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细胞凋亡与胎盘免疫学杂志 1999年第2期第15卷 综述与讲座作者：李东至林其德单位：上海第二医科大学附属仁济医院妇产科 上海200001CELL DEATH AND PLACENTA细胞凋亡是细胞主动的死亡过程，是与细胞坏死截然不同的一种细胞死亡方式。自1972年Kerr提出这一概念以来，已认识到细胞凋亡是属于机体的生理机制,是多细胞生物更新正常细胞和清除异常细胞的重要手段，参与机体生殖、胚胎发育、免疫等生理过程以及肿瘤、病毒感染等疾病发生过程。目前已揭示出在细胞凋亡过程中，细胞内部发生一系列特殊基因的表达及生化和形态学改变。本文仅就人胎盘中的细胞凋亡作一综述。1细胞凋亡概述1.1细胞凋亡的形态学特点及其检测细胞凋亡存在着特征性变化，包括细胞缩小，微绒毛消失，胞浆浓缩，核质致密并分离、呈新月形边集，核膜皱折、起泡或出芽，进而细胞裂解，形成凋亡小体，最终被巨噬细胞或临近实质细胞吞噬而清除。整个细胞凋亡过程不伴炎症反应。形态学判定是凋亡检测的经典方法，是其它各种检测方法的基础。光镜和透射电镜观察、流式细胞技术也越来越多地用于细胞凋亡的检测，其优势在于对细胞群中凋亡细胞进行快速计数。但如果只想证实细胞群中存在凋亡细胞，可用凝胶电泳，在电泳带表现为特征性梯形带即可确定研究的细胞群体中出现凋亡细胞。最常用的细胞凋亡检测方法为TUNEL法（TdT-mediated dUTP nick end-labeling），可特异性地、原位地显示凋亡细胞，且在一般组织切片中进行，操作简单，使凋亡原位检测在基础与临床的研究中得到广泛的应用。1.2细胞凋亡的诱导基因与抑制基因近年来，对蛋白质、RNA合成的抑制剂如放线菌酮和放线菌素D的研究证实，大分子合成是凋亡细胞较为普遍的反应1；新的蛋白质合成被看作是凋亡的一个重要特征，提示：凋亡是内在基因编码的主动程序性死亡，这种由遗传因素决定的细胞凋亡基因称为死亡基因。生理条件下，细胞协调激活凋亡诱导基因和凋亡抑制基因共同控制着细胞凋亡过程，维持细胞内环境的动态平衡。细胞凋亡诱导基因目前研究较多的有c-myc、野生型p53、Apo-1Fas和ICE基因。癌基因c-myc对细胞增殖、分化以及死亡起着双向调节作用。Myc蛋白与致癌因素等刺激同时存在时，细胞表现为增殖效应；若细胞同时接受了某些抑癌基因的刺激信号，过度表达的Myc蛋白则激活某些基因转录，产生促凋亡因子，诱导细胞发生凋亡2，3。p53基因可分为野生型和突变型，二者对细胞凋亡的作用相反。野生型p53为一种抑癌基因，在人类大多数肿瘤中都存在不同程度的缺失或突变。其主要作用是维持遗传物质的完整性，阻止受损伤的DNA进入细胞周期而进行修复；如损伤不可逆转，则p53启动一系列酶解过程，引导细胞凋亡4。另一类与凋亡相关的基因为凋亡抑制基因，包括bcl-2家族、突变型p53、RB基因等。bcl-2家簇在体内通过形成多种同源或异源二聚体而发挥调控细胞死亡的作用。bcl-2原癌基因是目前最受关注的与凋亡相关的基因之一，其对细胞增殖速度无影响，也与蛋白质合成无关，其抗凋亡作用在于阻断凋亡细胞内部的信号传导5，6。值得强调的是，调节细胞凋亡的基因很多，不断还有新的基因发现，细胞凋亡往往不是单个基因作用的结果，而是在不同刺激信号影响下涉及多个基因表达及相互作用的复杂过程7。2胎盘组织中细胞凋亡研究2.1胎盘细胞凋亡的观察细胞凋亡的研究几乎遍及人体的各个组织，尤以在肿瘤研究中的地位最为突出，已成为判断肿瘤预后和指导治疗的重要依据。胎盘的细胞凋亡研究近来才受到重视。胎盘是母儿间的物质交换器官，它的完整性对维持妊娠有重要作用。Nelson等8注意到正常足月胎盘合体滋养层局部缺失是一个常见的组织学特性，缺失处有纤维素沉积，他推测是由合体滋养细胞凋亡造成的，附着的纤维素提供上皮再生的支架。取纤维素沉积处的胎盘组织在电镜下观察，发现合体滋养细胞具有凋亡细胞的超微结构改变9，10。用凝胶电泳法检测正常足月胎盘DNA，出现典型的梯形带11，表明细胞凋亡存在于胎盘组织为一生理现象。Smith等12在这方面作了详细的工作，他们用光镜、电镜及TUNEL法全面观察了正常早孕和晚期胎盘中的细胞凋亡，并对凋亡细胞进行鉴别。结果表明，胎盘中大部分凋亡细胞（50）为滋养细胞，内皮细胞较少（5），其余为间质细胞。光镜下早期胎盘凋亡细胞的比例占有核细胞总数的0.07，晚期为0.14，二者差异显著。TUNEL法计数的结果比光镜高，几乎是后者的两倍，可能此法比较敏感，能检出形态学上尚无法辨认的凋亡细胞。但是采用TUNEL法有一点值得注意，当绒毛发生水肿变性或凝固性坏死时，细胞核可呈阳性13。2.2胎盘凋亡基因的表达细胞凋亡受自身基因调控，胎盘细胞凋亡基因的研究较少，主要是bcl-2。胎盘中的bcl-2只表达于合体滋养层，表达量随孕期而逐渐下降14，15。这与孕晚期胎盘细胞凋亡比例增加可能有关。有人比较了人工流产、初次自然流产和习惯性流产组织合体滋养层bcl-2表达，发现人工流产组bcl-2蛋白染色较强，而两自然流产组无差异15。由于合体滋养细胞直接与母血接触，bcl-2高表达可抑制细胞凋亡，对维持妊娠有重要作用。用免疫组化法在孕晚期胎盘中未能检测到野生型或突变型p53蛋白，Northern印迹仅测出少量野生型mRNA16。新近发现17，孕早期和晚期胎盘表达一种与细胞凋亡相关基因FasL，即凋亡诱导基因Fas产物的配体，定位于合体及细胞滋养细胞。FasL在体内的表达部位有限，通常分布于免疫赦免器官（眼、睾丸等），其在胎盘的表达参与妊娠免疫耐受。2.3细胞因子与滋养细胞凋亡细胞生存环境中的许多信号能诱导细胞凋亡，其中细胞因子与凋亡密切相关。实验表明，将分离纯化的足月胎盘绒毛内细胞滋养细胞置于培养基中（含血清），不加任何生长因子，培养3d未能检测出自然发生的凋亡细胞，这种现象甚至能持续2周18。若加入TNF-，4d后MTT法即能测得滋养细胞活性丧失增多、DNA量减少。采用末端标记法可检出凋亡核型19。IFN-无此作用，但与TNF-合用表现为协同作用，最早能在培养24h检测到具有凋亡核型的滋养细胞19。TNF-有两种受体，TNF RP75和TNF RP55。足月胎盘滋养细胞20强表达TNF RP75，约50中等表达TNF RP55，而总的受体数目TNF RP75是TNF RP55的2.7倍。但TNF-诱导的合体滋养细胞和细胞滋养细胞凋亡是通过TNF RP55介导的，TNF RP75几无作用20。TNF-受体表达差异可以解释合体滋养细胞对TNF-刺激的敏感性低于未分化的细胞滋养细胞。另一个具有调节细胞凋亡的细胞因子为EGF21，它可在体外抑制TNF-IFN-诱导的滋养细胞凋亡。有趣的是，EGF的这种效应并不呈剂量依赖关系，抑制作用仅发生在相当于生理水平的极低浓度内，增加剂量抑制凋亡作用反而降低。EGF单用不能刺激滋养细胞增殖，其抗凋亡作用仅发生在TNF-IFN-处理滋养细胞的12h内，此阶段尚无法测到细胞凋亡的特征性变化，表明EGF的抑制作用可能是干扰早期信号传导21。胎盘能分泌多种细胞因子，包括TNF-、IFN-和EGF等，这些细胞因子在体内可能处于一种平衡状态，调节胎盘滋养细胞的发育。2.4胎盘细胞凋亡与病理妊娠细胞凋亡是一种生理状态，机体某一器官出现细胞凋亡停滞或过快均可导致疾病的发生。胎儿宫内发育迟缓（IUGR）是常见的妊娠合并症，但它不是单一的病症，许多病理妊娠均可影响胎儿正常生长，发生IUGR。研究证实22，23，IUGR胎盘有共同的病理特点：三级绒毛直径变小，绒毛萎缩，毛细血管变细、变直，环状分支减少。提示：IUGR可能是由于胎盘发育不良，损害了母胎间物质交换，胎儿因得不到足量的养分而生长减慢。Smith等24对比了43例正常妊娠胎盘和23例IUGR胎盘中的细胞凋亡情况，结果发现，正常胎盘中有核细胞凋亡比例平均为0.14，而IUGR胎盘为0.24，两者呈显著性差异。尽管确切作用不明，可以推测，胎盘细胞凋亡速度变快可能是IUGR的机制之一，使绒毛生长受阻，脉管发育不良。另外，有动物实验发现25，早产组小鼠胎盘可检测到滋养细胞凋亡，但正常足月组均未检测到细胞凋亡。同一实验中还发现，早产小鼠血清及羊水中TNF-浓度较对照组高，TNF-在体外可诱导小鼠滋养细胞凋亡。因此，早产小鼠体内细胞因子可能引发了滋养细胞凋亡，在母胎交界处发生慢性胎盘早剥。早产在人类妊娠非常普遍，但细胞凋亡的作用尚未见报道。胎盘凋亡的研究刚刚起步，有关胎盘中细胞凋亡的检测及其调控机制开始得到阐明。妊娠是母胎间相互作用的过程，母儿之所以具有相容性使妊娠持续至足月分娩，胎盘滋养细胞扮演着重要角色。胎盘发挥生物合成、免疫调节和物质转运作用，其功能依赖于结构的完整性。细胞凋亡和细胞增殖一样，共同调节胎盘的发育、成熟和老化，满足不同孕龄的需要。临床上许多病理妊娠均伴有胎盘发育障碍，有些就是胎盘发育不良的结果。研究胎盘细胞凋亡将有助于深入揭示这些疾病的发病机理，为治疗提供新的思路。这方面的研究正在进行。作者简介第一作者：男，27岁，博士，住院医师参考文献1Ellis RE，Yuan JY，Horvitz HRMechanisms and functions of cell deathAnnu Rev Cell Biol， 1991，7：6632Packham G，Porter CW，Clevland JLC-myc induces apoptosis and cycle progression by separable， yet overlaping，patwaysOncogene，1996，13：4613Galaktionov K，Chen XC，Beach DCdc25 cell-cycle phosphatase as a target of c-mycNature， 1996，382：5114Sidransky DClinical implication of the p53 geneAnnu Rev Med，1996，47：2855Cosulich SC，Green S，Clarke PRBcl-2 regulates activation of apoptotic proteases in a cell-free systemCurr Biol，1996，6：9976Shimizu S，Eguchi Y，Kamiike W，et alBc1-2 blocks loss of mitochondrial membrane potential while ICE inhibitors act at a different step during inhibition of death induced by respiratory chain inhibitors Oncogene，1996，13：217Rowan S，Fisher DEMechanisms of apoptotic cell deathLeukemia，1997，11：4578Nelson DM，Crouch EC，Curran EM，et alTrophoblast interaction with fibrin matrix Epithelialization of peri-villous fibrin deposits as a mechanism for villous repair in the human placentaAm J Pathol，1990，136：8559Nelson DM，Swanson PSBreaks in the syncytial trophoblast layer of human placenta villi are due to apoptosisJ Soc Gynecol Invest，1996，3：30510Nelson DMApoptosis changes occur in syncytiotrophoblast of human placenta villi where fibrin type fibrinoin is desposited at discontinuities in the villous trophoblastPlacenta，1996，17：38711Thiet MP，Suwanvanichkij V，Kwok C，et alDNA laddering，consistent with programmed cell death，is a normal finding in human placentasAm J Obstet Gynecol，1995，172：27212Smith SC，Baker PN，Symonds EMPlacental apoptosis in normal human pregnancyAm J Obectet Gynecol，1997，177：5713Yasuda M，Umemura S，Osamura RY，et alApoptotic cell in the human endometrium and placental villi：pitfalls in applying the TUNEL methodArch Histol Cytol，1995，58：18514Kim CJ，Choe YJ，Yoon BH，et alPatterns of bcl-2 expression in the placenta，Pathol Res Pract，1995，191：123915Lea RG，Al-Sharekh IV，Tulppala M，et alThe immunolocalization of bcl-2 at the maternal-fetal interface in healthy and failing pregnanciesHuman Reprod，1997，12：15316Cheung ANY，Srivastava G，Chung ZP，et alExpression of the p53 gene in trophoblastic cells in hydatidiform moles and normal human placentasObster Gynecol，1994，39：22317Bamberger AM，Schulte HM，Thuneke I，et alExpression of the apoptosis-inducing Fas ligand （FasL） in human first and third trimester placenta and choriocarcinoma cells J Clin Endocrinol Metab， 1997，82：317318Yui J，Garcia-Lioret MI，Brown A，et alFunctional long term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cellsPlacenta，1994，15：23119Yui J，Garcia-Lioret MI，Wegmann TG，et alCytotoxicity of tumour necrosis factor-alpha and gramma-interferon against primary human placental trophoblastsPlacenta，1994，15：81920Yui J，Hemmings D，Garcia-Lioret MI，et alExpression of the human p55 and p75 tumor necrosis factor receptor in primary villous trophoblasts and their role in cytotoxic signal transductionBiol Reprod， 1996， 55：40021Garcia-Lioret MI，Yui J，Winkler-Lowen B，et alEpidermal growth factor inhibits cytokine-induced apoptosis of primary human trophoblastJ Cell