从事生物化学与分子生物学方面的研究。 (Tel(E-mail)vividlivelyhotmail.通讯作者摘要目的构建一个选择性感染噬菌体(selectively infective phage,SIP)载体。 方法删去M13KO7gIII基因的第2个甘氨酸丰富区,并在此位置插入3个内切酶识别位点,用于外源基因的插入,构建成重组噬菌体基因组BP-M13KO7。 将重组噬菌体BP-M13KO7的培养液上清液感染XL1-Blue,检测其感染背景。 结果重组噬菌体BP-M13KO7培养液上清液不具有感染性,完全消除了背景。 结论通过将M13KO7gIII基因的第2个甘氨酸丰富区置换成3个内切酶识别位点,构建成的重组噬菌体无感染性背景。 关键词选择性感染噬菌体;M13KO7;甘氨酸丰富区Q7-1AConstruction ofa non-background selectively infective phageCHENYing,LI Hai,WU Wen-yan(Biopharmaceutical Center,School ofLife Science,Sun Yat-sen University,Guang-zhou510275,China)AbstractObjectiveTo constructa non-background selectivelyinfective phage(SIP)vector.MethodsThe secondGly-rich regionin gIIIp of M13KO7was deleted,and replacedwith afragment containing3enzyme recognitionsites forforeign genes.The infectious back-ground ofthe resultingphage wasexamined byinfecting culturesupernatant of BP-M13KO7with XL1-Blue.ResultsInfectivity backgroundwasnot found.A non-background SIPwas suessfullyconstructed.ConclusionSelectively infectivephage,constructed bydisplacing thesecondGly-rich regioningIIIpofM13KO7with fragmentcontaining3enzyme recognitionsites,is pletelydeleted withinfectiousback-ground.Key wordsSelectively infectivephage;M13KO7;Gly-rich region选择性感染噬菌体(selectivelyinfectivephage,SIP)技术比传统噬菌体展示技术1更方便、快捷。 该技术利用抗原与抗体之间的结合作用,以噬菌体为载体,一步筛选到抗原的抗体。 只要能够形成噬菌斑的克隆就是抗原与抗体发生相互作用的克隆,而不需要用ELISA2等方法进行筛选鉴定。 特别适合于筛选蛋白多肽的高亲和力的配体。 丝状噬菌体次要衣壳蛋白gIIIp有三个结构域,分别完成两个功能:感染和参与组装。 SIP的技术核心是利用DNA重组技术分离三个结构域,从而分离这两个功能,使得组装出膜的噬菌体不具有感染性3。 理想的SIP载体应满足以下要求:载体未连入可相互作用的蛋白组合时,产生的噬菌体不具有感染性。 但是目前所报道的SIP载体未能满足此要求。 本实验根据M13基因组结构紧凑性的特点,利用M13本身的gIII基因启动子启动N1-N2-抗原、抗体-CT两个读码框的转录,以此减轻噬菌体的负担,最终消除了SIP载体的感染背景。 1材料与方法1.1材料XL1-Blue:recA1,endA1,gyrA96,rhi-1,hsd17,SupE44,relA1,Iac(F+proAB+、Iac1q、Zde1M 15、Tn10),为本实验室保存。 M13KO7购自Amersham Biosciences公司。 1.2BP-M13KO7的构建以M13KO7为出发质粒,将其gIII上的第2个甘氨酸丰富区编码序列换成NS片段。 由于NS片段不能直接连入M13KO7,所以先合成BP片段,BP片段由gIII第2个甘氨酸丰富区两翼和NS片段组成,其两端分别是BamH和Pac的识别位点(图1)。 将BP片段用BamHPac酶切连接入经相同酶处理的M13KO7。 NS片段的序列如下:GCTAGCTAAGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATTCTCACTCC CCTAGGTGAGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCT484免疫学杂志第22卷第5期xx年9月IMMUNOLOGICAL JOURNALVol.22No.5Sept.xxDOI:10.13431/j.ki.immunol.j.xx0135TTCTATTCTCACTCCACTAGT。 其中GCTAGC是Nhe酶切位点,设计用于抗原的插入;CCTAGG是Avr酶切位点,设计用于抗体轻链的插入;ACTAGT是Spe是酶切位点,设计用于抗体重链的插入。 灰色显示的是gIII的信号肽。 图1M13KO7的改造示意图Fig1Diagram ofM13KO7reform1.3BP-M13KO7的背景检测将BP-M13KO7质粒转化新鲜制备的大肠杆菌XL1-Blue,从平板上挑克隆培养至A600nm0.81.2,离心分离培养上清液部分和菌泥。 上清液用于感染实验4以检测是否有噬菌斑。 菌泥用LB重悬后按1100扩增培养BP-M13KO7的细菌培养物,连续扩增培养9代,每代均取上清液用于感染实验。 2结果从经过鉴定为BP-M13KO7的克隆中取4个克隆做上清液感染实验,均未发现感染性背景。 为了方便对该载体进行操作,对其进行了稳定性的摸索。 将这些克隆连续传9代,每代均取上清液用于感染实验,结果发现其中3个克隆一直没有出现感染现象,保持了稳定性。 只有一个克隆从第4代开始出现感染现象,一直到第8代消失,在此过程中呈现减弱的趋势(表 1、图2),且其噬菌斑外观比较清晰,直径也比较大,与野生型噬菌斑有明显的不同(图3)。 3讨论本实验设计的无感染背景的SIP载体与其它SIP载体相比主要特点为:一是前者没有另外加入启动子;二是外源基因的插入位点只用一个内切酶识别位点。 如此设计是为了达到以下目的:减轻噬菌体的负担。 因为噬菌体本身的基因组结构是很紧凑的,除了gIII和gVIII之间有一小段非编码区、gII和gIV之间有508bp的非编码区之外,基因组的其它序列都是编码蛋白的基因。 而且,根据文献报道,gIII和gVIII之间的非编码区有可能是整个噬菌体的中心终止信号(central terminator)5及一弱启动子6。 而在gII和gIV之间的508bp非编码区则是噬菌体基因组控制元件的集中地。 所以M13噬菌体基因组基本上没有冗余序列。 针对M13的这个特点,本实验设计的SIP载体也不给噬菌体添加多余的碱基序列。 因此,采用gIII的启动子连续完成N1-N2Ag、V L和V HCT三个读码框的转录。 在进行蛋白翻译的时候,以上三个读码框首尾相连紧密,虽然有可能出现翻译效率比较低的现象,但是从理论上来说,核糖体能够连续完成三个读码框的翻译。 而这种低效率不仅不影响噬菌体的形成,还可减轻噬菌体和宿主菌的负担。 有文献报道,理论上失去感染性的SIP载体会回复感染性7,该文认为这种感染性回复是由gIIIp的两部分结构域基因重排而引起的。 然而该文作者将N1-N2结构域与CT结构域换位后,这种感染性回复现象虽然降低了,但没有消失。 故本文推测:噬菌体的负担过重也是其感染性回复的原因之一。 而且具有两个串联启动子的人工质粒尤其容易产生缺失8。 所以,本SIP载体不在N1-N2Ag、V L和V HCT三个读码框前设计相同的强启动子,意在避免此弊端。 另外,在载体的设计上使用了同尾酶:Nhe、Avr和Spe,这对于克隆操作可能会不太方便,主a)Bacteria withoutinfection;b)Generation5of clone4;c)Genera-tion6of clone4;d)Generation7of clone4图2BP-M13KO7感染结果Fig2Infection ofBP-M13KO7a)M13KO7plaque;b)BP-M13KO7plaque图3两种噬菌斑比较Fig3Comparison oftwo typesof plaques485第5期陈颖,等.构建无背景的选择性感染噬菌体表1BP-M13KO7感染实验结果Tab1Infectivity testofBP-M13KO7Generation CloneCulturehFinal cellden-sity(A600nm)Infection11234171.3910.7441.2710.830No plaque212349.51.1801.1880.9441.241No plaque31234141.7401.6401.5901.604No plaque4123460.7050.6550.6400.637No plaqueOnlycell coloniescould beseen51234914.51.4181.3601.3481.317No plaqueNocell coloniesor plaquesa61234650.7580.6930.6500.343No plaqueNocell colonies,but largepla quesappeared a7123481.4211.3661.2782.053No plaqueLargeplaques declinedin quantitya812348.51.1971.3951.4032.100No plaque91234111.5201.4991.5221.880No plaquea)Ilustrated inFig2要是外源基因的插入方向问题。 在设计外源基因引物时要使用不同的同尾酶识别序列,通过测序可以确定外源基因的插入方向。 而在实际操作中,反向插入载体的基因读码框通常很快就会终止,不能形成融合蛋白,在淘选的时候能自动被淘汰。 从BP-M13KO7的感染实验结果,我们可以看到,载体的背景完全消除了,说明两个强启动子的存在的确会给宿主菌和噬菌体造成负担,而使其更易突变。 由于本实验构建的载体仍然是噬菌体的衍生物,在一定程度上具有不稳定性,可能在三代后产生突变,所以操作中要注意使用新鲜制备的载体。 参考文献1宫爱艳,蔡家利.噬菌体抗体库技术应用研究进展J.免疫学杂志,xx,20 (3):59-61.2刘北一,李一,富宁,等.三种检测噬菌体阳性克隆的ELISA比较J.免疫学杂志,1998,14 (1):54-55,63.3隋建华,宋增璇.选择感染性噬菌体(SIP)技术:一种新的相互作用分子筛选技术J.生物化学与生物物理进展,1999,26 (4):407-409.4张建琼,张雪萍,林陵,等.辅助噬菌体扩增与定量条件的研究J.南京铁道医学院学报,1999,18 (1):13-15.5Edens L,Konings RN,Schoenmakers JG.Physical mappingofthe centralterminator fortranscription onthe bacteriophageM13genomeJ.Nucleic AcidsRes,1975,2 (10):1811-1820.6Edens L,Konings RN,Schoenmakers JG.Transcription ofbacteriophageM13DNA:existe