首都儿科研究所附属儿童医院门诊感染性腹泻患儿的细菌病原学分析.doc

首都儿科研究所附属儿童医院门诊感染性腹泻患儿的细菌病原学分析 主堡堕堕堕堂盘查!Q!生!旦笙丝鲞翌!塑垦堕!生生塑型!塑!Q!丝!坠!首都儿科研究所附属儿童医院门诊感染性腹泻患儿的细菌病原学分析周林1李静1徐文健1黄辉2邓莉2钟雪梅3马丽娟11首都儿科研究所附属儿童医院检验中心，北京100020；2首都儿科研究所附属儿童医院感染科，北京100020；3首都儿科研究所附属儿童医院消化科，北京100020通信作者马丽娟，Emaillijuanmarysina【摘要】目的分析首都儿科研究所附属儿童医院门诊感染性腹泻患儿的细菌病原学及其耐药性情况。 方法随机选取xx年8月至2018年7月我院门诊诊断为急性感染性腹泻的患儿进行粪便细菌培养，沙门菌血清学分型，PCR方法对5种致泻性大肠埃希菌分型，KirbyBauer纸片扩散法检测药物敏感性，统计学分析采用x2检验或Fisher确切概率法。 结果356份粪便标本检出致病细菌6种共103株(4份标本同时检出2种细菌)，阳性率278(99356)。 沙门菌检出率最高，为107(38356)，其次为金黄色葡萄球菌、致泻性大肠埃希菌与铜绿假单胞菌，检出率分别为84(30356)、56(20356)、37(13356)，未检出志贺菌。 38株沙门菌血清型以肠炎沙门菌与鼠伤寒沙门菌为主，占632(2438)；20株致泻性大肠埃希菌为肠致病型大肠埃希菌与肠聚集型大肠埃希菌，各10株，未检出肠出血型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌与肠毒素型大肠埃希菌。 沙门菌对氨苄西林、头孢曲松的耐药率分别为526(2038)、132(538)；致泻性大肠埃希菌对氨苄西林、头孢曲松的耐药率分别为11 20、120，3株致泻性大肠埃希菌产超广谱B内酰胺酶。 结论我院门诊感染性腹泻患儿的细菌病原菌以沙门菌为主，金黄色葡萄球菌、致泻性大肠埃希菌、铜绿假单胞菌感染机率增加，志贺菌已不是主要致病菌。 沙门菌与致泻性大肠埃希菌对氨苄西林耐药率较高，对头孢曲松普遍敏感，在无法获得病原诊断的情况下可考虑首选三代头孢类药物治疗儿童细菌性腹泻。 【关键词】腹泻；沙门菌属；大肠埃希菌；耐药性，细菌；儿童DOI103760cmajissn10099158201905008Analysis ofbacterial etiologyof the outpatients with infectious diarrhea in the Children7S HospitalCapital Institute of PediatricsZhou Linl，Li ringl，Xu Wenjianl，Huang Hut2，Deng Li2，Zhong Xuemei3，Ma LijuanltDepartment of ClinicalLaboratory,ChildrenS HospitalCapital Institute of Pediatrics，Be姆tng100020,China；2Department ofInfectious Disease，ChildrenS HospitalCapital Instituteof Pediatrics，Beijing100020,China；3DepartmentofGastroenterology，Children7SHospital CapitalInstituteofPediatrics，BeOing100020,ChinaCorresponding authorMaLijuan，Emaillijuanmarysinacorn【Abstract】objectiveTo analyzethebacterial etiologyand drugresistance ofpathogens fromthe outpatients with acute infectiousdiarrhea in theChildrenS HospitalCapitalInstituteofPediatricsMethods Thechildren withacute infectiousdiarrhea in theoutpatientdepartment ofour hospitalwererandomly enrolledintheperiod ofAugustxxto July2018Enteric pathogenicbacteria werecuhured andisolated from thefresh stool specimensThe serumof Salmonella spp wereidentified whilefive typesofdiarrheagenic Eschertchiacolt were detected byPCR methodAntibiotic susceptibilityof Salmonella spp anddiarrheagenic Escherichia coltwere testedby KirbyBauer diskdiffusion methodChisquare orFisher exacttestwas donefor statisticalanalysisResults0f the356stoolspecimens103strains of6pathogenicbacterial speciesweredetectedThe positiverate was278(99356)，and2strains weredetected infourstool samplesThe isolation rate of Salmonella spp，which was the highestinthis study，was107(38356)The isolationrate of Staphylocous aureus，diarrheagenic Escherichiacolt andPseudomonaz aeruginosawere84(30356)，56(20356)and37(13356)，respectivelyNo Shigella spp strainwas isolatedSalmonella enteritidisand Salmonellatyphimurium werethe dominantserotype for38Salmonellasppstainswith theisolationrateof632(2438)Each10Enteropathogenic Escherichia coli and10359论著万方数据主堡垒墅匡堂蓥查!至!旦箜丝鲞笙!塑垦!尘垫!塑塑!坚型垫!丝!堕!EnteroaggregativeEscherichia coliisolates weredetectedamong thediarrheagenieEscherichia coliEnterohemorrhagic Escherichia coli，Enteroinvasive Escherichiacoli andEnterotoxigenic Escherichiacolistrainwas notfound inthisstudyThe resistant rates ofSalmonellasppto ampicillin and ceflriaxonewere526(2038)and132(538)，while thediarrheagenic Escherichiacoli were1120and120，respectivelyThree diarrheagenic Escherichiacoliisolates producedextended spectrumbetalactamaseConclusionsSalmonella sppwasthemajor bacterialpathogen amongtheoutpatientswithinfectiousdiarrhea inthehospitalThe studyindicated thattheinfection ratiosofStaphylocousaureusdiarrheagenicEscherichiacoliand Pseudomonasaeruginosa increasedShigellasppwas nolong themain pathogenicagentThe resistantratesofSalmonellaspp anddiarrheagenicEscherichiacoli toampicillin werehigh，but lowresistantratestoceflriaxone werefound amongthese twokinds ofbacteria7rhe thirdgeneration cephalosporinsshould bethefirst choicefor thetreatment ofchildhood bacterialdiarrhea【Key words】Diarrhea；Salmonella；Escherichiacoli；Drug resistance，Bacterial ChildDOh103760cmaJissn10099158201905008感染性腹泻是儿科常见病、多发病，是一种以大便次数增多和大便性状改变为特点的消化道综合征。 国内儿童感染性腹泻以细菌和病毒为主，其中细菌病原主要包括致泻性大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、副溶血弧菌等，发病高峰多在每年的6至8月n。 随着社会进步，生活水平提高，卫生条件好转，儿童感染性腹泻的致病细菌谱可能出现改变。 因此，对儿童感染性腹泻进行细菌病原学的持续监测，对临床诊治具有重要的意义。 本研究对首都儿科研究所附属儿童医院感染科及消化科门诊诊断为感染性腹泻患儿的粪便标本进行细菌病原学检测，了解目前我院门诊患儿感染性腹泻的细菌病原学变化、耐药性变迁，为该病的治疗与长期预防提供一定的研究依据。 对象与方法 一、对象选取xx年8月至2018年7月首都儿科研究所附属儿童医院感染科与消化科门诊诊断为感染性腹泻的14岁以下初诊患儿，每日排便3次或以上且粪便性状发生改变，如稀便、水样便、黏液便、脓血便或血便等，便常规镜检WBC，5个高倍视野、RBC，0个高倍视野，病程在2周内且长期居住在北京地区，收集患儿临床信息资料。 对明确诊断为生理性腹泻、过敏性腹泻、病毒性腹泻、寄生虫性腹泻或因肠道消化吸收功能障碍引起的腹泻病例均需除外。 本研究已通过首都儿科研究所伦理委员会通过(伦理审查编号SHERLLxx049)，并征得人组患儿及家长知情同意。 二、方法1试剂与仪器粪便液体转运培养基购自意大利Copan公司。 哥伦比亚血琼脂培养基、SS琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、弧菌选择性琼脂培养基、MH琼脂培养基与药敏纸片购自英国Oxoid公司，Vitek全自动分析鉴定仪购自法国梅里埃公司，T100PCR仪购自美国BioRad公司，沙门菌诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司，DNA聚合酶购自日本Takara公司。 药敏质控菌株大肠埃希菌ATCC25922美国菌种保藏中心(AmericanType CultureCollection，ATCC)。 致泻性大肠埃希菌质控菌株CICC 24189、CICCl 0670、CICCl 0662、CICCl 0667、CICC24186中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Centerof IndustrialCultureCollection，CICC)，依次分别为肠致病型大肠埃希菌(Enteropathogenic Escherichiacoli，EPEC)、丑芴出血型大肠埃希菌(EnterohemoHha自c Escherichiacoli，EHEC)、肠侵袭型大肠埃希菌(EnteroinvasiveEscherichia coli，EIEC)、肠毒素型大肠埃希菌(Enterotoxigenic Escherichiacoli，ETEC)及肠聚集型大肠埃希菌(Enteroaggregative Escherichiacoli，EAEC)。 2细菌培养与鉴定将新鲜粪便标本置于液体转运培养基，2h内送至实验室，按美国感染病协会推荐心3，分别接种哥伦比亚血琼脂培养基、SS琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、弧菌选择性琼脂培养基上，35培养1824h观察，对可疑致病细菌进行分离，并应用Vitek全自动分析鉴定仪进行细菌鉴定，包括大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、气单胞菌、邻单孢菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌等。 3沙门菌血清学分型用针对沙门菌群(AF)抗原、菌体(O)抗原及鞭毛(H)抗原的不同抗血清对沙门菌进行血清型鉴定。 万方数据主堡垒堕堕芏苤查!Q!生!旦箜丝鲞笙!塑鱼堑!垦坐坚型，坠型!Q!丝!坠14致泻性大肠埃希菌鉴定利用PCR方法对5种致泻性大肠埃希菌(diarrheagenic Escherichiacoli，DEC)进行鉴定，包括EPEC、EHEC、EIEC、ETEC及EAEC。 PCR扩增5种致泻性大肠埃希菌的特异性目的基因引物见表1，反应条件为94预变性5rain，94qC变性30S，58退火30s，72oC延伸30S，30个循环，72再延伸10min。 表1PCR扩增5种致泻性大肠埃希菌目的基因引物列表注EPEC示肠致病型大肠埃希菌，EHEC示肠出血型大肠埃希菌，EIEC示肠侵袭型大肠埃希菌，ETEC示肠毒素型大肠埃希菌，EAEC示肠聚集型大肠埃希菌5药物敏感性实验采用Kirby-Bauer纸片扩散法。 根据美国CLSIxx版推荐用药并结合儿科临床用药特点，沙门菌选用抗菌药物包括氨苄西林、氨苄西林舒巴坦、头孢曲松、环丙沙星、复方磺胺甲嗯唑、美罗培南；DEC选用抗菌药物包括氨苄西林、氨苄西林舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林他唑巴坦、头孢呋辛酯、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南、环丙沙星、复方磺胺甲嗯唑、美罗培南。 按CLSIxx版解释进行菌株敏感、中介、耐药判读。 6致泻性大肠埃希菌产超广谱B内酰胺酶检测按CLSIxx版推荐的头孢他啶、头孢他啶克拉维酸与头孢噻肟、头孢噻肟克拉维酸双纸片协同试验进行产超广谱B内酰胺酶(extendedspectrum B1actamases，ESBLs)检测。 三、统计学分析计数资料用例数或者菌株数表示，应用WHONET56软件进行抗菌药物敏感性分析，应用SPSS180软件进行统计学分析，各年龄组、性别间细菌病原检出率的比较采用x2检验，因沙门菌、致泻性大肠埃希菌检出株数小于40，故其抗菌药物耐药率的比较采用Fisher确切概率法，PO05)，其中男、女患儿沙门菌、金黄色葡萄球菌、DEC与铜绿假单胞菌的检出率上差异无统计学意义(PO05)。 6岁患JL_ltt菌病原的总检出率分别为271(58214)、286(2070)、472(1736)、222(836)，检出率上差异无统计学意义(P005)。 1岁患儿沙门菌的检出率为183(26142)，高于1岁患儿56(P005)；1岁万方数据主堡堕堕堕兰蓥查!Q!至!旦笙丝鲞笙i塑g!鱼!坚!塑型!塑型垫!，!兰!堕!表2腹泻相关细菌病原在不同性别和年龄中的分布株()沙门菌38(107)22(103)16(113)0087076812(56)11(157)1l(306)4(111)144450000金黄色葡萄球菌30(84)15(70)15(106)1397023726(121)2(29)l(28)1(28)96340002致泻性大肠埃希茵20(56)10(47)10(70)0904034210(47)6(86)4(111)009040342铜绿假单胞菌13(37)8(37)5(35)0011O9158(37)1(14)1(28)3(83)0叭l0915嗜水气单胞菌1(03)l(05)0000010001(05)00000001000阪崎肠杆菌1(03)1(05)0O00010001(05)00000001000合计103(289)57(266)46(324)1377024l58(271)20(286)17(472)8(222)69980072注P值为男、女患儿细菌病原检出率比较；P值为1岁组患儿细菌病原检出率比较，沙门菌检出率1岁组183(P=0ooo)，金黄色葡萄球菌检出率1岁组28(P=O002)患儿28(P1岁与005)。 二、沙门菌血清型及耐药性分析对38株沙门菌进行血清学分型实验，共鉴定出12种血清型，另有3株暂未鉴定到种。 以肠炎沙门菌检出率最高，为447(1738)，其次为鼠伤寒沙门菌，为184(738)。 沙门菌在各年龄组检出株数散在分布，6岁患儿各检出沙门菌 12、 11、10和5株。 检出的少见血清型有阿贡那沙门菌2株，伦敦沙门菌、汤b逊沙门菌、斯坦利沙门菌、布伦登卢普沙门菌、曼哈顿沙门菌、波斯坦沙门菌、科特布斯沙门菌、婴儿沙门菌、德比沙门菌各1株。 沙门菌对抗菌药物的药敏结果见表3。 沙门菌对氨苄西林、氨苄西林舒巴坦的耐药率分别为526、395，对头孢曲松、复方磺胺甲嗯唑耐药率均为132，对环丙沙星的耐药率为53，所有菌株均对亚胺培南敏感。 肠炎沙门菌与鼠伤寒沙门菌在各类抗菌药物的耐药率上差异无统计学意义(P005)。 三、DEC分型及耐药性分析共检出DEC20株，其中EPEC、EAEC各10株，未检出EHEC、EIEC及ETEC菌株。 DEC对抗菌药物的药敏结果见表4。 对氨苄西林的耐药率为1120，对复方磺胺甲嗯唑耐药率为920，对头孢呋辛酯、头孢曲松的耐药率分别为3 20、120，所有菌株均对哌拉西林他唑巴坦、头孢吡肟、环丙沙星敏感。 EPEC与EAEC在各类抗菌药物的耐药率上差异无统计学意义(PO05)。 经双纸片协同试验，共检测出3株DEC产ESBLs，占320，其中EPEC2株、EAECl株。 讨论研究表明，在发展中国家，每年有187万5岁以下儿童死于腹泻病，占儿童总死亡病例的193。 据统计，中国地区5岁以下儿童感染性腹泻的发病率约人均143次年4。 本研究对近一年我院门诊急性感染性腹泻儿童的粪便进行细菌病原学检测，总阳性率278，略低于北京儿童医院xx年51同期监测结果，提示近年来北京地区儿童腹泻病的总发病率有下降趋势。 研究中1岁以下婴儿病例占总病例数601(214356)，考虑与其消化系统发育尚未成熟，机体免疫功能不完善，人工喂养的食物表3沙门菌对抗菌药物的药敏结果注S示敏感，R示耐药；a与鼠伤寒沙门菌抗菌药物耐药率比较，P005万方数据表4致泻性大肠埃希菌对抗茵药物的药敏结果注s示敏感，R示耐药；DEC示致泻性大肠埃希菌，EPEC示肠致病型大肠埃希菌，EAEC示肠聚集型大肠埃希菌；a与EAEC抗菌药物耐药率比较，PO05及食具增加污染机会，并易出现肠道菌群失调有关。 本研究有4例腹泻患儿同时感染两种致病菌，占总病例数11(4356)，已有相关报道儿童细菌性腹泻的多重感染病例可达1036】，多种细菌病原引起的混合感染应引起关注。 沙门菌是人畜共患病的致病菌，本研究中l岁以上患儿沙门菌的检出率较高，这与儿童的成长、活动特点相符，此年龄段儿童活动范围、频率增加，接触被细菌污染的传染源机会较多，易于被感染。 研究显示，我院门诊儿童腹泻细菌病原学仍以沙门菌为主，与于国慧等7】对北京地区xx年的监测结果一致。 Qu等【81对北京市儿童xx军xx年感染性腹泻病原检测分析，沙门菌位于所有检出菌的第二位，而广州、武汉、上海、海南等地的腹泻儿童致病菌研究均以沙门菌为主，提示沙门菌在儿童感染性腹泻疾病中是主要的细菌病原之一【9-11。 本研究中，沙门菌的血清分型以肠炎沙门菌与鼠伤寒沙门菌为主，这与曲梅等12对北京地区xx至xx年和王爱敏等1，对上海地区xx年肠道门诊腹泻儿童沙门菌研究血清分型结果一致。 有必要对儿童沙门菌进行血清分型的持续监测，及早发现主要型别的变化。 长期以来，由于抗生素的广泛使用，使得沙门菌的耐药性不断上升，尤其是对氨苄西林、三代头孢菌素类药物。 曲梅等12】对北京以及其他学者153对成都、武汉地区的研究显示，腹泻儿童分离的沙门菌对氨苄西林耐药率高达503680、头孢曲松的耐药率为77。 本研究中，沙门菌对氨苄西林的耐药率超过50，对头孢曲松的敏感率超过80，故后者仍可作为临床治疗儿童沙门菌腹泻感染的首选药物。 在我国，儿童也是致泻性大肠埃希菌的易感人群。 多项研究显示，中国地区感染性腹泻儿童致泻性大肠埃希菌的检出率510，以EAEC为主要型别，其次为EPEC、ETEC【I8|。 本研究致泻性大肠埃希菌的检出率为56，且以EPEC、EAEC为主，未检测到EHEC、EIEC与ETEC菌株，这与美国田纳西州的报道相一致【I9l。 另外，本研究致泻性大肠埃希菌对氨苄西林的耐药率达920，对头孢曲松耐药率不超过10，且产ESBLs菌株检出率仅为320，但广州地区研究显示儿童致泻性大肠埃希菌的上述耐药性要高于本研究结果【9，武汉地区甚至出现碳青霉烯耐药菌株n7|。 致泻性大肠埃希菌导致儿童感染性腹泻在分布、流行趋势及耐药性上存在地区性差异，三代头孢类抗生素仍可作为门诊致泻性大肠埃希菌引起的细菌性腹泻患儿治疗的首选。 值得注意的是，本研究中未发现志贺菌引起的儿童腹泻感染病例。 北京地区儿童细菌性腹泻病原中，志贺菌的构成比已由1998年的825降至xx年的529t驯，xx年志贺菌的检出率为150t2。 结合本研究未分离出志贺菌，考虑其已非北京地区儿童感染性腹泻的主要细菌病原，主要与生活水平提高、卫生条件好转导致该菌的感染率降低有关。 有研究表明，中国发达地区感染性腹泻儿童志贺菌的检出率仅为021，明显低于发展中地区(1695)t22。 另外，北京地区整体气候变暖，使得细菌活力改变n】。 也可能由于志贺菌引起的儿童痢疾症状较既往不典型，早期抗生素经验治疗致其检出率偏低，有关原因需要进一步考证，志贺菌感染的变化趋势值得关注。 本研究中金黄色葡萄球菌是引起的儿童腹泻病例的第2位主要致病万方数据主堡坌墅堕兰苤查!Q!堡i旦箜丝鲞笙i塑垦堑!堕!塑旦丛型!Q!里!型兰!堕!i菌，相比于xx年于国慧等1的研究有上升趋势，且多集中在1岁以内婴儿，这与婴儿免疫功能较低，主要食物为母乳或乳制品，而母亲患有乳腺炎或喂奶器具污染可能导致相关感染有关。 另外，本研究中也发现铜绿假单胞菌引起的儿童腹泻病例，检出率为37，明显高于相关研究结果(10)【231，是否有就诊前已应用抗生素导致肠道菌群失调或抗生素筛选性感染的可能，类似条件致病菌感染门诊患儿的原因需要进一步明确，提示指导腹泻患儿抗生素合理使用的必要性和重要性。 本研究针对我院门诊感染性腹泻儿童细菌病原学分析，沙门菌为主要致病细菌，病原呈现多元化趋势，金黄色葡萄球菌、致泻性大肠埃希菌、铜绿假单胞菌感染几率增加，志贺菌已不再是引起我院门诊儿童腹泻的主要病原。 主要致病菌的耐药谱分析，为不能得到病原学诊断的门诊细菌性腹泻患儿使用三代头孢类抗生素治疗提供I临床依据。 在目前抗生素选择压力下，对肠道感染性细菌进行分型和耐药性持续监测，是为儿童腹泻病临床诊断、治疗及预防提供明确流行病学证据的重要工作。 利益冲突本研究所有作者均声明无利益冲突【2】【3】3【4】【5】5【6】6【8】【9】9参考文献黄芳，邓瑛，曲梅，等xx年北京市感染性腹泻病原学监测分析【J】中华预防医学杂志，201l，45 (9)820824DOI1037601cmajissn02539624xx09012Shane AL，Mody RK，Crump JA，et a1xxInfectiousDiseases Societyof AmericaClinical PracticeGuidelines fortheDiagnosis andManagement ofInfectiousDiarrheaJClinInfect Disxx,6502119631973DOhl01093cidcix959BoschiPinto C，Velebit L，Shibuya KEstimating childmortalitydue todiarrhea indeveloping countriesJBullWorld HeatthOrgan，xx，86 (9)710717DOI102471，BLT07050054Cui PLi J，Liu N，et a1Incidence ofacute diarrhealillness inChinesemunitiesa metaanalysisJBMC Gastroenter01201818f11114DOI101186s12876018-08392于国慧，宋文琪，甄景慧xx年儿童急性感染性腹泻病原菌监测结果分析【J】中国妇幼保健，xx，24 (18)25062508Langendorf C，Le HclioSMoumouni Aet a1Entericbacterialpathogensin childrenwith diarrhea inNigerdiversity andantimicrobial resistanceJPLoS Onexx10f31e120275DOh10137ijournalpone0120275于国慧。 董方，甄景慧，等北京地区儿童感染性腹泻病原学和耐药性分析J】临床儿科杂志，xx，28 (6)535538DOI1039690issn1000-3606xx06008Qu M，Lv B，Zhang X，et a1Prevalence andantibioticresistance ofbacterial pathogensisolatedfromchildhooddiarrhea inBeijing，China(xx-xx)【J】Gut Pathog，xx，831DOIlO1186s130990160l162黄莲芬，刘海英，谢永强，等201l一xx年广州地区儿童【lO】【12】【13】【14】【15】【16】【17】【18】【19】【20】【21】【22】【23腹泻病原菌分布及耐药性分析【J】国际检验医学杂志，xx，36(1o)13511353DOl103969，iissn16734130xx10013Tian L，Zhu X，Chen Z，el a1Characteristics ofbacterialpathogens associatedwithacute diarrhea inchildren under5years ofagea hospital-based cross-sectional studyJ1BMCInfecl 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