HSP70反义寡脱氧核苷酸增强宫颈癌和卵巢癌细胞的热敏感性.doc

HSP70反义寡脱氧核苷酸增强宫颈癌和卵巢癌细胞的热敏感性中华肿瘤杂志 2000年第2期第22卷 基础研究作者：赵霞魏于全单位：赵霞（华西医科大学附属第二医院妇产科，成都，610041）；魏于全（华西医科大学附属第一医院肿瘤生物治疗中心肿瘤防治中心）关键词： 宫颈肿瘤；卵巢肿瘤；反义寡脱氧核苷酸；热敏感性【摘要】目的观察HSP70反义寡脱氧核苷酸对宫颈癌细胞和卵巢癌细胞热敏感性的影响。方法计数集落形成率，了解宫颈癌细胞和卵巢癌细胞的热敏感性。用光镜、琼脂糖凝胶电泳及流式细胞术观察凋亡细胞。结果经HSP70反义寡脱氧核苷酸预先处理的细胞增强了对热处理的敏感性，热敏感性的增加与HSP70反义寡脱氧核苷酸的处理剂量相关。用形态学、琼脂糖凝胶电泳及流式细胞术均证实经HSP70反义寡脱氧核苷酸及热处理的细胞发生了凋亡。凋亡的发生率与HSP70反义寡脱氧核苷酸的处理剂量相关。结论HSP70反义寡脱氧核苷酸能增强宫颈癌细胞和卵巢癌细胞的热敏感性，增强这种热敏感性的可能机理是协同诱导细胞凋亡。 Increase in thermosensitivity of cervical cancer and ovarian cancer cells by HSP70 antisense oligodeoxynucleotidesZHAO Xia, WEI Yuquan.（Department of Obstetrics and Gynecology, Second Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China）【Abstract】ObjectiveTo investigate the thermosensitizing effect of HSP70 antisense oligodeoxynucleolides (ODN) on cervical and ovarian cancer cells.MethodsCervical cancer cell line Hela and ovarian cancer cell line MCAS were used to study their sensitivity to heat (42, 1 hr) treatment. Heat-induced changes in cell viability was assessed by colony formation assay and apoptosis by cell morphology, agarose gel electrophoresis and flow cytometry.ResultsThermosensitivity of Hela and MCAS cells pretreated with HSP70 antisense ODN was increased as compared to cells treated with heat alone. The increase was antisense dose dependent. Although heat treatment or antisense ODN did induce apoptosis of HeLa and MCAS cells, the percentage of apoptotic cells was significantly increased when both heat and antisense ODN were applied. The effect was dependent on the dose of HSP70 antisense ODN.ConclusionThe thermosensitivity of ovarian cancer cells and cervial cancer cells can be increased by HSP70 antisense oligomer. Apoptosis may be involved in the increase in thermosensitivity.【Subject words】Cervical neoplasms;Ovarian neoplasms;Antisense oligodeoxynucleotides;Thermosensitivity温热疗法已用于许多恶性肿瘤的临床治疗，取得了较好疗效，尤其是对局部肿瘤的控制1。如何进一步提高温热治疗的效果，即提高肿瘤细胞对热的敏感性，仍是目前研究的重要课题。我们通过用HSP70反义寡脱氧核苷酸阻断宫颈癌细胞和卵巢癌细胞HSP70基因表达，抑制HSP70蛋白的合成，以增强恶性肿瘤细胞对温热治疗的敏感性。材料与方法1.合成和纯化HSP70寡脱氧核苷酸：抗核酸酶的硫修饰的反义寡脱氧核苷酸用381 DNA自动合成仪合成，用高压液相色谱及反相色谱纯化。HSP70特异的反义寡脱氧核苷酸链(5-CGCGGCTTTGG-CCAT-3)与人类HSP-70 mRNA的起始密码子及其下游4个密码子是互补的2，相应的正义寡脱氧核苷酸(5-ATGGCCAAAGCCTCG-3)和无义寡脱氧核苷酸(5-CGGGTATGCTTCGCC-3)作为对照。2.肿瘤细胞株：卵巢粘液性囊腺癌细胞株(MCAS细胞株)、宫颈癌细胞株(HeLa细胞株)从日本癌学会细胞库获得。用含有10%小牛血清的RPMI 1640培养基培养。3.细胞的处理：呈指数生长的细胞1106/ml，用不同浓度HSP70反义寡脱氧核苷酸处理24 h后，放入42热水中水浴1 h，更换新鲜培养液后再继续培养24 h，收集细胞进行凋亡检测。4.凋亡观察的方法：(1)琼脂糖凝胶电泳：3106个细胞加入0.5 ml溶解缓冲液(5 mmol/L Tris-HCl，pH 8，0.25% Nonidet P-40和1 mmol/L EDTA)，然后加RNA酶至终浓度为300 g/ml。取20 l样品缓冲液置于1.5%琼脂糖电泳，50 V，3 h。DNA用溴化乙啶染色3。(2)流式细胞术：用流式细胞仪测定凋亡细胞百分率。收集的被检细胞(1106)离心弃上清液后加入1 ml的荧光染色低渗缓冲液(在0.1%枸盐酸钠缓冲液中加入PI 50 g/ml及0.1% Triton X-1003。(3)用Giemsa染色观察凋亡细胞的形态学变化。5.细胞的热敏感性检测：呈指数生长的HeLa或MCAS细胞，1105/ml培养于塑料培养瓶内，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液培养。经530 mol/L的HSP-70反义寡脱氧核苷酸分别处理24 h后，把瓶子插入预先加温至42的热水中，水浴1 h，然后取出热水浴，更换新鲜培养液(未含HSP-70反义寡脱氧核酸)，把细胞置于37 5% CO2孵箱中培养10 d，5 d时更换1/2的培养液。集落细胞用Giemsa染色，计数50个细胞以上的集落数。同时设正义寡脱氧核苷酸+热处理组、单独反义和正义寡脱氧核苷酸组，以及单独热处理组为对照，每组的实验均用双瓶培养。结果1.HSP70反义寡脱氧核苷酸增强HeLa和MCAS细胞的热敏感性：经530 mol/L HSP70反义寡脱氧核苷酸预先处理24 h后再予热处理，HeLa细胞显示出热敏感性的增加，细胞的集落形成百分率明显少于单独热处理或单用HSP70反义寡脱氧核苷酸处理组(P0.01) 。用反义寡核苷酸(15 mol/L)+热处理组细胞的集落形成率为(10.43.6)%，单用反义寡核苷酸、单独热处理和热+正义寡核苷酸处理组的集落形成率分别为(41.46.2)%、(78.18.3)%和(80.27.6)%，与反义寡核苷酸+热处理相比，差异有显著性（P0.01)。单用正义寡苷酸处理组与未处理对照组对细胞的集落形成无明显抑制现象。此外，这种热敏感性的增加与所用HSP70反义寡核苷酸的剂量有依存性。例如：使用5 mol/L和10 mol/L反义寡核苷酸+热处理组的集落形成率分别为(53.24.5)%和(24.13.7)%。2.HSP70反义寡脱氧核苷酸与热协同诱导凋亡：流式细胞仪可以定量测定亚G1期细胞(凋亡细胞)。用流式定量检测方法，我们测定了预先用HSP70反义寡脱氧核苷酸530 mol/L处理24 h后给予热处理的HeLa细胞，检测到明显的凋亡细胞。单独热处理或单用HSP70反义寡脱氧核苷酸处理组也出现了凋亡细胞，但数量明显少于两者共同处理组(P0.01)。用热和反义寡核苷酸(15 mol/L）处理，诱导的细胞凋亡率为(58.76.4)%，单独热处理、单用反义寡核苷酸（15 mol/L）和热+正义寡核苷酸（15 mol/L）处理，诱导的细胞凋亡率分别为(13.52.8)%、(26.44.3)%、(13.03.2)%，与用热和反义寡核苷酸处理组相比，差异有显著性 (P0.01)。正义寡核苷酸处理组和未处理对照组则未见明显的凋亡细胞。此外，这种凋亡的诱导效应与所用HSP70反义寡核苷酸的剂量有依存性。例如：使用5 mol/L和10 mol/L反义寡核苷酸+热处理组的凋亡率分别为(20.43.8)%和(38.04.2)%。HSP70反义寡脱氧核苷酸+热处理的HeLa细胞和MCAS细胞，用Giemsa染色后，在光镜下均可见细胞体积缩小，染色质浓缩及凋亡小体形成等。单独用热处理或反义寡脱氧核苷酸处理的细胞也可见到上述形态学的改变，但数量明显减少。此外，在琼脂糖凝胶电泳图上，经HSP70反义寡脱氧核苷酸+热处理、单独热处理及单用HSP70反义寡脱氧核苷酸处理的细胞，均显示出凋亡发生的特征性DNA阶梯状改变(DNA ladder)，而用正义或无义寡脱氧核苷酸处理的细胞则无上述凋亡发生的改变。讨论当细胞受到热刺激(如42，1 h)或其他刺激时，发生的应激反应表现为合成一种特异的高度保守的蛋白质，即热休克蛋白或称应急蛋白(Stress protein)4。在热休克蛋白家族中，HSP 70被认为是保护哺乳类动物细胞免受损害的最重要的应急蛋白。近年的研究表明，HSP 70作为蛋白成熟过程中的分子伴侣，参与蛋白质合成、加工、折叠、转运等过程。肿瘤细胞特别是恶性肿瘤细胞常常高表达HSP 70，并与人类恶性肿瘤进展有关4-8。我们以往的研究3已证实，HSP70的表达与癌细胞的增殖、存活有密切关系。本研究用HSP70反义寡脱氧核苷酸预先处理宫颈癌细胞和卵巢癌细胞后再行热处理，结果发现：(1)细胞经HSP 70反义寡脱氧核苷酸预先处理后，增加了对热处理的敏感性，这种热敏感性的增加与HSP 70反义寡脱氧核苷酸的处理剂量相关；(2)用Giemsa染色可见被处理细胞有凋亡的形态学改变，核固缩、核致密及核小体形成；(3)琼脂糖凝胶电泳显示出凋亡细胞的DNA片段形成的阶梯状改变；(4)用流式细胞仪定量检测凋亡细胞，发现HSP70反义寡脱氧核苷酸与热处理对宫颈癌细胞凋亡的诱导有协同效应，这可能与寡脱氧核苷酸抑制了HSP70的表达，降低了癌细胞对热损伤的修复功能有关。HSP70反义寡脱氧核苷酸与热处理对卵巢癌细胞株(MCAS)也可协同增加其热敏感性以及诱导凋亡，其结果与宫颈癌细胞株类似。结果提示，HSP70反义寡脱氧核苷酸能增强宫颈癌和卵巢癌细胞对热处理的敏感性，这种热敏性的增加可能与两者协同诱导癌细胞的凋亡有关。本研究为临床探索提高加热治疗的疗效提供了可参考的基础资料。基金项目：国家杰出青年科研基金(39725031)、国家自然科学基金(39680030及39740006)及四川省卫生厅科研基金资助项目参考文献：1李瑞英，林世寅.肿瘤热疗的临床.见：林世寅，李瑞英主编.现代肿瘤热疗学.第1版.北京：学苑出版社出版，1997.241-244.2Hunt C, Morimoto RI. Conserved features of eukaryotic hsp70 genes revealed by comparison with the nucleotide sequence of human hsp70. Proc Natl Acad Sci USA, 1985,82：6455-6458.3Yu-quan Wei, Xia Zhao, Yoshitaka Kariya, et al. Inductiion of apoptosis by quercetin: involvement of heat shock protein. Cancer Res, 1994,54：4952-4957.4Crper SW, Duffy JJ, Gerner EW. Heat Shock proteins in thermotolerance and other cellular processes. Cancer Res, 1987,47：5249-5253.5Gething MJ, Sambreak J. Protein folding in the cell. Nature, 1992,355：33-34.6Welch WJ. Mammalian stress response: cell physiology, structure/function of stress proteins, and implication for medicine and disease. Physiol