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2.4.7测定米糠解脂酶的相对分子量 本实验采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定米糠解脂酶的相对分子量14。购买标准Marker蛋白做标准曲线，标准蛋白分子量范围为14.4 kD97.4 kD。2.3.7.1试剂准备：i. 30%丙烯酰胺贮存液：29 g丙烯酰胺和1 g N,N-亚甲双丙烯酰胺溶于100 mL热水中，验证其pH值不大于7.0。置棕色瓶中，4保存。ii. 1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）溶液iii. 10% SDS溶液：10%（W/V），4保存，用时加热溶解iv. 10%过硫酸铵：称取AP1 g，加重整水定容到10 mL，现用现配v. TEMED溶液：1%(V/V)，4保存vi. 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）溶液vii. Marker标准蛋白样品缓冲液：0.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）溶液 2.0 mL甘油（丙三醇） 2.0 mL20%（W/V）SDS 2.0 mL0.1%(W/V)溴酚蓝 0.5 mL-巯基乙醇 1.0 mL重蒸水 2.5 mLviii. 待测样品缓冲液：0.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）溶液 1.0 mL甘油（丙三醇） 1.6 mL10%（W/V）SDS 1.6 mL-巯基乙醇， 0.4 mL0.05%（W/V）溴酚蓝 0.4 mLix. 电极缓冲液（5）：称取45.0g Tris，216.0g甘氨酸和15.0 gSDS用重整水定容到3 L，4保存，使用前37加热。x. 固定液：冰乙酸甲醇水=127xi. 考马斯亮蓝R染色液：每100 mL甲醇、水、冰乙酸混合物（992）中，溶解0.25 g考马斯亮蓝R，过滤除去未溶物。xii. 脱色液：甲醇水冰乙酸=9922.3.7.2 操作步骤如下：1、准备步骤1）将凝胶板依次用水、无水乙醇洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。2）试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。3）灭菌枪头、eppendorf管。2、制备凝胶1）安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中，以5%琼脂封底。2）配制12%的分离胶（10 mL）： 依次将4.0 mL30%丙烯酰胺贮存液，3.35 mL双蒸水，2.5 mL1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）溶液，0.1 mL 10% SDS溶液，50 L10%过硫酸铵，5 LTEMED混合，一定要搅拌均匀。3）灌胶：迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1 cm。用移液枪小心在胶上覆盖一薄层正丁醇。4）在分离胶聚合的过程（约40 min）中，配制4%的浓缩胶（5 mL）：依次混合3.05 mL双蒸水，650l 30%丙烯酰胺贮存液，1.25 mL0.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）溶液，50 L10% SDS溶液，25 L 10%过硫酸铵，5 L TEMED（TEMED应在灌胶前才加入）。5）分离胶聚合完全后，倒去正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面数次，用滤纸吸干胶面上的残余水。灌注积层胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。6）积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙烯酰胺。3、样品的制备在标准蛋白溶液中加入等体积的2样品溶解液，使蛋白的终浓度为3-4 mg/mL，混合液在沸水浴中加热3分钟，冷却后即可上样。待测蛋白按1体积待测蛋白溶液加3体积样品缓冲液，混合后在沸水浴中加热3分钟，冷却后上样。4、上样用微量进样器上样，上样量为15 L左右。每加入一种样品，应在双蒸水和电极缓冲液中洗涤加样器数次。5、电泳向电泳槽内加入适量电极缓冲液，使内槽电极缓冲液没过短玻璃板5 mm，外槽液面较内槽低约10 mm打开电源，初始电流为10 mA(电压为40 V)；当染料进入分离胶（这段时间约为2 h）后，将电流提高到20 mA(电压为80 V)，继续电泳直至染料到达离凝胶底部0.5 cm处。6、后处理1）固定：从电泳装置上卸下玻璃板，用镊子小心撬开玻璃板，除去积层胶部分，将分离胶移入固定液（固定液的量至少为胶体积的5倍）中固定，直至染料由蓝绿色变为黄色。2）染色：除去固定液，加入染色液