大鼠支气管扩张症模型研制.doc

大鼠支气管扩张症模型研制zvlfO.20,0妇一6第20卷第2期2000年6月上海实验动物科学ShahaiLrmoAnimMScienceVo1.20.No.2June,2000?实验动物与动物实验?大鼠支气管扩张症模型研制乏塾.,:建军.,朱云华zR砍,22.R-33z(1.南京大学医学院附属鼓楼医院,南京210008;2.江苏省中医院,南京210029)摘要:为了建立支气管扩张症(简称”支扩”)动物摸型,应用大鼠叶支气管结扎并向支气管内注射绿脓杆菌和支气管内直接注射蹲脓杆菌两种方法.结果两种方法建立的支扩动物摸型在支气管组织病理学特征,支气管分泌物排泌量,支气管冲洗液绰脓杆菌含量等方面与人的相应病变基本一致.关键词:圭重堡垂;垫堑鉴型;丝童中图分类号;Q9533文献标识码:A文章编号:1004-8448(20O0)02006504尽管抗生素治疗支气管扩张症(简称”支扩”)能使交扩的发病率得到控制,但仍不能缩短支扩的疗程.StockleyC报道I=1服大剂量羟氨苄青毒素至少也要4至6千月疗程,且仅能延缓复发.因此,建立支扩动物模型来解决这一问题是必要的.Lapae报道应用大鼠叶支气管结扎并向支气管内注射绿脓杆菌以建立支扩动物模型.本文作者沿用这一方法,并进一步采用支气管内直接注射绿脓杆菌的方法,同样也建立了大鼠支扩模型.现将结果报告如下.1材料和方法1.1实验材料体重200g左右,4月龄左右的SD大鼠(SPF)6O只,由南京医科大学实验动物中心提供随机将其分为4组.叶支气管结扎并向支气管内注射绿脓杆菌模型组(A)15只(各8只,旱7收稿日期:19990807基金项目;国家自然科学基金(39830460)作者简升:万毅刚(1968一).男,南京人.硕士,主治医师,中西医结台临床专业.目);支气管内直接注射绿脓杆菌模型组(B)15只,(07只,旱8只);假手术对照组(c)l5只(8只,旱7只);空白对照组(D)15只(&只,早7只).对于造模过程中固手术等非感染因素死亡者给予补充1.2绿脓杆菌液从临床支扩病人的痰中分离出绿脓杆菌,将其接种到培养基上,在37温育箱中培养24b,用生理盐水j申洗数千典型菌落,按比浊法调整其浓度为1O”cFu/L.1.3开放式喷射呼吸机江西第五机床厂医疗器械分厂制造KR一型开放式喷射呼吸机.高压氧气源压力0.05Mpa.选用F16号气管导管控制潮气量在lO至15ml.通气频率范围6O士5次/rain,呼吸时比约为l:l该机工作参数可根据大鼠个体差异而改变.1.4标准酚红溶液用分析天平准确称取lmg酚红,加5%碳酸氢钠溶液溶解配成lOOmg/L溶液,再倍比稀释为0.1,0.3,0.5,0.7,l3510mg/L的标准一65溶液,用7550G型紫外分光光度计(波长546nm)测其OD值,绘制标准酚红曲线.1.5实验方法1.5.1A组造摸方法以2戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉.仰卧位固定,常规消毒后,选择颈部距唇下3cm处,做纵向lcm切口,暴露颈部肌群,纵向分离出气管;选择环状软骨下较宽的气管软骨间隙做2mm横向切口.以备气管插管常规诮毒后,于胸骨柄下缘2cm处,自胸骨向右外做2cm切口,分离皮肤并横向切断两层胸肌,右侧迷走神经为标志,确认右侧第2肋间隙.选择6号静脉针导管为气管插管,将插管伸至胸骨角下端1.5cm处,即为左侧主支气管分叉处.(插管深度不可过浅或过深,过浅则使高压氧气源分流,影响右侧肺叶通气,过深则使左侧肺叶气道压力不均,造成局部肺破裂.)根据大鼠麻醉后呼吸频率,猢气量调整人工呼吸机工作参数,为开胸做准备.自胸骨向右外做lcm切口,分离肋问肌暴露胸腔,立即连接人工呼吸机进行辅助呼吸.用自制钝头眼科镊寻找顶叶,并顺切口方向及呼吸频率,缓慢将其挟出胸腔.先用粗双股羊肠线结扎部分顶叶,以便横向牵拉,暴露顶叶根部而发现右主支气管.(结扎肺叶的目的是将顶叶充分暴露于胸腔外,若时问过长则使顶叶瘀血而坏死.)发现右主支气管后,尽快分离顶叶肺门血管,暴露顶叶支气管井结扎根部,及时剪断顶叶结扎线继续向左上提拉顶叶支气管,并以微量进样器穿刺支气管根部,注射0.02ml苗液和lml空气,待顶叶膨胀后,剪断顶叶支气管结扎线,用脱脂棉签将顶叶送回胸腔,并吸取腔渗液纵向缝合肋间肌及外层肌群,关闭切口待大鼠恢复自主呼吸再撤离呼吸机纵向缝台气管切口,横向缝合颈部肌群及皮肤.每只大鼠每天以青霉素G1万u腹腔注射,连续3d,防止伤口感染;每只大鼠每天以50葡萄糖液10ml灌胃,连续3d.1.5.2B组造模方法气管插管准备步骤同A组.将自制气管插管缓慢伸至胸骨角下约3cm处,出现抵触感,即是右侧肺底叶.微量进样器从插管中快速注入O.02m菌液和lml一66一气体,迅速拨出插管并竖起固定板,保持大鼠垂直体位,以缓解呼吸障碍.待大鼠呼吸平稳后,纵向缝合气管切口,横向两层缝台颈部肌群及皮肤.青霉素,50葡萄糖使用同A组.1.5.3C组处理方法手术方法同A组,但不注射绿脓杆菌液.1.5.4D组处理方法不做任何处理,喂养14d备用.1.6观察项目和方法1.6.1呼吸道分泌物排泌量(气管羟酚红)选取造模成功后存活14d的4组大鼠各8只.每200g大鼠腹腔注射酚红溶液20mg.半小时后大鼠小便已呈酚红色,此时,准时处死大鼠.分离气管周围组织,剪下自甲状软骨至气管分叉处的一段约2cm气管,放入盛有2ml生理盐水的试管中,再分别加lmol/L氢氧化钠0.1ml,用7550G型紫外分光光度计(波长546rim)测OD值.根据酚红标准曲线计算酚红含量.1.6.2呼吸道冲洗液细菌含量选取造模成功后存活14d的4组大鼠各5只处死后暴露气管,结扎甲状软骨端.再用7号针头自甲状软骨向气管内注射蒸馏水5m|,反复冲洗3次.尽可能抽回冲洗液lml做细菌培养.计算lo冲洗液绿脓杆菌苗落计数.1.6.3组织病理学检查在以上处死的大鼠中各取2只.剥离气管,支气管,肺,做组织病理学检查.自甲状软骨端至气管分叉处剪下气管,沿气管后壁纵向剪开气管和左右主支气管.自顶,底叶支气管剪下顶,底叶,用6号静脉针导管,分别插入叶支气管,充气膨胀后,放入10甲醛溶液中,固定72h.再经乙醇脱水,浸醋,包埋等处理.从各顶,底叶的不同部位(肺门,肺实质,肺膜)切取5m三层薄片.经HE,Masson染色,室温保存备用.1.6.4统计方法计量资料多样本均数比较在方差齐性检验基础上,应用单因素方差分析F检验,各组组间比较应用q检验.2结果2.1呼吸道分泌物排泌量见表1表14组大鼠气管酚红排泌量注:4组气管酚红排泌量经方差齐性检验得知方差齐同,且p<0.01I与A组比较.p<0.01,即A,C两组,A,D两组的气管酚红排泌量的差别有非常显着性.与B组比较,p<001,即B.C两组,B.D两组的气管酚红排泌量的差别有非常显着性.2.2呼吸道冲洗液绿脓杆菌含量见表2表24组大鼠呼吸道冲洗液绿脓杆菌含量注:4组呼吸道冲洗藏细菌含量经方差齐性检验得知方差齐同.且P<0.01I与A组比较.p<0.001,P<O.001即A,c两组,A,D两组的呼吸遭冲洗涟绿脓杆菌含量的差别有非常显着性.与B组比较,P<0.001,尸<0.001,即B,c两组,B,D两组的呼吸道冲洗藏绿脓杆菌含量的差别有非常显着性.2.3组织病理学特征2.3.1正常大鼠(D组)组织学特征肉眼观:支气管树结构完整,清晰各级气管,支气管管腔通畅,未见异常分泌物,管壁光滑,未见粘膜溃疡及软骨钙化.肺组织柔软,肺膜光整,沉降试验阴性.光镜:各级支气管管壁结构完整.粘膜,粘膜下层层次分明.管腔顺支气管树逐渐变细,未见分泌及渗出物.支气管,细支气管被复层次不等的柱状纤毛上皮细胞.大气遭粘膜下层由软骨,平滑肌及纤维组织构成,小支气管至细支气管未见腺体及软骨,但有完整的平滑肌包绕和琉松的结缔组织.支气管周围肺泡结构清晰,泡腔内透明.肺泡隔菲薄.无炎性细胞浸润.肺及支气管伴行血管无充血,出血(第93页图1A).?2.3.2造模太鼠(A,B组)组织学特征A,B两组大鼠组织病理特征基本一致.肉眼观:顶,底叶部分支气管呈拄状,囊状,球形扩张,腔内不同程度充满脓性分泌物,甚至完全阻塞管腔,顶,底叶均见斑片状黄色实变,沉降试验阳性.光镜:顶,底叶支气管管壁有不同程度破坏,断裂.支气管被复柱状纤毛上皮细胞增生至6,7层,局部甚至星台体状或出芽状改变,部分坏死,脱落形成溃疡或鳞状化生.管腔与同级支气管比较显着扩张,腔内充满脓细胞及脱落上皮细胞.大量炎性细胞浸润粘膜下层,平滑肌层,支气管周围肺组织,炎细胞以单核细胞,脓细胞,淋巴细胞为主,浸润处形成支气管炎,支气管周围炎,肺炎等斑片状病灶.粘膜下层受扩张管腔压迫而萎缩经Masson染色证实平滑肌萎缩,断裂,为增长纤维组织代替.扩张支气管周围肺组织,部分萎缩或代偿性气肿.肺毛细血管或部分支气管伴行小动,静脉充血,出血.(第93页图1B)3讨论Lapae应用叶支气管结扎并向支气管由注射绿脓杆菌建立大鼠支扩模型,其目的是利用大鼠呼吸道易感细菌造成叶支气管化脓性感染,脓性渗出物阻塞支气管,并受到结扎影响使局部压力增高而引发支扩.这种造模方法突出了支气管感染,阻塞,牵拉等主要病理因素,与人支扩形成过程基本一致.本文在沿用这一方法的过程中发现Lapae的方法在开胸手术路径,人工机械通气参数,叶支气管结扎手段,支气管内注射等重要环节存在诸多问题,即使在手术技巧熟练的前提下,也只能达到50的手术成功率.因此.本文在Lapae模型基础上.改进造模方法,建立支气管内直接注射绿脓杆菌的大鼠支扩模型.尽管本文应用两种不同的造一67模方法,但其结果基本相同,都是由支气管感染,阻塞,牵拉途径形成支扩,而且组织病理学所反映的扩张支气管被复上皮细胞增生,脱落;以脓细胞,单核细胞,淋巴细胞为主的大量炎性细胞浸润;粘膜下层萎缩,平滑肌萎缩,断裂为纤维组织代替t以及扩张支气管周围肺组织的改变等也同Lapae报道一致,并类似于人的支扩的病理特征据报道”,支扩的病原菌是化脓菌和厌氧菌,并以绿脓杆菌检出率最高.因此,本文选择绿脓杆菌作为支扩动物模型的病原菌.Lapae报道的10”CFU儿绿脓杆菌使大鼠形成严重的支气管化脓性感染,并且广泛累及支气管厨围肺组织.由于大鼠缺乏咳嗽反射,目前只能以公认的气管酚红法测定呼吸道分泌物排泌量.造模组酚红排泄量与正常大鼠比较显着增加.这与人支扩因支气管感染而产生的脓痰相似.绿脓杆菌感染使大鼠叶支气管表现出类似人支扩的病理改变,但由于感染程度随时间愈加严重,导致叶支气管完全阻塞,支气管周围组织及肺实质化脓性炎症.大鼠的存活时问仅在30d左右,这同人支扩的某些过程有别.综上所述,大鼠叶支气管结扎并向支气管内注射绿脓杆菌与支气管内直接注射绿脓杆菌的两种支扩模型.在支气管组织病理学特征,支气管分泌物排泌量,支气管冲洗液绿脓杆菌含量等方面与人的支扩病变基本一致.因此,两种模型均可作为该病的研究对象.参考文献:1StockleyRA.Bronchiectasismanagementpro管扩张症痰菌培养和抗生紊治疗的探讨口.安徽医科大学,1997,32(4):404405.EstablishmentofBrOnchiectasisModelinRatWANYi?gang,CAOShihongBIJian?ju.,ZHUYhua.(I.GulouHospitalofNanjingUniversity,Na,ng210008,China;2.TraditioalChineseMedicalHospitalofJia,uProvisimz,Nanjing210029,China)Abstract:Toobservethelawofbronchiectasisandstudytheclinicalpharmacology.sig.nificanceoftheresultofantibioticandChinesetradhionaImedicine.Abronchiectasisanimalmodelwasestablished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