APLICACIóN DE MéTODOS MOLECULARES PARA DETERMINAR DIVERSIDAD MICROBIANA SULFOXIDANTE EN REACTORES.doc

APLICACI N DE M TODOS MOLECULARES PARA DETERMINAR DIVERSIDAD MICROBIANA SULFOXIDANTE EN REACTORES DE CULTIVO CONTINUO E IDENTIFICACI N DE AISLADOS B M P rez Ibarraa A Hamdan Partida S R Moiseev H Ram rez Saad a Departamento de sistemas biol gicos laboratorio de ecolog a molecular Universidad Aut noma Metropolitana Xochimilco Calzada del hueso No 1100 Col Villa Quietud C P 23 181 D F M xico niqus RESUMEN Los microorganismos sulfoxidantes provenientes de una comunidad bacteriana en reactores de cultivo continuo a diferentes condiciones de operaci n fueron aislados y caracterizados mediante t cnicas de biolog a molecular para posteriormente analizar su comportamiento como parte de un consorcio sometido a proceso de sulfoxidaci n en presencia de metanol El proceso fue muestreado en diez tiempos para observar cambios en la comunidad bacteriana debidos a la presencia de metanol Al analizar el patr n de bandas obtenido por DGGE muestra que la poblaci n predominante en cada una de las muestras obtenidas corresponde a la de los aislados y a la cepa control Thiobacillus ssp INTRODUCCI N En los ecosistemas como sedimentos marinos tapetes microbianos y ventanas hidrotermales ocurren las transformaciones del azufre sulfato reducci n y sulfuro oxidaci n recibe el nombre de ciclo sulfureta Jorgensen 1982 Van den Ende et al 1997 En tales sistemas la oxidaci n de HS puede llevarse acabo tanto por microorganismos aerobios como anaerobios fototr fo en presencia de luz En la ausencia de luz las bacterias incoloras del azufre tambi n contribuyen en transferir el azufre Dichos ecosistemas tienen importancia cient fica por la presencia de microorganismos nicos y espec ficos adem s de una importancia ambiental Procesos biotecnol gicos ambientales y el ciclo biol gico del azufre Los biotratamientos son ampliamente empleados para tratar aguas municipales e industriales Un biorreactor puede ser aerobio o anaerobio dependiendo del agua a tratar los microorganismos en el reactor act an como biocatalizadores para degradan los compuestos org nicos Cada bioreactor es acoplado a un proceso de manufactura por tanto la composici n del agua de desecho contribuye a seleccionar naturalmente la comunidad microbiana en el birreactor Por ejemplo en f bricas de papel y pulpa los boirreactores encargados del tratamiento de sus aguas estar n enriquecidos de microorganismos celulol ticos y en el caso de las refiner as de petr leo contendr microorganismos degradadores de hidrocarburos Conforme se modifican los procesos de manufactura la composici n de las aguas de desecho pueden ir cambiando durante el tiempo lo que hace que los microorganismos dentro del reactor se adapten De este modo la diversidad microbiana en el bioreactor proporciona un nuevo ambiente en el cual nuevas v as bioqu micas pueden desarrollarse as los microorganismos en competencia pueden continuar explotando los recursos administrados por un corriente de agua de desecho alterada Procesos de remoci n de azufre Los procesos tecnol gicos ambientales basados en el ciclo del azufre se apoyan en la formaci n de intermediarios insolubles los cuales son separados de la fase acuosa Como es de esperarse los mismos intermediarios s lidos como esos que se acumulan en la naturaleza CaSO4 sulfuros met licos y azufre se usan en tecnolog as ambientales En el proceso m s viejo para la remoci n de azufre llamado piedra caliza yeso los xidos de azufre eran removidos de la fase gaseosa por el contacto de dicha fase con una soluci n sobresaturada de caliza induciendo as la formaci n de yeso El yeso es usado en la construcci n pero debido a que contamina con metales pesados su uso es limitado De este modo grandes cantidades de este producto de desecho se forma y se requiere eliminar El uso de sulfuros para producir precipitados de sulfuros met licos es un proceso real para el tratamiento de aguas contaminadas con metales pesados El sulfuro puede ser adicionado como compuesto qu mico o bien puede ser producido en un biorreactor sulfato reductor Los sulfuros met licos necesitan extraerse de las aguas tratadas y adem s debe procesarse Un proceso completo para la remoci n de azufre de las aguas de desecho se basa en la formaci n de azufre elemental En este proceso el sulfuro es producido a partir xidos de azufre en un biorreactor sulfato reductor En un segundo biorreactor el sulfuro es subsecuentemente convertido a azufre elemental v a oxidaci n biol gica parcial El azufre elemental puede emplearse en la producci n de cido sulf rico o en la elaboraci n de fertilizantes De acuerdo con lo aqu expuesto las comunidades microbianas poseen un gran potencial ya que llevan acabo procesos importantes para el sostenimiento de la biosfera a escala global soportando la vida de muchos otros organismos y destruyendo muchos de los productos de desecho de la sociedad humana Tal potencial es explotado en los procesos biotecnol gicos para el tratamiento de aguas residuales Recientemente se describi un amplio rango de bacterias sulfato reductoras aut trofas como tambi n heter trofas capaces de crecer en condiciones extremas Estas incluyen termofilos Thermodesulfobacterium hvragerdense y thermodesulfovibrio islandicus Sonne Hansen y Ahring 1999 psicrofilicos Desulfofrigus fragila Desulfofaba gelida y Desulfotalea psychrophila Knoblauch et al 1999 halofilos Desulfobacter halotolerans Brandt y Ingvorsen 1997 y alcalofilos Desulfotomaculum alkliphilum Pikuta et al 2000 Muchos de estos extremofilos se han aislado de sedimentos marinos El conocimiento de la comunidad bacteriana es la llave para entender procesos tales como las semejanzas en evoluci n microbiana y biodiversidad para su posterior aplicaci n en la biodegradaci n y bioremediaci n Por tal motivo dado a que los cido nucleicos se encuentran en todas las formas de vida su propiedad de cido nucleico y la diferencia en la secuencia de la estructura primaria es usada para detecciones especializadas en ambientes complejos Actualmente apoyados en estas nuevas herramientas se conocen catorce principales linajes Reinos de bacterias que se han definido sobre la base de la comparar la secuenciaci n del gen 16S rRNA de cultivos en laboratorio Sin embargo debe tomarse en cuenta que tales metodolog as tiene limitaciones Por ejemplo en los m todos de extracci n de los cido nucleicos de las muestras no se asegura la lisis de todos los microorganismos presentes as como su recuperaci n intacta Adem s es importante su purificaci n para la eliminaci n de sustancias inhibidoras de la reacci n de PCR o la acci n de enzimas de restricci n Wilson I G 1997 Por otro lado se ha reportado que la t cnica de DGGE o TGGE pueden separar fragmentos peque os de hasta 500 pares de bases y esto limita la identificaci n filogen ticas Aunque existen reportes sobre la posibilidad de separar secuencias que difieren en una sola base tambi n se ha reportado la dificultad de separar fragmentos que difieren en 2 o 3 bases Vallaeys T et al 1997 Otras limitaciones de estas t cnicas es el n mero m ximo de bandas de DNA que puedan separarse aunque se ha reportado la detecci n de poblaciones que constituyen el 1 de la comunidad por PCR DGGE Muyzer G et al 1993 En cuanto a los m todos In situ puede ocurrir que no se detecte un microorganismo debido a una permeabilidad insuficiente o a la falta de acceso de las sondas a las regiones a las cuales debe unirse Amann R I 1995 Sin embargo los avances recientes en los m todos para el an lisis de comunidades microbianas hacen posible complementase con los m todos tradicionales para obtener informaci n sobre aspectos importante de la ecolog a microbiana ambiental desde varios aspectos diversidad estructura y funci n Adem s de obtenerse resultados en tiempos m s cortos que los m todos cl sicos de microbiolog a M TODOS A partir de tres reactores con diferentes condiciones de operaci n se aislaron y caracterizaron tres cepas sulfoxidantes empleando tanto m todos cl sicos de microbiolog a composici n de cidos grasos as como tambi n t cnicas de biolog a molecular extracci n DNA amplificaci n del gen 16S rRNA por PCR DGGE y por ltimo secuenciaci n comparando con la base de datos GENBANK Por otro lado en un cuarto reactor alimentado con medio mineral tiosulfato y metanol fue muestreado en diez tiempos para observar cambios en la comunidad bacteriana como consecuencia de la presencia de metanol Se extrajo DNA de las cepas y del consorcio proveniente del reactor alimentado con metanol Entonces el DNA extra do fue usado para amplificar la regi n del gen 16s rDNA empleando primers universales Una vez determinadas las condiciones de amplificaci n se procedi a amplificar la regi n V6 V8 del DNA Para este PCR se adicionaron primers ricos en GC Los productos obtenidos fueron colocados en el DGGE ver fig 1y 2 Las diferentes muestras tanto aislados como las tomadas del reactor fueron corridas simult neamente para comparar los patrones de banda respectivos AN LISIS DE RESULTADOS Los datos obtenidos de las diversas metodolog as microbiologicas indican que las tres cepas comparten caracter sticas morfol gicas y fisiol gicas muy similares Por tanto se procedi a la aplicaci n de herramientas moleculares que pudieran poner de manifiesto diferencias para as ser identificadas en g nero y especie obteni ndose lo siguiente Cepas sulfoxidantes aisladas Comparaci n de secuencias con GenBank paquete Blast search Thiobacillus sp UAM I Cepa de referencia Thiobacillus sp UAM I 16S ribosomal RNA gene secuencia parcial Longitud 1500 Identificaci n 98 AIMP1 Thiobacillus neapolitanus DSM 581 gen 16S ribosomal RNA secuencia parcial Longitud 1456 Identificaci n 98 AUAM1 Acinetobacter sp ANT9054 gen 16S ribosomal RNA secuencia parcial Longitud 1486 Identificaci n 91 AR3 Thiobacillus neapolitanus DSM 581 gen16S ribosomal RNA secuencia parcial Longitud 1456 Identifica 1205 1211 99 De acuerdo con lo anterior se hace evidente la presencia de dos cepas iguales Thiobacillus neapolitanus y una cepas diferente Acinetobacter sp la cual requiere su confirmaci n debido al porcentaje de similitud tan bajo Por otro lado en un cuarto reactor alimentado con medio mineral tiosulfato y metanol se analiz tanto qu micamente como molecularmente el comportamiento del consorcio sulfoxidante y se compar con la huella gen mica de los aislados mediante DGGE ver fig 1y 2 Encontr ndose un patr n de tres bandas A B y C que corresponden a una comunidad muy pobre integrada por tres microorganismos La banda predominante B en cada una de las muestras obtenidas corresponde a la de los aislados Cabe se alar que el patr n de bandas de los aislados muestra m s de una banda lo cual requiere ser investigado con m s detalle puesto que se trata de cepas pura Fig 1 Comportamiento del consorcio bacteriano sulfoxidante en un reactor de cultivo continuo alimentado con metanol Fig 2 Huella gen mica de aislados y comportamiento del consorcio bacteriano en presencia de metanol Al analizar el DGGE obtenido al correr los productos de PCR de la regi n V6 V8 tanto de los aislados como de las muestras tomadas del cuarto reactor se observa que la poblaci n predominante en cada una de las muestras obtenidas corresponde a los aislados y a la cepa control Thiobacillus ssp CONCLUSIONES A pesar de las peque as diferencias en composici n de cidos grasos caracter sticas morfol gicas y fisiol gicas observadas entre los aislados los an lisis moleculares manifestaron diferencias ya que al analizar la secuencia del gen 16S rRNA de cada uno de los aislados as como su comparaci n con el GeneBank indic que Las cepas AIMP1 y AR3 corresponden a un mismo microorganismo Thiobacillus napolitanus Thiobacillus sp Formamida urea 44 52 AUAM AR3 T0 T1 T2 T4 T5 T6 T8 T9 AIMP A C B Comportamiento del reactor de cultivo continuo sulfoxidante en presencia de metanol 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 020406080100120 Tiempo en d as Concentraci n de prote na g ml 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 1 2 Concentraci n de metanol g ml prote na metanol T9T8 T6 T5 T4 T2 T1 T0 Comportamiento del reactor de cultivo continuo sulfoxidante en presencia de metanol 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 020406080100120 Tiempo en d as Concentraci n de prote na g ml 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 1 2 Concentraci n de metanol g ml prote na metanol T9T8 T6 T5 T4 T2 T1 T0 DSM 581 98 y 99 de semejanza respectivamente Cepa de referencia Thiobacillus sp UAM I La cepa AUAM1 corresponde a Acinetobacter sp ANT9054 95 semejanza se requiere confirmar En cuanto al analizar el DGGE obtenido tanto de los aislados como de las muestras tomadas del cuarto reactor se observa que la poblaci n predominante en cada una de las muestras obtenidas corresponde a la de los aislados y a la cepa de referencia Thiobacillus ssp y que las tres bandas corresponden a una comunidad muy pobre integrada por tres poblaciones diferentes BIBLIOGRAF A 1 Jorgensen B B Ecology of bacteria of the sulfur cycle with special referente to anoxic oxic interface enviroments Phil Tans R Soc Lond B 298 1982 pp 543 561 2 Van den Ende F P Meier J y Van Gemerden H Syntrophic growth of sulfate reducing bacteria and colorless sulfur during oxygen limitation Fems Microbiol Eco 23 1997 pp 65 80 3 Sonne Hansen J and Ahring B K Thermodesulfobacterium hveragerdense sp Nov and Icelandic hot spring System Appl Microbiol 22 1999 pp 559 564 4 Knoblauch C Sahm K and Jorgensen B B Psychrophilic sulfate reducing bacteria isolate from permanently cold Arctic marine sediments description of Desulfofrigrus oceanense ge