脑缺血模型讲义20090505.doc

线栓法局灶性大鼠脑缺血-再灌模型的制备（The intraluminal thread model of middle cerebral artery occlusion (MCAO)）【实验目的】掌握线栓法制备局灶性大鼠脑缺血-再灌注模型的方法。了解影响模型成功的的某些因素。【实验原理】图1 大鼠局灶性脑缺血-再灌模型示意图建立脑缺血动物模型是开展脑缺血损伤和治疗研究的基础,模型制备的方法较多,线栓法、光敏法、四血管夹闭法等。本实验采用颈内动脉线栓法（the intraluminal thread model of middle cerebral artery occlusion，MCAO）。由于啮齿类动物脑血管的解剖结构与人类相似，大鼠也由二条颈内动脉（ICA），二条椎动脉（VA）提供血运，颅底也有 willis 环的吻合。栓线进入 ICA，前行至前交通动脉，阻塞大脑中动脉起始部及对侧血供。TTC 显示CP与背外侧皮质为典型缺血改变。此模型优点在于：无需开颅，操作简单，动物损伤小。有明确行为学和病理指标，适于进行运动功能和形态学观察研究。梗死灶确切，重复性好，利于进行各种相关性研究。可在无需再次麻醉时拔出栓线进行再灌研究。现已被广泛应用于制备局灶性脑缺血模型。MCAO法的难度较大,模型成功率不高。在模型制作过程中要严格控制动物体重，线栓制备和手术操作过程的标准化。【实验动物】动物：体重 250-300g，SD 雄性大鼠 8-10只。【实验器材】75%酒精、4%水合氯醛（或戊巴比妥钠）、1% 肝素、氯化三苯基四氮唑（triphenylte razoliumchloride ,TTC）、PBS、工业酒精；大鼠板、绑线（线绳）、尼龙鱼线（直径0.28mm）、粗剪刀、手术刀、止血钳、眼科剪、眼科弯镊、外科剪、外科镊，玻璃分针，医用干棉球或纱布块、5ml注射器、酒精灯、石蜡、烧杯、平皿、毛细滴管、剃须刀片、角针、弯盘、自制拉钩、乳胶手套、劳动手套及长皮手套。【实验方法】1.线栓制备：市售单股直径0.28 mm鱼线，准确切取6cm,镜下观断端平齐钝圆后，每2cm做一标记，置75%酒精浸泡10 min，头端蘸取热融的石蜡使其光滑呈球型，置1% 肝素浸泡备用。2.手术操作大鼠腹腔注射4%的水合氯醛（1ml/100g），背位固定后颈部剪毛消毒，取颈正中切口，钝性分离右颈总动脉（CCA），颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）并挂线备用，结扎ECA和CCA，用动脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于CCA上做一切口，从切口插入上述备好的鱼线，线插入ICA后，打开夹闭ICA的动脉夹，轻柔送线接近18mm处（分叉处到大脑中动脉的解剖），有阻力则止，固定栓线，3h后轻拔鱼线，扎紧ICA，缝合皮肤。假手术组栓线仅送入1cm，其余操作同模型组。3.神经功能缺陷评分参考Longa及Bederson的5分制法在动物麻醉清醒后24h进行评分。追尾征强迫性体态图2 大鼠局灶性脑缺血-再灌模型后的追尾征和强迫性体态 0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。分值越高，说明动物行为障碍越严重。 模型成功的标准为：躯体向左侧屈曲，右侧前爪伸长强于左侧，尾弯向左侧；提尾悬空时呈强迫性体态。注意：症状2-3分的死亡率高，1-2分的死亡率低，有的大鼠第二天或几天后可无明显症状，但取脑后还是有梗死灶的。4.TTC（2，3，5氯化三苯基四氮唑）染色:模型成功后，断头取脑，快速冷冻后，由前向后共切取5张脑片，厚度约为2mm,置于2%溶液中37孵育30 min，严格避光，每隔5 min摇动一次，最后置10% 多聚甲醛液中固定。说明：（1）鱼线选择是关键，根据大鼠重量（做的多了后根据动脉粗细就可选择了）选鱼线。经验是：250g以下的选0.26mm的线，250-300g的选0.28mm。（2）如果遇到鱼线怎么也查不进去的情况，可让大鼠休息一会，换细点的鱼线再试，这种情况不一定都是进到翼腭动脉了，有人曾解剖过4例这种情况的大鼠，有三例均在入颅处卡住了。（3）通过实践，认为结扎或夹闭翼腭动脉没有必要，按