细胞融合和单抗的杂交瘤技术.doc

第14章 细胞融合和单抗的杂交瘤技术第一节 细 胞 融 合细胞融合，即两个或两个以上细胞合并成一个细胞的过程。在自然情况下，受精过程即属这种现象。近年来可用人工法将两个离体细胞在特殊诱导物的作用下使细胞膜发生一定变化，使两个或多个细胞发生融合，形成体细胞杂交(Somatic Hybridization)，产生一个新的杂种细胞(Hybrid),常用的诱导物有仙台病毒、聚乙二醇(PEG)，现常用PEG取代仙台病毒，它可使细胞膜中磷脂酰键及极性基团二者在结构上发生重排，或膜内脂肪的羟键活动诱发或增加了膜内颗粒集聚，使两个或多个细胞发生细胞融合，形成巨大细胞，然后通过有丝分裂细胞核合二为一，形成新的杂种细胞。一、常用的细胞融合剂常用的细胞融合剂如表14-9。表14-9 细 胞 融 合 剂病毒类DNA病毒：水痘和疱疹病毒，天花（兔天花）病毒RNA病毒：仙台(HVj)病毒,NDV，腮腺炎病毒,SV5,麻疹及呼吸道合胞病毒RNA致癌病毒：Rous肉瘤病毒，Visna病毒冠状病毒：禽类感染性气管炎病毒化合物水溶性：聚乙二醇（PEG）、二甲亚砜（DMSO）、ConA脂溶性：溶血卵磷脂、磷脂酰丝氨酸生物制剂昆虫Paederus,fuscipes提取物细胞融合技术可在种内、种间细胞中进行，也可还打破植物和动物界的疆域。如植物细胞的原生质体与人的HeLa细胞均已杂交成功。细胞杂交的成功不仅有助于绘制人类细胞基因图，使遗传缺陷的基因获得互补，为今后的某些遗传缺陷病的基因治疗打开通路而且对正常细胞的恶性病变机理和控制开创了美好的前景。特别是单克隆抗体技术的成功，不仅可持续不断获得大量廉价的纯抗体，并为治疗肿瘤提供了理想的生物导弹，其应用价值。目前在制备单克隆抗体杂交瘤细胞中常用PEG，也有人认为PEG和DMSO并用可提高细胞融合指数。二、细胞融合方式(一)完整细胞之间的融合将制备好的两种亲本细胞，在诱导剂作用下融合成的杂种细胞具有双亲的特性，保留了亲本完整的染色体，亦可能丢失亲本之一染色体。其基因型表达形式呈有多样性，可能会出现多种功能，是生物变异的有效手段。单抗杂交瘤细胞属此种方式。(二)核体、胞质体与完整细胞的融合作用细胞核连同其外表面薄层细胞质构成的颗粒，称核体而不具有细胞核的细胞，称胞质体。细胞经细胞松弛素B处理可同时获得这两种材料（第二篇第二章脱核技术中已介绍）。按完整细胞间的融合方式，将核体与完整细胞或与另一种细胞的胞质体融合，构成杂种细胞，后者又称为重组细胞。此外也可将胞质体与另一完整细胞融合，将胞质体中线粒体mRNA等转移至完整细胞中，改变后者的遗传性。(三)微小细胞与完整细胞的融合一个或几个染色体包裹一层细胞质的小体称为微小细胞。其制备方法为取对数生长期的细胞用秋水仙素处理一定时间（与制备染色体类同），以终止细胞分裂，此时细胞核分裂成若干个微核，每个微核由1个至数个染色体组成，然后用细胞松弛素B（10g/L）处理细胞，通过离心，使微核脱离细胞而形成微小细胞。将微小细胞与另一完整细胞融合，使后者获得另一种细胞的染色体，所获融合子称微小细胞杂种细胞，本技术除可获得具有工业意义的杂种细胞外，对研究细胞染色体生物学功能也具有重要意义。(四)脂质体介导的细胞融合动物细胞匀浆破碎后可提取线粒体及溶酶体等细胞器，或采用生化技术分离出DNA或mRNA的RT-PCR产物，将其包装成脂质体，然后将脂质体与另一完整细胞融合，即可获得相应杂种细胞。通过转移细胞器所获得的杂种细胞可获得抗药性及抗毒性等遗传性特征。第二节 单克隆抗体的杂交瘤技术单克隆抗体（monoclonal antibody . McAb）技术在免疫学范畴内已经属于常规技术，在其他生命学科，如细胞生物学、遗传学、微生物学、生物化学、肿瘤学等领域内的应用也愈来愈广泛，目前这种应用已不局限在科学研究的范围内，单克隆抗体所引起的诊断学领域内的革命，在临床治疗学上的意义和其他经济领域内所产生的作用，也将愈来愈显著。McAb技术的发明者G.Kohler和C.Milstein，1975年8月第一次报道了这项新技术，随后又不断加以推广，逐步改进和完善，他们因此而获得了1984年度诺贝尔医学奖。一、 McAb技术基本原理 经过免疫的哺乳类动物单一的B淋巴细胞，可以合成分泌单一性的抗体，我们称这种具有特异性的、同质性的抗体为单克隆抗体。如果一个单一的B淋巴细胞既能分泌所需要的特异性抗体，又能体外进行不断增殖，就可进行规模化的McAb生产。然而现阶段这种可能性还不具备，所以人们必须考虑怎样去通过改变B淋巴细胞的遗传特性而建立一个能永久生长，并能分泌McAb的细胞系。这一目标可以通过两条途径达到： 1、病毒转化通过对脾脏B淋巴细胞进行某一特异性免疫，继而进行理化因素诱变或通过病毒转化，以致形成永久生长的细胞系。这种方法在制备人源McAb比较有用，如人的B淋巴细胞系可以通过EB病毒进行转化。 2、细胞杂交 通过对免疫动物B细胞和某一个永久细胞系进行融合，杂交后代称之为杂交瘤（Hgbridoma）。杂交瘤细胞可以将分泌特异性抗体B细胞的遗传特性和骨髓瘤细胞系体外增殖的遗传特性合二为一，这就是McAb技术的基础。早期细胞融合常用灭活的仙台病毒和PEG（Polyethylenglocol）。动物细胞也可以通过脉冲电场进行融合。这需要一种专用的仪器，这种方法对制备人源性的单抗有特殊的意义。二、 McAb技术的特点1、 高度特异性。McAb只识别并结合特定的抗原决定簇（Epitop），因此它对抗原的反应具有高度的选择性和专业性，即特异性。2、 高度稳定性。杂交瘤生长和分泌单一抗体的特性能得到永久地保持，与它的遗传稳定性是分不开的，当然变异也是存在的，突变率通常与参加融合的骨髓瘤细胞系的种类有关，为克服变异的产生，常可通过亚克隆筛选法加以控制。3、 高抗体活性。与多克隆抗体相比，McAb可以工业化大量生产，利用诱生腹水产生的McAb，显著高于任何一种多克隆抗血清的抗体效价，至少高出4倍。 4、不可知性，McAb的很多生物活性是不可预知的，对一个已知的抗原可能会产生许多不同的McAb，如抗不同的Epitop，就具有不同的亲和性，具有不同的抗体类型和亚型、不同的补体结合特性和亲细胞性等。5、过于单一性，多克隆抗血清象一个调好的鸡尾酒，各种类型的有效抗体混合在一起。由于这众多的抗体的产生，对同一抗体来说就会导致抗体结合的多样性。比较起来，McAb相对于多抗就显得太专一了。在某些应用当中，常需要多种McAb配合使用才能达到目的。但专一性的优点是特异识别能力强，对抗原鉴别和特异标记物的临床诊断有重要的应用价值。三、 McAb技术的应用 McAb技术的实践意义在于首先体现在临床诊断学领域内的应用，它替代和补偿了那些由于特异性不够而不能满足需要的抗血清。因为很多疾病的被检物往往是某一个非常特异的抗原决定簇，所以只有高特异性的McAb才能很好地满足这种要求。如抗肿瘤标记物、抗激素和抗细胞表面分化抗原等。McAb试剂盒可以将一些肿瘤及白血病细胞的分型划分得更细更明确，有利于鉴别细胞分化类型，成熟程度。用同位素标记的抗肿瘤标记物McAb技术可用来进行放射追踪、定位。病毒和细菌性疾病免疫学诊断也可以通McAb技术进行方法学上的改进。McAb技术最有前途的应用是肿瘤靶向生物治疗的作用，所谓的“生物导弹”治疗肿瘤可以通过两个途径发挥作用，一是McAb自身可以起到对肿瘤细胞毒作用，如美国Genetech公司最新推出的抗癌新药“Herceptin”，实质上就是一个基因重组的人源化抗乳腺肿瘤标记物的McAb。二是利用McAb与肿瘤标记物的特异性结合的特性，对肿瘤细胞发挥作用的是偶联在McAb上的细胞毒素或同位素。McAb用于治疗肿瘤还有待进一步研究。如一些肿瘤缺少很特异的标记物，一些原发瘤标志物会发生改变以及如何解决McAb人源化的问题等。这将取决于基因工程抗体的研究进展和应用效果。McAb技术一个应用价值是对一些生物大分子的分离纯化，特别是一些常规方法难以纯化的生物制品，如基因工程人干扰素，利用McAb亲和层析可以取得非常好的效果。 杂交瘤技术包括免疫动物、细胞融合、筛选杂交瘤细胞、克隆化培养、单克隆抗体的制备与鉴定等步骤，其关键技术是细胞融合技术。该项技术就是在聚乙二醇(PEG)的促融合作用下，将预先用抗原免疫的BALB/c小鼠的脾细胞(主要为能分泌预定抗体的B淋巴细胞)与具有无限繁殖能力的鼠骨髓瘤细胞融合成为杂交瘤细胞，这种杂交瘤细胞获得了双亲本细胞的特性，既有分泌预定抗体的能力，又可获得永生化，呈现无限繁殖能力。然而在细胞融合中，还可能存在B细胞与B细胞、骨髓瘤细胞相互融合的融合细胞及未融合的两个亲本细胞。在这些细胞中，自身融合的和未融合的脾脏B细胞在体外培养10天左右会自然死亡，而未融合或自身融合的骨髓瘤细胞以及与B细胞融合的杂交瘤细胞均可继续生长繁殖，但前者生长速度快，往往会抑制杂交瘤细胞生长，故必须在HAT选择培养基中进行选择培养。在HAT培养系中，主要是添加了氨基喋呤用以阻断未融合的及自身融合的HGRPTase缺陷的骨髓瘤细胞，使之无法利用补充的次黄嘌呤和胸腺嘌呤核苷经旁路合成DNA，而导致死亡，唯有骨髓瘤与脾细胞中的B细胞融合的杂交瘤细胞不会受到影响。尽管氨基喋呤阻断了嘌呤和嘧定的内源性生物合成，但杂交瘤细胞仍可从B细胞中获得HGRPTase的遗传特性，经旁路利用HAT中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA，使杂交瘤细胞得以繁殖生存。二、杂交瘤细胞制备的操作程序（如图14-1） 1、骨髓瘤(浆细胞瘤)突变缺陷细胞株的培养和选择(1) 常用细胞株为SP2/0和NS-1,其特性如表2-10。表2-10 常用骨髓瘤细胞株的特点名 称全 名特 点来 源SP2/0SP2/0-Ag14不产生IgBALB/C小鼠浆母细胞瘤NS-1P3-NS-1-Ag4/1产生K轻链非分泌型BALB/C小鼠浆母细胞瘤FOFast-Zero不产生IgBALB/C小鼠浆母细胞瘤Y3Y3-Ag1.2.3产生KLou大鼠骨髓瘤SKO-007产生人浆细胞瘤TM-HZ产生K人浆细胞瘤(2)骨髓瘤细胞的培养 骨髓瘤细胞可用10%小牛血清的RPMI1640培养基以悬浮或半贴壁形式生长繁殖，对于半贴壁细胞无需用胰蛋白酶消化，直接用吸管吹打即可使细胞分散，传代培养要保持细胞的对数生长期，每35天传代一次。用于融合试验前必须做对HAT选择培养基敏感性试验，由于HGRPTase缺损，DNA合成障碍细胞，应发生死亡，否则有变异，不能用于试验。以SP2/0细胞为例，应在筛选建株时应用的8-氮鸟嘌呤致死剂的培养液中(2030mg/L)培养一代后，换成常规培养基培养。2、免疫脾细胞的制备 (1)免疫动物下面以鼠源McAb为例系统介绍McAb技术的原理和方法。 动物免疫的原理和策略 特异性抗体的类型以及与抗原结合的形式都受到免疫形势的影响，这就要求在免疫时要十分注意方法和技术。首先是尽量提高免疫应答反应。通常免疫应答反应在不同的免疫动物之间有很大差异，甚至同一种动物不同的个体也有不少区别。可通过一些措施提高动物的免疫应答反应，除了选择好的动物种类，如BALB/C小鼠；适当免疫佐剂和合理的免疫程序以外，最重要的是要有一个好的免疫原。抗原是制备McAb的第一要素，它的纯度和免疫原性是决定免疫反应的关键。根据抗原的大小和溶解特性可分为颗粒性抗原和可溶性抗原两类。通常抗原越大，结构越复杂，在免疫动物体内存留并作用的时间越长，它的免疫效果越佳。 以制备鼠源McAb为目的小鼠免疫，没有一个固定的程序，它和制造抗血清有一定的差别。小鼠免疫的目的不是要求血清中含有很高的抗体效价，也不需要免疫细胞产生很强的防御活性。它的目的是产生足够多的B淋巴细胞以满足细胞融合的需要。其中能识别目的抗原的B淋巴细胞越多，筛到阳性杂交瘤的机会就越大。 动物免疫程序近年来人们摸索出了很多新的免疫方案，根据抗血清中的抗体效价的变化，Rathjen（1986）把小鼠免疫的进程划分为5个阶段：1）前期反应；2）初级上升阶段；3）初级回落阶段；4）次级上升阶段；5）次级回落阶段。试验证明，能很快就进入次级免疫反应阶段的小鼠经过细胞融合后多数能获得满意的克隆，为了更好地掌握免疫的时机，必须在第2阶段，尤其是第4阶段后连着3天进行静脉加强免疫，第4天进行融合，可使抗体效价达到最佳状态。通常一个好的免疫程序一般需要34个月时间，在适当的时间进行抗原注射，可使对抗原有特异性的B细胞不断增殖。被刺激过的特异性的B细胞可在适当的时候由脾脏中大量分离获得，这个时机应为B细胞分泌抗体最旺盛的阶段，这一阶段分离到的B细胞和骨髓瘤细胞融合后，会使杂交瘤的克隆总数和阳性克隆数大大增加。 动物免疫方法 腹腔免疫注射根据经验对大多数抗原来说能够满足要求且方法简单，爪垫注射如果和佐剂（CFA/IFA）共同使用，往往会引起发炎和肿胀；静脉注射，不仅技术上难以掌握，操作困难，而且对有些小分子可溶性抗原小鼠会产生免疫耐受性甚至还有致命的危险。因此，除非特殊需要，通常静脉注射只用来加强免疫，对脾脏直接进行抗原注射可以大大减少抗原的用量，Spitz（1984）用少于20g的蛋白质抗原和2.5105细胞抗原直接对脾脏免疫，发现效果比上述几种方法都好。目前通常采用动物免疫法。 (2)制备免疫脾细胞悬液：通常在末次免疫后第34天以拉颈或断头处死小鼠，用75%酒精浸泡消毒小鼠毛皮。然后打开腹腔无菌取脾，去除脂肪和结缔组织，用无血清的培养液冲洗，置100目不锈钢网筛上研磨脾脏，用洗液洗23次，经1000r/min离心5分钟，弃上清加入完全培养基，用吸管吹打分散，收集上层悬液，除去沉下的大块。活细胞计数，一般一只小鼠可获12.5108脾细胞。3、饲养细胞的制备为防止细胞融合时因损伤而难以生长，促进杂交瘤细胞生长，增加克隆数，常需制备饲养层细胞。可用肉汤刺激小鼠腹腔并收获腹腔中的巨噬细胞供饲养层用，该细胞有助于清洁培养表面和吞噬死亡细胞。用吸管在打开的腹腔中吸取细胞悬液，并用培养液冲洗收获，离心洗一次，再用培养基（含HAT）调整细胞至2105/ml，包板培养，96孔板0.1ml/孔即可，每只鼠可获巨噬细胞25106个细胞。4、HAT培养基的制备（1）HT贮备液制备100 次黄嘌呤（Hypoxanthine;H）/ 胸腺嘧啶核苷（Thymidine;T)，简称HT 称取136.1mg H；38.8mg T； 依次溶解在100ml双蒸水中；次黄嘌呤难溶，可加温5080促溶； 用0.22m微孔滤膜过滤除菌，每瓶分装2-5ml，-20冻存，临用前用培养基稀释100倍。（2）A贮备液制备100 A为氨基喋呤（Amiropterin;A） 称取17.6mg A加至90ml双蒸水中； 滴加1N NaOH溶液并不断摇动，直至完全溶解，再滴加等量1N HCl溶液，恢复pH至7.0左右； 补足双蒸水至100ml； 0.22m微孔滤膜过滤除菌,分装,-20冻存.(3)HAT培养基制备临用前,于每100ml RPMI1640培养基中(含10%小牛血清或牛血清)加1ml HT贮备液和1 mlA贮备液。（二)细胞融合试验聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合法：PEG结构为HOH2C(CH2OCH2)nCH2OH，分子量从小于200至大于6000，均可作细胞融合剂。通常用分子量1000或4000的PEG作融合剂，50%溶液产生最多杂种细胞，若用分子量较小的PEG时，以55%浓度为好。PEG在pH6.0时细胞融合率最高，融合时细胞密度不要太大，常采用微孔膜过滤除菌，因高压灭菌会产生有毒醛类化学物。具体步骤如下：(1) 将两种不同亲本细胞以10:1或5:1混匀，即作单克隆抗体杂交瘤细胞融合试验时，取107个免疫脾细胞加入108个SP2/0(或NS1)鼠骨髓瘤细胞，混匀后低速（200g）离心去上清，叩松沉淀细胞。(2)在37水浴中边摇边滴加0.7ml预热的50%PEG(MW1000或4000)，于一分钟内滴完。(3)于2分钟内加入15ml预热的无血清1640培基，以终止融合，1000r/min离心去上清，沉淀细胞悬浮于24ml HAT培基中。(4)将细胞分种于含饲养细胞的24孔板中，0.5ml/孔,置37含5%CO2的培育箱中培养，每34天半量换HAT培养,15天后改用HT培基，3周后改用完全RPMI16403培基。(5)培养35天即可有小克隆出现，杂交细胞较大，呈园形，且透明，其它细胞透光性差并逐渐死亡。(6)培养8-12天，克隆可长至底面积的1/31/2，此时可取培养上清液，进行抗体检测。(7)一旦检测到分泌预定抗体的克隆，应及时将阳性克隆转入培养瓶扩大培养，冻存部分克隆细胞，并尽快进行克隆化培养。(三)单克隆抗体检测克隆一旦形成，应及时选择灵敏、特异、快速、稳定、可靠的免疫学方法，如免疫荧光试验，以免非特异阳性克隆掩盖特异的阳性克隆。免疫印迹（Western blooting）ELISA酶试验，放射免疫试验，筛选分泌预定抗体的杂交瘤细胞克隆。根据不同的抗原类型选用不同的检测方法。若为可溶性抗原，先选用已知抗原包板，并用小牛血清或牛血清白蛋白封闭后，采用ELISA法测定，也可用放射免疫法测定（RIA）。若为细胞膜表面抗原可采用膜萤光免疫测定法、细胞毒试验、细胞酶免疫测定法。若为细胞膜表面可溶性抗原，可用免疫印迹（Western blotting）法测定。值得注意的是所有对抗原有特异性的杂交瘤都不能漏检，最常用的初筛检测方法有以几种类型：抗原一抗体结合试验：这是一种以抗原与单抗呈特异性结合为原理的测试方法，用同位素（又称核素）、酶、萤光素标记的第二抗体（抗小鼠Ig）或葡萄球菌A蛋白（SPA）进行检定，如果为可溶性抗原，先将抗原包被在96孔板上，使之固定化，若抗原是半抗原等小分子物质，则可将其与蛋白结合后，再包被塑料板。 筛鼠类McAb可用以下三种ELISA或RIA法检测：1）包被Ab1+鼠McAb+Ag*（Ab1为抗小鼠Ig，Ag*为标记抗原）2）包被Ag+鼠McAb+Ab1*（Ab1*为标记抗小鼠Ig）3）包被Ab1+鼠McAb+Ag+Ab2*（Ab1为抗小鼠Ig，Ab2*为标记抗Ag抗体）被动血凝试验：将特异性抗原通过化学偶联法结合在红细胞表面作为指示细胞，当与相应特异抗体结合，即可导致红细胞凝聚，它具有简便、快速和灵敏的优点。在此法的基础上，经进一步改进，即在适当稀释的杂交瘤阳性克隆上清中加上过量抗原，再用上述致敏的红细胞（指示细胞）进行检测，则为血凝抑制。改进后的血凝抑制试验是一种检测抗体特异性的简单有效的方法。细胞毒试验：该法是测定细胞表面抗原与鼠McAb特异免疫反应的敏感方法，当鼠McAb与靶细胞表面抗原结合形成膜Ag-Ab复合物后，加入适量补体，在补体介导下，使细胞破坏（打孔），以致细胞破裂死亡。可采用染料着色法在显微镜下计数着染的死细胞。也可用51cr释放试验测量细胞51cr量，也可用MTT法，测定细胞琥珀酸脱氢酶活性，在酶标仪上采用测定OD值方式，计算细胞死亡结果，采用这些方法所测定的结果均比较客观、准确。细胞性抗原ELISA测定法 1)制备细胞抗原板：先将贴壁生长的细胞消化制成细胞悬液，接种96孔板，200ul/孔(细胞为105/孔)于375%CO2培养2448小时，弃培养液，用PBS（pH7.2）洗3次，然后用含1%牛血清白蛋白封板，用塑料袋密封4保存，2周内可用。2)检测抗体时，取出检测板。3)每孔加0.1ml0.3%H2O2-PBS 37放置30分钟，以阻断内源性过氧化物酶。4)PBS洗3次，每次3分钟。5)每孔加入有克隆形成杂交瘤细胞培养上清液50ul，37孵育1-5小时,或4过夜。6)PBS洗2次，洗涤液（PBS中含0.1%小牛血清、0.01%明胶、0.1%牛血清白蛋白、0.05%Tween20和0.01%NaN3）洗2次，每次3分钟。7)每孔加辣根过氧化物酶标记的兔(或羊)抗小鼠IgG 50ul，用稀释液（即PBS中含2%正常兔血清和10%甘油）稀释酶标抗体，37孵育30分钟。8)PBS洗5次，每次3分钟。9)每孔加新鲜配制的0.1ml底物溶液(邻苯二胺20mg溶于50ml pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，用前加30%H2O2)25暗处反应30分钟。10)每孔加50ml 2mol/L H2SO4，终止反应。11)判定结果：阴性对照孔应无色，阳性对照孔呈橙黄色，试验孔的颜色与阳性对照孔颜色基本一样，可判定为阳性。此外，也可在酶标仪的490nm波长下测定吸收值。若试验孔的光吸收值大于或等于阳性对照孔的光吸收值，可判定为阳性。(四)克隆化培养克隆培养对于获得分泌单一抗体杂交瘤细胞株至关重要，多数情况下在初选的阳性克隆中不是来自单个细胞，可能混有不分泌目的抗体的克隆，它比分泌抗体的克隆长得快，因此尽早进行抗体检测和克隆化培养，避免发生竞争性生长抑制，有时会发生变异不再产生抗体，这就需要再进行34次克隆化培养，以保证分泌性克隆生长的稳定性，其目的是利用单个细胞克隆化培养技术从细胞群体中选育出遗传稳定而同源的能分泌特异性抗体的细胞，淘汰非特异性的或遗传不稳定的杂交瘤细胞。克隆化培养有软琼脂培养法和有限稀释法。此外还有单细胞显微操作法、流式细胞仪分离法，其中有限稀释法最常用。方法如下：(1)制备饲养层：取正常小鼠腹腔巨噬细胞制成细胞悬液，接种96孔板，100ul/孔，含2104细胞。(2)用吸管吹打杂交瘤细胞培养板内的克隆、悬浮于完全培养液中。(3)取样、计数：调整浓度至100、50、10/ml。(4)分别将三种密度的杂交瘤细胞悬液接种于含饲养细胞的培养板中，每孔加100ul，使每孔分别为10、5、1个细胞。(5)在375%CO2下静置培养，1周后可半量换液，培养1014天，取培养上清进行抗体检测。(6)对阳性克隆再施用克隆化培养，直到100%的克隆分泌特异性抗体为止。同时将阳性克隆进一步扩大培养，冻存。克隆化培养的具体操作方法和步骤如下：（1）有限稀释法 1）将细胞悬液于HT-1640培养液（含1015%小牛血清）中计数细胞浓度，然后用该培养液稀释至每毫升分别含5、10和50个细胞的细胞悬液。例如：假设该细胞混合悬液的细胞浓度为3.5105/ml，可按如下步骤稀释：取该细胞悬液0.1ml+培养液（HT）3.4ml-104cells/ml(A液)取A液0.1ml+培养液（HT）9.9ml-102cells/ml(B液)取B液1ml+培养液（HT）1ml-50 cells/ml(C液)取B液1ml+培养液（HT）9ml-10 cells/ml(D液)取D液2ml+培养液（HT）2ml-5 cells/ml(E液)2)将上述稀释的细胞悬液C、D、E分别加入含有饲养细胞的96孔培养板的小孔中，100l/孔，使每孔分别含有0.5、1和5个细胞，这种细胞的分布率，常常根据细胞的特性和试验条件而有所不同，对于生长良好的细胞，其分布密度（分布率）可以适当低一些，对于刚融合后的第一次阳性克隆筛选时，孔中的细胞密度要求高一些。3）培养板在5%CO237oC下培养至第34天，在显微镜下，可观察到单细胞增殖情况，（培养当天或第二天板的U型底中开始为单细胞分布，第34天细胞数明显增多）。4）特异性抗体检测，在克隆后的一周至第10天，显微镜下可观察到U型孔底约有1/21/3被细胞布满，当孔中细胞数达150500个细胞时，即可吸出上清液，用各种方法尽快检测相应的特异抗体，可选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的细胞孔，一部分细胞用于扩大培养冻存，一部分细胞可继续按同样的方法再克隆。为确定所得的杂交瘤细胞为单个细胞克隆，可用下述Poisson公式加以验证： f（0）=e-f（0）为无细胞生长孔，为预定的每孔克隆数，e为自然对数的底，e=2.71828设=1,则f（0）=0.3678由此可知，要得到每孔只有一个克隆的概率，则有37%以上的孔应无细胞生长，如果连续两次克隆化都符合Poisson分布的单个克隆的生长孔数，而且全部克隆生长孔的上清均检测出阳性抗体，就可以认定已得到能分泌均一抗体的单克隆杂交瘤细胞系。（2）单个细胞显微镜操作法 基本原则是借助倒置显微镜的观察，用特制的弯头毛细管将单个细胞逐个吸出。 1）将待克隆化的细胞悬液按500010000个细胞/皿，分别加至平皿中，在CO2培养箱中静置1小时。2）在无菌条件下，将平皿移至倒置显微镜下，去盖，将弯头毛细吸管置于水平位置，直至显微镜下见到管口，将管口对准单个细胞，借助毛细吸管另一端橡皮乳头的吸引力，可将单个细胞吸入管内。3）轻轻将毛细管抽出液面，将管内细胞移至预先加有饲养细胞的96孔培养板的小孔中。4）将毛细吸管放在装有细胞培养液的小瓶中，冲洗数次后，再继续吸取其他单个细胞至另外的培养小孔中，直至培养板的96孔中均加有单个细胞，立即将培养板置入CO2培养箱中培养，隔日观察孔中单个细胞生长情况。 （3）流式细胞仪分离法现代化的流式细胞仪，不仅可测出流动细胞生理、生化以及其他一些生物学特性，而且还可让细胞以单细胞流的形式通过一束经过聚焦的萤光，每个细胞都可在萤光的控制下显示一个信号，这个信号可以被检测、被放大、被分析，以至被记录下来，然后再借助于另一个设备，根据某一特定的参数，使细胞分离如同邮局拣信件那样被分离开来。分离细胞时将细胞流通过不断振动，使细胞流变成细小的液滴，并使每个小液滴只含有一个细胞。细胞液滴下落