T细胞培养.doc

主要有 分离淋巴细胞、补液、装袋、分袋、收获等步骤。细胞培养日程如下：第一天 分离淋巴细胞第四天 补液50ml第五天 补液140ml第六天 装袋第十天 第一次分袋第十四天 第一次收获 第二次分袋第二十天 第二次收获 第三次分袋第二十六天 第三次收获 1 分离淋巴细胞以100ml外周血为例，如血量不同，可按此操作规程做相应调整。 患者100ml外周血，室温1200rpm离心10分钟（刹车ON）。将上层血浆转入离心管-40保存。 用生理盐水1：1稀释血细胞沉淀(生理盐水：原全血体积=1：1)，用移液管吹打混匀后小心加到用50ml离心管分装的15ml Ficoll层上，使分层保持清晰，每管约35ml。室温2000rpm离心20分钟（刹车OFF）。 尽量吸尽两液面交接处的细胞层，均分到3个干净的50ml离心管中，用RPMI-1640液补充至50ml混匀，室温1600rpm离心10分钟（刹车ON）。 倾去上清，将各离心管细胞沉淀振荡开后用10mlRPMI-1640悬浮合并为一管，混匀后取10l与Turk工作液（1:10）混合，避光反应15min后再加10l胎盘兰10倍稀释计数。剩余液体再加RPMI-1640至50ml，室温1200rpm离心10分钟（刹车ON）。 倾去上清，将细胞沉淀振荡后加RPMI-1640培养液50ml重悬，室温1000rpm离心10分钟（刹车ON）。 弃上清，振开管底细胞沉淀后用细胞培养基 50ml重悬细胞。取一新的细胞培养瓶，用移液管吸干瓶中的缓冲液。将细胞加到培养瓶中，同时加入800gSM蛋白。将内有细胞悬液的培养瓶放入CO2培养箱，拧松瓶盖，查看培养箱状态，确保正常。温度：37 0.5、湿度：大于90、CO2浓度：7.50.5 计算细胞密度及细胞数量细胞浓度(个/ml)=N/4稀释总倍数104细胞数量(个)= 细胞浓度(个/ml) 细胞悬液总体积(ml)起始培养细胞数量应控制在2-3107以上。2 细胞补液(1) 将细胞培养基放至室温，与50毫升离心管（架）培养平板5ml移液管细胞培养瓶表面消毒后一并放入安全柜。(2) 核对培养瓶上标记，添加当前操作简称及日期。(3) 标记检菌平皿（编号姓名操作简称日期）。(4) 依次拧下培养瓶、50ml离心管、细胞培养基瓶盖。在50ml离心管倾入50ml或相应体积细胞培养基，倒入培养瓶。依次盖上培养瓶盖，细胞培养基瓶盖和50ml离心管，轻摇培养瓶使培养基混匀。(5) 用5ml移液管按300l/皿吸取细胞悬液加入相应检菌平皿。(6) 将细胞培养瓶和选择性培养平皿从安全柜取出，其中培养瓶放入二氧化碳培养箱，拧松瓶盖，并小心将培养瓶放平。查看培养箱状态。(7) 将加好样品的血琼脂平板正置（盖子在上，包被选择性培养基的玻璃皿在下）放入35恒温霉菌培养箱，记录放入时间及培养物品。隔夜后倒置，保留48小时。3 细胞装袋（1）拧紧瓶盖从CO2培养箱内取出细胞培养瓶，与其它所需材料一并表面消毒后，移入生物安全柜，静置5分钟。（2）拍打瓶壁使细胞尽量从瓶底脱落。（3）用移液管吸取少量细胞悬液放入计数管中（500lEP管），再从中吸取10ul悬液放入一个新的计数管，加入20ul EDTA缓冲液反应2min，然后加入10ul胎盘蓝染色计数细胞，稀释总倍数为4倍。（4）数量合格后进行后续处理，培养瓶内细胞处于0.9-1.4106cells/ml时最适宜进行装袋操作，如数量过低应将培养瓶放回培养箱，延迟后续操作。（5）打开培养袋包装，做好标记，注明病人姓名、CD8+T细胞编号、操作项目名称、日期等。然后撕开细胞培养袋细管子管口的封套并与已拔出内芯的60ml注射器头连接好，再将瓶中的细胞悬液也通过注射器全部倒入培养袋中，并加细胞培养基750ml，用封管器封闭管口。（6）在可插针头的管子顶端的培养袋取样口用5ml注射器抽取约0.5ml含细胞培养基加至血平板上检菌，做好标记，注明病人姓名、细胞编号、操作项目名称、日期等。（7）将培养袋放入细胞培养箱，并观察培养箱运行状态，确认正常。4 细胞分袋 从4冰箱取出一只细胞培养袋，表面酒精消毒后，移入生物安全柜，打开包装，做好标记，注明病人姓名、细胞编号、操作项目名称、日期等。 撕开细胞培养袋细管子管口的封套并与已拔除内芯的60ml注射器头连接好，将用1000ml细胞培养基全部通过注射器倒入袋中，用热合封管机相隔1厘米连封两道将管封死。 用无菌接合器连接装有细胞的原细胞培养袋1和新装培养基的细胞培养袋2的细管子，将细胞培养袋1挂在铁架台上，利用重力将两袋中的液体都集中到细胞培养袋2中，混匀。 将空的细胞培养袋1放到天平上，将细胞培养袋2挂在铁架台上，将细胞悬液平均分到两袋中，即当天平显示细胞培养袋1重量约为1000g时将连接在一起的细管子从中间接口处用止血钳夹住，用封管器在血钳夹左右各封2段，从中间两个封管处将跨越细管子接口处的那段剪下。两个细胞培养袋一分为二。 在细胞培养袋1管子前端的取样口用5ml注射器抽取约0.5ml检菌，做好标记，注明病人姓名、CD8+T细胞编号、操作项目名称、日期等。 将两个培养袋放入细胞培养箱，并观察培养箱运行状态，确保正常。 将加好样品的血平板放入37度恒温检菌培养箱内，48小时后观察结果。5 细胞收获(1) 检查所要收获的细胞培养袋标记是否与培养回输计划相符。(2) 如新开250ml离心管外包装，则需将每个离心管瓶盖隔外包装拧紧。撕开外包装，取四个250ml离心管插入离心管架。(3) 将此项操作所用材料：细胞培养袋四个250毫升离心管（架），表面消毒后移入安全柜。(4) 调整安全柜挂钩位置，使至少四个挂钩处于便于操作的位置，其中安全柜左1/3三个，用于培养袋和止血钳，右1/3一个，用于悬挂剪刀。仔细用酒精湿巾擦拭剪刀刃部，并挂至最右侧挂钩上。(5) 将培养袋上最粗的管子竖直提起，使管子下部离开液面，处于空气中，轻弹粗管根部，使管内液体流回培养袋，至少在远端留出3厘米空段，用止血钳将此段夹死。将培养袋的两个挂孔和止血钳一起挂至安全柜左1/3的三个挂钩上。调整止血钳方向使空段处于易于消毒的位置。(6) 反复挤揉培养袋，使其中的细胞尽量悬浮混匀。(7) 用左手抓住粗管空段末端，右手用酒精湿巾仔细擦拭位于止血钳远端的粗管子空段，待酒精挥发。此时可对250ml离心管进行标记（患者编号），以防混淆。(8) 待粗管子和剪刀表面酒精挥发后，拧下离心管瓶盖，将其放至安全柜右侧洁净区，使此后的操作尽量不会经过瓶盖上方。离心管刻度朝向操作者，便于观察。再次混悬细胞。左手抓住粗管末端，右手小心取下剪刀，切勿接触刃部，剪掉粗管子止血钳夹持远端部分，使细胞培养袋内的液体可以被止血钳控制而不能流出。将剪刀小心放回原位。(9) 右手取下并把持止血钳，左手固定靠近止血钳近端粗管，打开止血钳，并同时控制管口方向和液体流速，将细胞悬液尽可能均分至4个离心管中。操作中粗管末端应处于离心管口正上方。(10) 待细胞悬液全部流出，用止血钳夹死粗管末端，并将止血钳挂回。(11) 调整各离心管液量，使其目视配平，盖好管盖，拧紧。(12) 用热合封管机将粗管末端封死，将培养袋折叠后放入柜内垃圾袋。(13) 将离心管架移出安全柜，将配平的两管放置转头对侧。1500rpm离心8分钟。(14) 将生理盐水（250ml和100ml）白蛋白25ml移液管5ml移液管表面消毒后一并移入安全柜。(15) 先在操作面上铺一张酒精湿巾，打开生理盐水铝制封口，将取下的铝制封口均放至其上。用酒精湿巾擦拭瓶盖，清除碎屑。(16) 打开白蛋白生理盐水瓶盖。(17) 用5ml移液管吸取白蛋白6.3ml（20），1.3加入250ml生理盐水中，5ml加入100ml生理盐水中。如白蛋白浓度为25，则吸取5.5ml，1ml加入250ml生理盐水，4.5ml加入100ml生理盐水，配制洗液与悬液。(18) 将离心管（架）表面消毒后移入安全柜，检查细胞沉淀，小心倾去上清，盖上管盖，用振荡器依次振开悬浮细胞沉淀。(19) 如同时收获同一患者的多袋细胞，则按以上操作重复。(20) 用25ml移液管向管加入洗液25ml，将细胞沉淀吹打混匀，用移液管转入管中，重复上述洗涤管三次；按上述步骤处理管和管。最终所有洗液合并入，每管75ml。此过程共用洗液约150ml。(21) 将管移出安全柜，室温2000rpm离心5分钟。(22) 离心管（架）表面消毒后再次移入安全柜，检查细胞沉淀，倾去上清，振荡悬浮细胞沉淀。(23) 向管加入洗液25ml，吹打混匀后将其加入管中，重复洗四次，共用洗液100ml。(24) 将管移出安全柜，室温2000rpm离心5分钟。(25) 在离心时，进行如下操作：撕去细胞转输袋外包装，将标有患者信息的标签贴好，与60ml注射器细胞筛网冻存管500l EP管检菌平皿表面消毒后放入安全柜。用止血钳夹持细胞转输袋长管，将其挂至安全柜挂钩，用酒精湿巾消毒止血钳远端部分。消毒剪刀刃部，挂至挂钩。标记检菌平皿冻存管EP管。隔外包装调整细胞筛网握持部分位置，使之在撕开外包装后可直接夹持。(26) 将离心管（架）表面消毒后移入柜中，倾去上清，振荡悬浮细胞沉淀，向管加入已配好的悬液25ml，吹打重悬细胞。每次25ml，分三次将细胞悬液全部加入管。充分吹打混匀后，用25ml移液管吸取2ml悬液样本，其中1ml转入冻存管，用于内毒素检测；在每个平皿加34滴用于检菌；剩余约0.2ml加于0.5ml EP管用于细胞计数。(27) 用剪刀在转移袋止血钳夹持远端剪断，与已拔除内芯的60ml注射器连接，用镊子在注射器开口端放置细胞筛网，然后将管中细胞悬液全部通过注射器倒入袋中，待细胞悬液全部流入细胞转输袋后，用止血钳在靠近袋端约3厘米的地方夹住，再用热合封管器在这3厘米间相隔1厘米的位置连封两道，在靠近止血钳的封口将插有注射器的那段管子剪下。松开止血钳，弃去注射器和细胞筛网，再次核对转移袋上标签与患者信息。此时细胞转输袋内所装约100ml细胞白蛋白悬液即为培养最终产品，用于患者回输。(28) 将柜内所有废弃物均装入柜内垃圾袋，并取出所有实验样品。(29) 将沙保罗选择培养皿和血琼脂培养皿正置（盖子在上，包被选择性培养基一侧在下。）放入35恒温霉菌培养箱内。隔夜后倒置，观察7天。细胞计数*：先将50l EDTA，10l细胞悬液混匀，作用2分钟，补40l C.S.（Counting Solution），此时稀释10倍。若最终为100倍稀释，则取80l C.S.，10l 10倍稀释细胞悬液，10l胎