抗氧化剂的测定.docx

抗氧化剂的测定人工合成的抗氧化剂有 ：（1） BHT 2，6-二叔丁基对甲酚（2） BHA 叔丁基对羟基茴醚 （3）PG 没食子酸丙酯 近几年也合成了一些新的抗氧化剂如TBHQ, DBHA等还有一些新的天然抗氧化剂，但投入使用的不多。叔丁基对羟基茴香醚结构特点： 1）对热稳定2）在弱碱性中不破坏（作为焙烤食品用的抗氧化剂）这种抗氧化剂在日本是禁止的 2，6-二叔丁基对甲酚结构特点：（1）抗氧化性强于BHA；（2）毒性大于BHA 这种抗氧化剂在美国是禁止使用的没食子酸丙酯结构特点 ：（1）耐热性强；（2）溶于油脂，酒精等有机溶剂中以上三种人工合成抗氧化剂我国都在使用，抗氧化性最强是混合使用，二种抗氧化剂混合使用效果最好，但要加增效剂，常用的增效剂有柠檬酸，抗败血酸，磷酸等可以提高抗氧化剂的作用。而增效剂主要是络合重金属离子，使氧化性获得新生。我们从以上三种氧化剂结构中可以看出，它们都有苯酚，所以我们要找抗氧化剂必须找酚类衍生物，我们要了解抗氧化剂的机理，它们怎样阻止氧化。抗氧化剂的抗氧化机理。油脂氧化机制 （1）链引发；（2）链传播；（3）终止从RH代替脂肪或者脂肪酸 第一步： RHR*.+H* 第二步：脂肪RH受热或光金属第三步：R*+O2ROO* RO2*+RHROOH+R*第四步 R*+ R*R-R R*+ RO2*RO2R第二步脂肪RH受热或光金属催化剂等分解成不稳定的游离基R和H, 游离基当与空气中的O2时生成过氧化物游离基过氧化物，游离基在于脂肪RH生成氢过氧化物和游离基R，产生的游离基与游离基相互结合，使反应终止，随着反应的进行，更多脂肪分子转变成氢过氧化物，氢过氧化物进一步变化，产生更多的游离基和稳定的终产物，这些就导致了油脂完全的变质的酸败味的形成和种种的反应生成。抗氧剂的机制（以AH代表抗氧剂）AH+ R*RH+A* 抗氧化剂的作用机制是遇到游离基后将游离基破坏，也就是说反映关键是把R*，RO2*作用掉，这样就终止了链传播，延长了酸败。A*+ A*AAA*+ RO2*ROOA抗氧化剂-阻止，延迟脂肪自动氧化作用的物质称为抗氧化剂。抗氧化剂的使用剂量为. 即万分之二增效机剂为抗氧化所加的/-/即.抗氧化剂是油溶性的，所以能引起油脂酸败，植物油比猪油保存的时间长因为植物油或多或少的含有一些抗氧化物质比如生育酚等，而猪油不含有抗氧化剂所以易腐败。一. BHA测定（比色法）1.原理 用石油醚将样品中的BHA提取出来，根据BHA在石油醚和含水乙醇项中分配系数不同，使其溶解72%的乙醇中，BHA与2，6-二氯醌氯亚胺的硼砂溶液生成一系列兰色反应，可比色测定620nm.2.操作方法(1)绘标准曲线 编号 1 2 3 4 5 6BHA标液10g/ml 0. 0.1 0.3 0.5 0.7 0.972%乙醇 分别稀释12ml0.01%2，6-二氯醌氯亚胺 2 2 2 2 2 2硼砂溶液2% 2 2 2 2 2 2静止15分钟比色620nm 绘制标准曲线(2)样品分析称鱼肉2g于50ml量筒加无水乙醇2 ml石油醚（30-60 ） 48ml摇匀静止24小时吸上溶液25ml于125ml分液漏斗中用72%乙醇分四次提取合并于50ml容量瓶加72%乙醇于刻度，若浑浊过滤取2ml于比色管中加72%乙醇12ml加2，6-二氯醌氯亚胺2ml硼砂溶液2ml静止15分钟620nm比色(3)计算 BHA(g/kg)=V*V1*C/W*V2*V3 V-样品定容总体积(ml)V1-将提取液定容(ml)C-相当于标液浓度W-样品的重量（g）V2-取样品总体积(ml)V3-测定时所用提取液的总体积BHA(mg/kg)=C/W *100 C-相当于BHA的标准量(mg)W-相当于样品溶液的重量(g)注意事项：染料2，6-二氯醌氯亚胺溶液见光后易变质，储于棕色瓶中超过6小时经重新配制在冰箱中可保存3天，一般为用时配制。例：腌鱼肉2克定容50 ml取出25ml提取BHA定容50ml,测定时取2ml, 取溶液（相当于5微克）代入上式计算BHA(mg/kg)=V/W * V1-/ V2 C/ V3=50ml/2g *50ml/25ml *5g/2ml=125(mg/kg)二 PG（没食子酸丙酯）没食子酸丙酯（PG）也是常用的一种抗氧化剂，由于其合成工艺简单，原料低廉，广泛用于低档产品中它是由没食子酸和正丙醇酯化而成的白色或微褐色结晶性粉末，本身微苦，熔点145-148，有吸湿性，耐热性强，溶于油脂，酒精等有机溶剂中。动物性油脂中抗氧化能力较强，遇铁离子容易出现呈色反应。1. 比色法原理：PG与2，2，-联吡啶-氯化铁溶液生成橘红色的发色团，所生成的颜色深浅与PG的含量成正比关系，在530 nm下比色。2. 操作步骤 a.制标准曲线取10ml比色管 1 2 3 4 5 6 PG(10g/ml) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5无水乙醇(ml) 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0加水 5.5ml避光出加显色剂 1ml 暗处放1小时 ，530nm处比色b.样品的处理：称样5g于烧瓶中加石油醚50ml振动30分钟取上清夜25 ml于分液漏斗用40 ml水提取三次提取液合并于50 ml容量瓶加水至刻度供测定c.测定： 吸2 ml与比色管加无水乙醇2.5ml加水3.5 ml摇匀暗处加2，2，-联吡啶-氯化铁溶液1ml三氯化铁1ml暗处放1小时530nm比色，同时做空白d.计算：PG(mg/kg)=V1/W *V3/V2 *C/V4 *1000/1000 C-相当于标准PG的浓度（g/ml）V1-样品稀释总体积（ml）V2-取总体积进行提取（ml）V3-提取后定容(ml)V4-比色时提取液体积（ml）三 BHT的测定为了提高油脂的稳定性，防止酸败，延长保质期,近几年来国内已开始在食用油中添加抗氧化剂，由于抗氧化剂BH、PG对热稳定性较差，而BHT的热稳定性较好，能适应精练油的全过程，所以在食用油中添加抗氧化剂BHT。1.比色法原理油脂中的抗氧化剂BHT经水蒸气蒸馏法将BHT从油脂中分离出来，其蒸馏液将BHT从油脂中分离出来，其馏出物经冷凝后溶于甲醇中，遇邻联二茴香胺，亚硝酸钠试剂，生成橙红色物质，用氯仿萃取后的深红色溶液在520nm处比色测E。3. 标准曲线的绘制取6个用黑布扎的60ml分液漏斗,分别吸BHT标准溶液5g/ml 于60ml分液漏斗中加50%甲醇溶液至25ml 加邻联二茴香胺溶液5ml摇匀加0。3%亚硝酸钠2ml摇1分钟放置10分钟加氯仿10ml摇1分钟分层后将下层氯仿放入黑纸包扎的10ml比色管520nm测E绘制标准曲线 3.样品处理将油脂样5g于500ml蒸馏瓶加无水CaCL2 16克水10ml当温度达到165连接好水蒸气装置用50ml甲醇的容量瓶接收（最好是200ml）收集馏液为100ml(共计150 ml)用热甲醇（40-50）分次洗涤冷凝管合并于容量瓶用甲醇定容200ml4. 测定吸馏液25ml于黑布包扎的60ml分液漏斗加邻联二茴香胺溶液5ml摇匀加0.3%亚硝酸钠2ml摇匀1分钟放10分钟加10ml氯仿振摇1分钟分层后将氯仿液放入黑纸包扎的10ml比色管520nm下测E5. 计算BHT(mg/kg)=V/W*C/V1 W-样品重量(g) V-样品定容体积(ml) V1-测定时所用的提取液体积（ml）C-相当于标准浓度(g)6. 注意事项：(1) 控制蒸气后不要太高，以免油滴带出，影响测定结果（2）蒸馏结束后，用热的甲醇淋洗弯管以及冷凝管必须少量多次，以免冲洗不干净，影响结果偏低。（3）加入显色剂后的反应时间以57分钟显色到达最高峰10分钟之内保持恒定，然后逐渐褪色，所以必须静置10分钟，然后立即加氯仿萃取。（4）氯仿萃取后，放于暗处1小时，如果暴露于光线中会很快褪色。（5）所生成的有色物，对光具有敏感性，在暗处内操作最好四 BHA和BHT混合使用时分离与测定方法，分别显色比色法1.原理 用石油醚提取食品中的BHA和BHT。通过硅胶柱使BHA和BHT分离，BHA与2,6-二氯醌氯亚胺-硼砂溶液生成兰色。BHT与2，2，-联吡啶-氯化铁溶液生成橘红色发色团，与标准比色定量。2.试剂 0.01% 2，6-二氯亚胺乙醇液，采用无水乙醇配置存于棕色瓶中，冰箱保存可存三天。硼砂缓冲溶液：取硼砂0.6g氯化钾0.7g, NaOH 0.26g 加无水乙醇至500ml，过滤即可使用。0.2 % ,-联吡啶溶液：称取，-联吡啶0.2g置于烧杯中，加入2ml乙醇，定100ml。02.%FeCL3溶液：24 小时后重新配置。30%乙醇液石油醚 30-60硅胶，柱层析用，不活化。BHA溶液 称BHA 0.050g加少量无水乙醇溶解后转移100ml棕色容量瓶用无水乙醇定容避光保存此液为0.5mg/ml临用时取1ml于50ml容量瓶加无水乙醇定容为10微克/毫升的BHABHT标液：称BHT0.1000g少量无水乙醇溶解后定容100ml（用无水乙醇定容）为1.0mg/ml取1ml定容100ml（用无水乙醇定容）为10微克/毫升3.方法（整个过程要避免光照进行）1)样品处理 取磨碎样10g于带塞三角瓶加石油醚50ml振摇20分钟静止后取上层液25ml通过硅胶柱用石油醚淋洗收集150ml淋洗液作为BHT检验液取出5ml 于蒸发皿中自然挥干用30%乙醇6ml洗涤滤纸滤液于洗液合并于比色管供BHT测定。 无水乙醇淋洗以石油醚淋洗后的硅胶柱，至淋洗液为100ml，供BHT测定。2） 测定: a)BHT 的测定：标准曲线的绘制取6个比色管编号 1 2 3 4 5 6 分别吸BHT标液 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.530%乙醇液 1ml加0.2%2，2-联吡啶 1ml暗室中加2，2-FeCl2 1ml放置60分钟进行比色（波长520nm），绘制标准曲线样品的测定：取上面BHT测定液20ml于比色管加30%乙醇至8ml加0.2% 2，2-联吡啶1ml以下按标准曲线绘制b)BHA的测定标准曲线的绘制，取6个比色管编号，1 2 3 4 5 6吸取BHA标液 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5加无水乙醇 稀释总体积8ml加0.01%2，6-二氯醌氯亚胺 1ml硼砂缓冲溶液 2ml静止20分钟于620nm测定消光值，绘制标准曲线样品的测定：取BHA测定液4ml于比色管用无水乙醇稀释至8ml以下同标准曲线的绘制。4.计算： BHT或BHA(g/kg)=V/W*V2/V1*C/V3*1000/1000C-测定用样液中BHA或BHT的含量(g)V-BHA或BHT混合时的总体积（ml）V1 -BHA或BHT分离时的体积（ml）V2-BHA或BHT分离后的定容体积（ml）V3-BHA或BHT分离后的测定用量 （ml）W-样品重量（g）1000-将g换算成 mg1000-表示单位（将g换成Kg）5.注意事项： 抗氧化剂本身会被氧化，样品随着存放时间的延长含量会下降，所以样品进入实验室应尽快分析，避免结果偏低。抗氧化剂BHT稳定性较差，易受阳光，热的影响，操作时应避光。用柱层分离含油脂多的食品，会受到温度的影响，室温度低，流速缓慢，使分离效果受一些影响，最好温度在20以上进行分离。五 BHA、BHT、PG混合使用时的测定方法目前国内的一些食品厂，近年来，有的将三种或其中的两种，分别用于高油脂的食品中如饼干、巧克力、奶糖、花生米、核桃仁罐头等BHA、BHT、PG混合使用时BHA与 BHT的总量不得超过0.1g/kg，即100mg/kg, 而 PG不得超过50mg/kg。本法是用石油醚将食品中的三种抗氧化剂萃取出来，然后从萃取液中萃取PG，再经硅胶柱层析将BHA,BHT分离。 1.原理：抗氧化剂与福林-酚试剂结合，生成一种兰色络合物，所生成的颜色深浅与抗氧化剂的浓度成正比，可比色定量。2.试剂：a.石油醚30-60;b.10%碳酸钠; c.无水乙醇; d. 硅胶，柱层析用，60目; e.福林-酚试剂：称钼酸钠25g加入85%磷酸50ml，浓盐酸100ml，水700ml，回流加热10小时，然后加入硫酸锂150g，水50ml，溴数滴，煮沸15分钟，最后加水稀释到1000ml,使用时用水稀释三倍; f.抗氧化剂标液：称PG、BHA、BHT各100微克，用80%乙醇溶液溶解后定容100ml(棕色瓶)冰箱中保存即1000微克/毫升。3.操作方法1) BHT的提纯方法：取一层层析柱，按规定装填好，先用石油醚润湿，将上面提纯的PG后分液漏斗内剩余的石油醚层（BHT与BHA的混合液，）全部注入层析柱，用石油醚淋洗，收集150ml淋洗掖作为BHT检查液; 2) BHT的提纯方法：根据层析柱内淋洗液基本流尽，再用无水乙醇淋洗，收集100ml淋洗液，供BHA检验液。3）显色：吸取PG检验液5ml于10 ml比色管中，取BHT与BHA各5 ml分别于蒸发皿中，在暗室中自然风干，然后在PG、BHA、BHT被检液中各加入10%碳酸钠0.5ml混匀后，各加入0.5ml福林-酚试剂，用水稀释到总体积6 ml放2小时后显色，在730nm下测定E.。4)标准曲线的绘制准确吸取不同浓度的抗氧化剂标液于10ml比色管中。10ml比色管 1 2 3 4 5 6标液10g/ml 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.010%碳酸钠 0.5ml水 4ml福林-酚试剂 0.5ml加水 至总体积6ml放两小时比色（730nm测定PG、BHA、BHT的E）,绘制标准曲线。4.计算：根据测的样品的溶液的光密度，从标准曲线上分别查出对应的PG、BHA、BHT含量（微克/毫升）。抗氧化剂