DMEM培养基制备SOP.doc

DMEM培养基制备SOPXB-JS-20.020.01DMEM培养基的配置1 实验目的 配制DMEM培养基2 实验原理2.1 DMEM培养基的用途 DMEM and Clicks media have an osmolarity that is more compatible with mouse serum than RPMI; in fact, RPMI was specifically designed for the culture of human cells.2.2 本实验室在培养小鼠来源细胞时选用DMEM培养基的理由2.3 培养基中各种组分的作用及添加依据2.3.1 Hepes（羟乙基哌碃乙硫磺酸, 238.3）：25mM/L(5.9575g/L)，不加碳酸氢钠时pH为6.70.3，加碳酸氢钠时pH为7.00.3。单独配制时，配制为100X即0.6g/ml。 配制2.5M/L(0.6g/mL) Hepes：12g的Hepes定容到20ml PBS中，过滤除菌，分装为1ml/管，20C保存。Cell Biology建议为4C保存。 HEPES 是一种非离子缓冲液,在pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力,但是非常昂贵,在高浓度时对一些细胞可能有毒.HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠(0.34g/L)共用,以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加(不懂，何为抵消？邹强).在这种培养条件下,细胞培养瓶的盖子应拧紧,以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中. 来自网络。2.3.2 缓冲系统: 来自网络。 大多数细胞所需pH 在 7.2 - 7.4.但是,细胞培养最适pH值随培养的细胞种类不同而不同.成纤维细胞喜欢较高pH (7.4 - 7.7), 而传代转化细胞系则需要偏酸pH (7.0 - 7.4). 由于多数培养液靠碳酸氢钠(NaHCO3)与CO2体系进行缓冲,因此,气相中的CO2浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡.如果气相或培养箱空气中CO2浓度设定在5%,培养液中NaHCO3的加入量为1.97g/L;如果CO2浓度维持在10%,培养液中NaHCO3的加入量为3.95g/L. 细胞培养瓶盖不应拧得太紧,以保证气体交换. 大多数培养液中含有酚红作为pH指示剂,酸性培养液呈橙黄色,碱性培养液呈深红色. 碳酸氢钠：CO2浓度为5%时，培养液中碳酸氢钠浓度为1.97g/L；CO2浓度为10%时，培养液中碳酸氢钠浓度为3.95g/L（科学出版社.细胞实验指南P6）。DMEM的说明书上为3.7g，我们实际添加为2时，如果加入25mM Hepes在5%CO2条件下，测定PH为7.11；不加Hepes时PH为7.44。添加碳酸氢钠3.7g在在5%CO2条件下的PH是？ （引自Cell Biology）：Most cell culture media require an atmosphere of 5% CO2 to maintain pH 7.4. However, certain media contain levels of bicarbonate that require different amounts of CO2. For example, DMEM containing 3700 mg/liter of sodium bicarbonate equilibrates to pH 7.6 in a 5% CO2 environment and requires 10% CO2 to maintain pH 7.4. （引自IMMUNOLOGY）：HEPES buffer (10 to 25 mM) must be included in media used in short procedures that are not performed in a defined CO2 atmosphere. HEPES maintains the pH of the media regardless of atmospheric CO2; thus, it is often used as an additive to media used in CO2 incubators since it renders the pH of the media less sensitive to small fluctuations in CO2 concentration. 小苏打又名碳酸氢钠，为白色结晶性粉末，无臭，味微咸，在潮湿空气中即缓慢分解。易溶于水，水溶液呈弱碱性反应，水溶液放置稍久，或振荡，或加热，其碱性即增强(怀疑是生成CO2，从溶液中溢出。邹强)。在乙醇中不溶。 白色晶体，或不透明单斜晶系细微结晶。比重2.159。无臭、味咸，可溶于水，微溶于乙醇。其水溶液因水解而呈微碱性，受热易分解，在65以上迅速分解，在270时完全失去二氧化碳，在干燥空气中无变化，在潮湿空气中缓慢分解。溶解度：7.8g/100mL，18 C；16.0g/100mL，60C 16.0g/100mL。(百度百科) 受热分解：2NaHCO3（s）Na2CO（s）+H2O（g）+CO（g） 制法a) 气相碳化法b) 将碳酸钠溶液，在碳化塔中通过二氧化碳碳化后，再经分离干燥，即得成品。c) Na2CO（aq）+ CO（g）+ H2O（l）2NaHCO（aq）d) 气固相碳化法e) 将碳酸钠置于反应床上，并用水拌好，由下部吹以二氧化碳，碳化后经干燥、粉碎和包装，即得成品。 Na2CO（aq）+ CO（g）+ H2O（l）2NaHCO （aq）2.3.3 Antibiotics The supplement most commonly employed to prevent bacterial contamination is a cocktail of penicillin (100 U/ml) and streptomycin sulfate (100 g/ml). A more expensive (but more stable) alternative is 20 to 50 g/ml gentamycin. These antibiotics do not check the growth of a common contaminant, mycoplasma.（引自IMMUNOLOGY） （引自Cell Biology）Table 1.2.3 Some Antibiotics Used in Culture Media and Their Microbial Targets Antibiotic Concentration Microbial targets Amphotericin B 2.5 g/ml Yeast and other fungi Ampicillin 100 g/ml Gram-positive and -negative bacteria Chloramphenicol 5 g/ml Gram-negative bacteria Gentamicin 50 g/ml Gram-positive and -negative bacteria, mycoplasma Kanamycin 100 g/ml Gram-positive and -negative bacteria, mycoplasma Penicillin G 100 IU/ml Gram-positive bacteria Streptomycin 100 g/ml Gram-positive and -negative bacteria Tetracycline 10 g/ml Gram-positive and -negative bacteria, mycoplasma 2.3.4 FBS In studying hormonally responsive cell lines in culture, Sato and his colleagues realized that a major role of serum in culture medium was to provide hormones and hormone-like growth factors that were required for cell proliferation and expression of differentiated functions (Bottenstein et al., 1979; Barnes and Sato, 1980; Barnes, 1987). This understanding led them to replace serum with purified hormones, growth factors, transport proteins, and attachment factors as supplements for preexisting nutrient media.2.3.5 2-ME （引自IMMUNOLOGY）2-Mercaptoethanol must be included in media used for procedures involving primary immunization of T and B cells in suspension cultures. The precise mode(s) of action of 2-ME has not been defined; its presence during growth of established cell lines appears not to be required, but it has proven to be a critical ingredient in primary cultures. It is convenient to always use 2-ME as a supplement in media since it has no adverse effects on the culture of cell lines.原代培养时必须添加2-ME，而且2-ME对细胞株的生长没有不利影响，所以我们都要求添加。 In the absence of 2-ME, murine B cells will proliferate poorly, particularly if a significant number of dead cells are present. （引自IMMUNOLOGY）2-Mercaptoethanol must be added to media immediately before use because its activity rapidly declines in diluted form. Thus, concentrated 2-ME (14.3 M) is diluted to 50 mM in HBSS or PBS and this solution is added to media at a final concentration of 50 M. The 50 mM stock solution is stored at 4C and should be replaced after 4 months. 2-ME在水溶液中活性降低很快，所以必须是使用时添加。 来自网络：在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分.如在杂交瘤技术中常用的DMEM培养液,使用时还需要补加丙酮酸钠和2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol,2-Me). 2-Me 对细胞生长有很重要的作用.有人认为它相当于胎牛血清,有直接刺激细胞增殖作用.2-Me的活性部分是硫氢基,其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽,能诱导细胞的增殖,为非特异性的激活作用.同时避免过氧化物对培养细胞的损害.另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA合成,增加植物凝集素(PHA)对淋巴细胞的转化作用,已广泛应用于杂交瘤技术,另外,也开始用于一些难以培养的细胞.2-Me是一种小分子还原剂,极易氧化.分子量为78.13,纯的2-Me是一种无色有刺激味的液体,比重为1.110-1.120(Do20),常用终浓度为510-5M.常配制成0.1M的储存液,用时每升培养液加0.5ml.2.3.6 L-glutamine 常用2-4mM, media DMEM：Cat No 12800-017 , Gibco, with 584mg/l（4mM） L-glutamine .materialreagentsL-G_glutamine.pdf . L-glutamine in DMEM, GMEM, IMDM and H-Y medium is 4 mM. IMDM is often used as a starting formulation for proprietary hybridoma cell culture media. Hybridoma cells grow better in concentrations of L-glutamine that are above the average levels found in media.所以，杂交瘤细胞用DMEM（4mM谷氨酰胺）培养时，再补加2mM谷氨酰胺，即谷氨酰胺的浓度为6mM。 来自网络：氨基酸是组成蛋白质的基本单位.不同种类的细胞对氨基酸的要求各异,但有几种氨基酸细胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,这几种氨基酸称为必需氨基酸.其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡.因此,各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺. .materialreagentsL-GlutamineL-Glutamine Stability.pdf .materialreagentsL-GlutamineStability_GlutaMAX_Y14475_Stblty_GlutaMAX.pdf L-glutamine在不同温度条件下降解的情况如下:Day0123456737度invtrogen（mg/L）80070060050048040035025037度jrhbio（mM）6.25.854.52.8 从上面的数据看来，我们可以得出2点，一是37度时谷氨酰胺降解很快，所以培养时需要及时换液，如果只是传代，那么在传代比例大的情况下如1：2等，是否会因谷氨酰胺量不足而影响细胞生长；还有降解产生的氨对细胞有毒作用，是否应该采取小比例传代或完全去掉原培养液的方法？第二，4度的情况下谷氨酰胺的降解情况与中文的不一致，降解速度并没有那么快，是否是配制好的培养基可以在4度长期保存？保存期？保存条件下，降解产生的氨对细胞的影响还考虑否？补加对细胞的影响是否只是考虑氨的毒作用？毒作用的影响？ 来自网络：由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置于-20冰箱中保存,在使用前加入培养液内.已含谷氨酰胺的培养液在4冰箱中储存2周以上时,还应重新加入原来量的谷氨酰胺. 问题的关键是，谷氨酰胺在4情况下，能保存多长时间，由此决定配制好的培养基能在4下保存多少时间？或者保存多长时间后，需要另外补充谷氨酰胺？如果谷氨酰胺浓度增加1倍，是否会对细胞有毒性。(邹强) (KHAN1991:Clin Nutr_Factors affecting the stability of L-glutamine in solution) The degradation rate of L-glutamine in the intravenous solutions was less than 0.15%/day at 4 degrees C, minimal at -20 degrees C (0.03%/day), and undetectable at -80 degrees C.该文没有得到全文，这个实验只是做了2周的时间，照这些数据是否可以推测培养基在4度放置100天需补加谷氨酰胺0.6mM？3 实验材料（包括配方，保存条件，保存时间）3.1 试剂1. DMEM：Cat No 12800-017 , Gibco, with 584mg/l（4mM） L-glutamine, without sodium bicarbonate，4500mg/l D-glucose, 110mg/l sodium Pyruvate，with pyridoxine hydrochloride。Material and ReagentDulbeccos Modified Eagle Medium_Invitrogen_12800017.pdf 1L/袋，干粉2. Hepes：试剂信息 干粉，常温保存。3. NaHCO3：试剂信息 固体，常温保存。4. 双抗（青霉素与链霉素）：试剂信息 配制： -20保存，备用5. FBS：试剂信息 使用15ml离心管，分装10ml/管 保存，备用。6. 2-ME：试剂信息 配制2-ME贮存液（1000X）：取2ul 2-ME原液(14.3mol/L), 加到570ul 灭菌PBS中(终浓度为50mmol/L)。 使用1.5ml灭菌EP，分装100ul/管。 4C保存，备用。7. L-glutamine：试剂信息 配制200mM谷氨酰胺（L-glutamine，分子量146）：即29.2g/l，称取2.92g L-glutamine，定容到100ml PBS中 过滤除菌后，使用1.5ml灭菌EP，分装1ml/管。 -20C保存，备用。8. 10PBS：精编分子生物学实验指南P700成分分子量摩尔浓度（mol/L）含量配制备注NaCl58.51.378 g天平称取H2O加少量水溶解KCl74.50.0270.2 g天平称取H2O加少量水溶解Na2HPO4.12H2O358.140.0431.54 g天平称取H2O加少量水溶解溶解KH2PO4136.090.0140.2 g天平称取H2O加少量水溶解H2O定容至100mlPH7.39. 1PBS：由10PBS稀释3.2 材料10. 1L量筒1个，1L烧杯2个，玻璃棒，磁力搅拌子11. 1L不锈钢滤器 滤膜的选择与数量？ 滤膜的组装注意事项 高压灭菌121，20min12. 漏斗1个13. 带盖的100ml血清瓶16个 血清瓶需要干热灭菌200，2h（考虑到温度上升的时间，采用设置温度200后3h），不需要打开饭盒的透气孔 盖子需要高压灭菌121，20min14. 12支带盖玻璃离心管 高压灭菌121，20min4 简要流程（配制1L DMEM培养基）序号步骤备注1.使用超纯水800ml溶解1L/袋