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NY_T 2066 微生物肥料生产菌株的鉴别 聚合酶链式反应(PCR)法 ICS 65.080B 10中华人民共和国农业行业标准NY /T 2066?2011微生物肥料生产菌株的鉴别聚合酶链式反应 PCR 法Differentiation for strain of microbial fertilizer production by PCR method2011-09-01 发布 2011-12-01实施中华人民共和国农业部 发布NY /T 2066?2011前 言 本标准按照 GB / T 1.1?2009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位:农业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心、中国农业科学院农业资源与农业区划研究所。 本标准主要起草人:关大伟、曹凤明、杨小红、李俊、沈德龙、姜昕、冯瑞华、陈慧君、李力。NY /T 2066?2011微生物肥料生产菌株的鉴别聚合酶链式反应 PCR 法1 范围 本标准规定了 PCR 方法鉴别微生物肥料生产菌株的技术要求。 本标准适用于微 生物肥料生产菌株的鉴别。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB / T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB / T 19495. 3? 2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB 20287 农用微生物菌剂 NY / T 1736 微生物肥料菌种鉴定技术规范 NY / T 1847 微生物肥 料生产菌株质量评价通用技术要求3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 微生物肥料生产菌株 strain for microbial fertilizer production 从自然界分离筛选或经人工诱变,具备微生物肥料功能,并可用于生产的菌株。以下将其简称为“ 菌株 ” 。3.2 鉴别 differentiation 确证菌株典型特征,判定该菌株是否为目标菌或具有某种功能基因片段的过程。3.3 多重 PCR multiplex -PCR 在同 一 PCR 反应体系中,利用两对以上的引物,可同时扩增多个基因片段。4 原理 DNA 是生物体的遗传物质,携带所有的遗传信息,从 DNA 分子水平上进行鉴别是区分物种、品种甚至个体之间差异的最为有效的方法。本方法采用种属特异性引物或重复序列引物对待测菌株基因组DNA 进行 PCR 扩增,使用电泳分离 PCR 产物,通过比较 PCR 产物的序列或大小及数量是否与预期相一致,鉴别菌株是否为目标菌。5 PCR 反应要求5.1 一般要求5.1.1 实验室操作人员应具备良好的分子生物学 专业技能,操作熟练。1NY /T 2066?20115.1.2 有毒、有害、废弃物质的处理及安全防护应符合 GB / T 19495.2 的要求。5.2 PCR 反应的质量控制5. 2.1 每个 PCR 反应均应设立两个平行实验。5.2.2应设置空白对照、阳性对照和阴性对照,空白对照的 PCR 反应体系中以水代替 DNA 模板,阳性对照使用与目标菌株同种的模式菌株或参比菌株的 DNA 为模板,阴性对照采用不含目标序列的 DNA为模板。5.3 引物5.3.1 基本要求 ? 每个引物长度为 18 个 30 个核苷酸; ? 两引物之间 不应互补,尤其是 3 末端不存在互补性; ? 引物自身不形成二级结构; ? 引物的 GC 含量为 40% 60% 。5.3.2 菌株鉴别的引物设计要求5.3.2.1 引物设计的靶标 DNA (基因)片段 ? 用于属、种水平的鉴别基因有 16S rRNA 、 23S rRNA 和 18S rRNA 等; ? 用于种、亚种水平的鉴别 DNA 片段有 16S 23S rRNA 间隔序列、 26S rRNA 中 D / D 区域、1 2 18S 28S rRNA 间隔序列、 rpo A 、 rpo B 和 gyr B 基因等; ? 用于菌株水平的鉴别 DNA 片段有 ERIC 、 BOX 和 REP 等重复序列; ? 用于菌株功能鉴别的基因片段,依据 NY / T 1847 的菌株功能分类进行其引物的设计。5.3.2.2 设计的引物应和 GenBank 、 EMBL 等核酸序列数据库中的标准菌株 DNA 序列作同源性比对,评价是否与近缘菌种具有同源序列。根据鉴别对象与需要,可选择二对以上的引物,并做同源比较。5.3.2.3 依据设计合成引物序列,对其进行鉴别能力与范围的评价实验,以确认其适用性。5.3.2.4 用于微生物肥料常用菌株种水平鉴别 的靶基因和引物序列见附录 A ,菌株水平鉴别的靶基因和引物序列见附录 B 。5.4 模板 DNA 提取及其浓度测定5. 4.1 DNA 提取方法参见附录 C 。5.4.2DNA 浓度测定按照 GB / T 19495.3 的规定执行。5.5 扩增反应5.5.1 优化 PCR 反应条件,特别是镁离子浓度和热循环条件。5.5.2 对多重 PCR 反应,应适当增大模板 DNA 、引物、聚合酶和 dNTP 用量,且在各引物解链温度Tm 允许范围内选择较高的退火温度。5.5.3 反应参数见附录 A 和附录 B 。5.6 PCR 产物的 确证5.6.1 以 ERIC - PCR 、 BOX - PCR 和 REP - PCR 等方法对菌株水平鉴别时,应与其阳性对照 PCR 产物电泳图谱带型进行比较。5.6.1.1 使用除 5. 6.1 外的其他 PCR 方法鉴别待测菌株时,应测定扩增的阳性产物的序列,并通过序列比对确证其是否为日标序列。6 结果判定6.1 出现下列情况之一,则判定本次鉴定的结果无效,应重新进行实验。 ? 两份平行测试样品的结果不一致;2NY /T 2066?2011 ? 空白对照或阴性对照出现条带; ? 阳性对照未出现预期大小的扩增条带。6.2 若待测菌株的 PCR 反应扩增出目标片段,且 PCR 产物经过确证,片段的序列或大小及数量与预期一致,则判定待测菌株为目标菌或具有某种功能基因片段。反之,则判定待测菌株不是目标菌或不具有某种功能基因。3NY /T 2066?2011附 录 A(规范性附录)微生物肥料常用芽孢杆菌、光合细菌和乳杆菌的 PCR 鉴别方法A . 1 范围 本方法规定了鉴别微生物肥料中常用芽孢杆菌、乳酸菌和光合细菌的 PCR 方法。 本方法适用于微生物肥料中常用芽孢杆菌、乳酸菌和光合细菌的鉴别。其中芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽 孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌;乳酸菌包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌;光合细菌包括沼泽红假单胞菌和类球红细菌 。A . 2 试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水。A . 2.1 10 PCR 缓冲液(不含氯化镁)。A . 2.2氯化镁 MgCl225 mmol / L 。A . 2.3 dNTP 溶液,含有 dATP 、 dTTP 、 dCTP 和 dGTP ,各 2.5 mmol / L 。A . 2.4 DNA 聚合酶。A . 2.5 阳性对照菌株。A . 2.6 阴性对照菌株。A . 2.7 50 TAE 缓冲液:称取 242 g Tris 碱,量取 57.1 mL 冰醋酸, 100 mL 0. 5 mol / L EDTApH8.0 溶解于水中,定容至 1 L 。A . 2.8 6 上样缓冲液:含 0.25% 溴酚蓝, 0.25% 二甲苯青 FF , 30% 甘油水溶液, 4 保存。A . 2.9 DNA 分子量标记物 100 bp l 000 bp 。A . 2.10 琼脂糖。A . 2.11 PCR 反应管。A . 3 仪器和设备A . 3.1 PCR 仪 。A . 3.2 电泳仪。A . 3.3 凝胶分析成像系统或照相系统。A . 3.4 超净 工 作台。A . 3.5 小型离心机。A . 3.6 微量可调移液器 2.5L 、 10L 、 100L 、 1000L 。A . 4 操作步骤A . 4.1 待测菌株的准备A . 4.1.1 待测菌株纯度检测 按照 NY / T 1736 规定的方法对待测菌株进行纯度检测。A . 4.1.2 待测菌株增菌培养4NY /T 2066?2011 将纯度检验合格的菌株接种于适宜的培养基中,在适宜的条件下培养至对数生长期。培养基配方见 G B 20287 。A . 4.2 待测菌株 DNA 的提取 按附录 C 的规定执行。A . 4.3 PCR 扩增A . 4.3.1 引物 从表 A.1 中选择相应的引物,如果有必要可以筛选新的引物。A . 4.3.2 PCR 反应体系 PCR 反应总体积为 20L ,含有 10 PCR buffer , 0.2 mmol / L dNTP , 1U Taq DNA 聚合酶, 0.4mol / L 引物, 10 ng 50 ng 模板 DNA ,不同菌种加入氯化镁溶液 25 mmol / L 浓度不同,具体见表A.1 ,加灭菌双蒸水至 20L 。A . 4.3.3 PCR 反应参数 PCR 反应参数见表 A.1 。A . 4.4 PCR 扩增产物的电泳检测 根据扩增产物的大小,用电泳缓冲液 1 TAE 制备相应浓度琼脂糖凝胶 55 60 时加入溴化乙锭至终浓度为 0.5g / mL 。取 PCR 扩增产物 5L ,与 1L 上样缓冲液混合,进行点样,同时用DNA 分子量标记物做参照。 3 V / cm 5 V / cm 恒压电泳,电泳 20 min 40 min ,电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。A . 4.5 结果判定 若待测菌株 的 PCR 反应扩增出目标片段 , 且 PCR 产物经过确证,片段的序列与预期一致,则判定待测菌株为目标菌。反之,则判定待测菌株不是目标菌。5NY /T 2066?20116NY /T 2066?2011附 录 B(规范性附录)微生物肥料生产菌种的菌株水平鉴别 PCR 方法B . 1 范围 本方法规定了鉴别微生物肥料菌株水平差异的 PCR 方法。 本方法适用于微生物肥料菌株水平的鉴别。B . 2试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水。B . 2.1 100% 二 甲基 亚砜 DMSO , C H O S 。2 6B . 2.2 牛血清白蛋白 BSA 。 其余试剂同 A . 2 。B . 3 仪器和设备 同 A . 3 。B . 4 操作步骤B . 4.1 待测菌株的准备 同 A . 4.1 。B . 4.2 待测菌株 DNA 的提取 按附录 C 的规定执行。B . 4.3 PCR 扩增B . 4.3.1 引物 使用表 B . 1 所列的 三 个引物。如果有必要可以筛选新的引物。B . 4.3.2 PCR 反应体系B . 4.3.2.1 ERIC-PCR 反应体系 PCR 反应 总体积为 25L ,含有 10 PCR buffer , 0.2 mmol / L dNTP , 2U Taq DNA 聚合酶, 0.4mol / L 引物, 2.5 mmol / LMgCl , 10 ng 50 ng 模板 DNA ,加灭菌双蒸水至 25L 。2B . 4.3.2.2 BOX - PCR 反应体系 PCR 反应总体积为 25L ,含有 1 0 PCR buffcr , 0.2 mmol / L dNTP , 2U Taq DNA 聚合酶, 5.6mmol / L MgCl , 0.4mol / L 引物, 2.5L 100%DMSO , 0.08 mg / mLBSA , 10 ng 50 ng 模2板 DNA , 加灭菌双蒸水至 25L 。B . 4.3.2.3 REP-PCR 反应体系 PCR 反应总体积为 25L ,含有 10 PCR buffer , 0.2 mmol / L dNTP , 2.5U Taq DNA 聚合酶, 2.0mmol / L MgCl , 0.4Lmol / L 引物, 10 ng 50 ng DNA 模板,加灭菌双蒸水至 25L 。2B . 4.3.3 PCR 反应参数 见表 B . 1 。7NY /T 2066?2011B . 4.4 PCR 扩增产物的电泳检测 根据扩增产物的大小,用电泳缓冲液 1 TAE 制备相应浓度琼脂糖凝胶 55 60 时加入溴化乙锭至终浓度为 0.5g / mL 。加样后用 60V 低压电泳 4 h 6 h ,电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。B . 5 结果判定 若待测菌株的 PCR 反应扩增出目标片段,且 PCR 产物经过确证,片段的大小及数量与预期一致,则判定待测菌株为目标菌。反之,则判定待测菌株不是目标菌。表 B. 1 PCR 检测的靶序列、引物序列和反应 参数靶序列引物序列 PCR 反应参数名称预变性 扩增 循环数 延伸9 4 , 30 sP 1 : 5 - ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC -95 , 5mm 50 , 1 min 35 72 , 8 minERIC P2 : 5 - AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG72 , 60 s94 , 1 min,52 , 1 min, 30 65 . 16 minBOX BoxAIR : 5 - CTACGGCAAGGCGACGCTGACG 95 . Zmm65 , 8 min,94 1 minREP 1 R - 1 IIIICGICGICATCIGGC 4 0 1 min 35 65 . 8 minREP 95 . 6 minREP 2 - 1 I CGICTTATCIGGCCTAC 65 4 min8NY /T 2066?2011附 录 C(资料性附录)DNA 提取方法C . 1 硅藻土法C . 1.1 试剂 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水。C . 1.1.1 三 羟甲基氨基甲烷, TrisNH CCH O H 。2 2 3C . 1.1.2 乙二胺四乙酸二钠盐 C H N O Na 。10 14 2 8 2C . 1.1.3 异硫氰酸胍 CH N . HSCN 。5 3C . 1.1.4 反式环己二胺四乙酸 C H N O 。14 22 2 8C . 1.1.5 氢氧化钠 NaOH 。C . 1.1.6 硅藻土。C . 1.1.7 无水乙醇。C . 1.1.8 TE 缓冲液 pH 8.0 : Tris 0010 mol / L , EDTA 0. 001 mol / L ,用 HC1 或 NaOH 调 pH 至8.0 。C . 1.1.9 4 mol / L GUT C 缓冲液:分别称取 23. 26 g 异硫氰酸胍和 0.087 g 反式环己二胺四乙酸,溶解于 20 m L 浓度为 0.04 mol / L Tris - HCl pH8.0 缓冲液中,待试剂完全溶解后,用相同浓度的 Tris -HCl 溶液定容至 50 mL 。C . 1.1.10 洗涤缓冲液:称取 2.3 g NaCl ,溶解于 20 mL 浓度为 0.1 mol /