CN103272238A基于DNA与氨基糖苷类分子复合物的生物材料

CN103272238A基于DNA与氨基糖苷类分子复合物的生物材料 (10)申请公布号103272238A (43)申请公布日xx.09.04103272238A*103272238A* (21)申请号xx10228378.2 (22)申请日xx.06.08A61K47/26(xx.01)A61L27/14(xx.01)C12N5/00(xx.01) (71)申请人北京大学地址100871北京市海淀区颐和园路5号 (72)发明人梁德海周继寒文豪石栋牛林殷雨丹 (74)专利代理机构北京万象新悦知识产权代理事务所(普通合伙)11360代理人李稚婷 (54)发明名称基于DNA与氨基糖苷类分子复合物的生物材料 (57)摘要本发明公开了一种基于DNA与氨基糖苷类分子复合物的生物材料。 将DNA溶液以液滴或液柱的形式加入到氨基糖苷类分子溶液中，液滴或液柱表层的DNA与氨基糖苷类分子相互作用，形成聚电解质复合物，从而得到胶囊状或管状包覆的生物材料。 该生物材料具有可以调控的大小和形状，并可以包载不同的药物和功能分子，还可以形成生物细胞和组织工程中的支架材料，实现多样的功能。 (51)Int.Cl.权利要求书1页说明书4页附图3页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图3页 (10)申请公布号103272238A103272238A*103272238A*1/1页21.一种DNA与氨基糖苷类分子复合的生物材料，具有DNA和氨基糖苷类分子形成的复合物外壳，通过如下方法制备得到将DNA溶液以液滴或液柱的形式加入到氨基糖苷类分子溶液中，液滴或液柱表层的DNA与氨基糖苷类分子相互作用，形成聚电解质复合物，得到胶囊状或管状包覆的生物材料。 2.如权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述DNA是大于800bp的双链DNA。 3.如权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述DNA溶液和氨基糖苷类分子溶液的溶剂为1TE缓冲液或水。 4.如权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述DNA溶液的浓度为550mg/mL；所述氨基糖苷类分子溶液的浓度为10100mg/mL。 5.如权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述氨基糖苷类分子是氨基糖苷类抗生素。 6.如权利要求5所述的生物材料，其特征在于，所述氨基糖苷类分子选自卡那霉素、卡内多霉素、链霉素、庆大霉素和阿米卡星中的一种或多种。 7.一种包载生物功能物质的方法，将需要包载的生物功能物质与DNA溶液混合，再将该混合溶液以液滴或液柱的形式加入氨基糖苷类分子溶液中，形成包载生物功能物质的生物材料。 8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述DNA是大于800bp的双链DNA；所述氨基糖苷类分子是氨基糖苷类抗生素。 9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述DNA溶液的浓度为550mg/mL；所述氨基糖苷类分子溶液的浓度为10100mg/mL。 10.权利要求1所述的DNA与氨基糖苷类分子复合的生物材料作为生物细胞和组织工程中的支架材料的用途。 权利要求书103272238A21/4页3基于DNA与氨基糖苷类分子复合物的生物材料技术领域0001本发明涉及复合生物材料，特别涉及基于聚电解质复合原理，利用生物可降解的DNA和氨基糖苷类分子(抗生素)之间的相互作用形成的复合物材料，属于生物材料领域。 背景技术0002聚电解质复合物在生命和材料科学中起着巨大的作用，诸如絮凝剂、润滑剂、涂层材料以及基于阴阳离子静电沉积技术的表面修饰等等领域。 最近二十年来，聚电解质复合物更被视为潜在的有效药物和基因传载体系而受到广泛关注，因为带电的DNA、药物或者蛋白可以很容易被整合到复合物的颗粒之中(A.F.Thunemann，M.Muller，H.Dautzenberg，J.F.O.Joanny andH.Lowen，in Polyelectrolyteswith DefinedMolecular Architecture+i，ed.M.Schmidt，Springer-Verlag Berlin，Berlin，Editon edn.，xx，vol.166，pp.113-171.)。 大量的带正电阳离子化合物，包括聚阳离子、正电磷脂、壳聚糖、白蛋白、树枝状大分子以及多肽等，被利用成为基因和药物的传递载体。 但是由于聚电解质复合物的载体体系存在稳定性的问题(JihanZhou，Jie Liu，Tao Shi，Yuqiong Xia，Ying Luo，and DehaiLiang，Phase Separationof siRNA/polycation Complexand ItsEffect onTransfection Efficiency，soft matter，xx，9，2262-2268)，还有不少的阳离子型载体具有较强的毒性，这都限制了聚电解质复合物载体的临床使用。 0003DNA是一种带电密度很高的刚性强聚电解质，作为生命的遗传物质，它不仅在许多生命过程(DNA的转录与翻译)和生物传承(基因的半保留复制)中起着重大功能，而且还越来越多被用作纳米材料在纳米工程中得到使用。 例如利用DNA折纸术进行组装，形成各种各样的纳米结构(Chenxiang Lin，Yan Liu，and HaoYan，Designer DNANanoarchitectures Biochemistry，xx，48，1663-1674)。 氨基糖苷类分子(Aminoglycosides)，是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的糖苷，是一种带氨基的糖分子，可以抑制细菌蛋白的合成，主要可以用作有氧类细菌的抗生素，在医药方面得到了广泛的应用。 带负电的DNA和带正电的氨基糖苷类分子的复合物材料还未见报道。 发明内容0004本发明的目的在于利用带负电的DNA和带正电的氨基糖苷类分子之间的静电相互作用，以及糖苷分子上的羟基与DNA之间的羟基作用，通过一定的方法，由比例、浓度等条件的调控，形成尺寸、形貌各不相同的复合物材料，可以用来包载药物分子、脂质体以及细胞，还可以用作组织修复以及细胞工程的支架材料。 本发明的技术方案如下0005一种DNA与氨基糖苷类分子复合的生物材料，具有DNA和氨基糖苷类分子形成的复合物外壳，通过如下方法制备得到将DNA溶液以液滴或液柱的形式加入到氨基糖苷类分子溶液中，液滴或液柱表层的DNA与氨基糖苷类分子相互作用，形成聚电解质复合物，得到胶囊状或管状包覆的生物材料。 0006本发明所采用的DNA是碱基对长过一定数目的双链DNA，优选大于800bp，但DNA说明书103272238A32/4页4的长度不对整个材料功能产生决定性影响。 DNA带有足够的负电荷，可以和带正电的氨基糖苷类分子形成复合物作为生物材料的柔性外壳；而DNA液滴或液柱内部提供大量的水环境，可以容纳足够的包覆物。 0007本发明所采用的氨基糖苷类分子带有大量羟基和氨基，主要是指氨基糖苷类抗生素，例如卡那霉素、卡内多霉素(Kanamycin B)、链霉素、庆大霉素、阿米卡星等，它们可以快速与DNA形成聚电解质复合物，其羟基与DNA之间强相互作用使得复合物壳层高度疏水，从而保证形成的胶囊或管状包覆物的稳定性。 0008将DNA溶液以液滴形式滴入氨基糖苷类分子溶液中，即可形成大小与液滴相近的复合物胶囊；将DNA溶液拉成液柱加入氨基糖苷类分子溶液，可形成管状包覆物；采用微流控的方法将DNA溶液和氨基糖苷类分子溶液两种溶液混合，通过设计管路，则可以获得微米级别的胶囊和管状包覆物。 0009上述制备DNA与氨基糖苷类分子复合生物材料的方法中，所述氨基糖苷类分子溶液的浓度通常为10100mg/mL，优选50100mg/mL；所述DNA溶液的浓度通常为550mg/mL，优选1030mg/mL。 配制氨基糖苷类分子溶液和DNA溶液的溶剂优先选择1TE缓冲液(10mM tris，1mM EDTA)或者水。 0010基于上述DNA与氨基糖苷类分子复合的生物材料，本发明还提供了一种包载生物功能物质(分子或结构)的方法，即将需要包载的物质(包括但不限于药物分子、脂质体、细胞等)与DNA溶液混合，再将该混合溶液以液滴或液柱的形式加入氨基糖苷类分子溶液中，可以形成包载药物分子、脂质体和/或细胞等的生物材料。 0011本发明DNA与氨基糖苷类分子复合的生物材料不仅可以用作生物功能物质的包覆材料，还可以作为生物细胞和组织工程中的支架材料，例如通过对包覆物通透性的调节，可以实现将细胞生长物质有选择地分阶段释放到细胞培养基质之中；还可以将细胞包裹在具有三维网络结构的空泡中诱导细胞选择性分化等等。 0012本发明技术效果如下0013下面以鱼精DNA和卡那霉素(Kanamycin)为例，说明微胶囊的形成过程，以及几种性质不同的物质(罗丹明B以及脂质体囊泡等等)的包覆与释放。 当DNA溶于TE缓冲溶液的时候，会因为浓度不同而形成黏度不同的溶液，将这样的溶液液滴加入卡那霉素溶液中，液滴表层DNA的磷酸负电基团与周围溶液卡那霉素的氨基正电基团相互作用，形成聚电解质复合物，这层复合物会随时间逐渐形成，并将内部整个液滴包覆在内。 加入不同形状的液滴，可以形成不同形状的包覆物。 这样的包覆物既能包载罗丹明B这样的小分子，又可以包载脂质体囊泡这样的大结构。 0014综上，本发明提出的基于DNA和氨基糖苷类分子复合物的生物材料具有可以调控的大小和形状，并可以包载不同的药物和功能分子，还可以形成生物细胞和组织工程中的支架材料，能够实现多样的功能。 附图说明0015图1显示了鱼精DNA与Kanamycin形成的包裹泡；0016图2显示了鱼精DNA与Kanamycin形成的管状包覆物；0017图3是鱼精DNA与Kanamycin形成的包裹泡的动力学变化过程图；说明书103272238A43/4页50018图4是SEM测得的鱼精DNA与Kanamycin形成的包裹泡的表面结构图，其中B、C、D分别是A图中b、c、d框中区域的放大图；0019图5是鱼精DNA-Kanamycin包裹泡包载罗丹明B分子的荧光变化图；0020图6是鱼精DNA-Kanamycin包裹泡包载脂质体囊泡的荧光变化图；0021图7显示了鱼精DNA与Kanamycin B形成的包裹泡。 具体实施方式0022下面通过实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果，但并不因此而限制本发明的范围。 0023实验仪器及样品的配制0024 1、实验仪器0025为了表征DNA-氨基糖苷类分子复合的微胶囊的表面形貌与内部结构，利用扫描电子显微镜SEM(Hitachi S-4800，Hitachi，Japan)测定。 用荧光光谱仪(FL-7000，Hitachi，Japan)跟踪荧光标记分子罗丹明B的荧光变化。 0026 2、样品的配制0027鱼精DNA(2000bp)，小牛胸腺DNA(6000bp)，卡那霉素(Kanamycin)，卡内多霉素(kanamycin B)，罗丹明B和带罗丹明荧光基团标记的脂质体作为实验对象。 0028将DNA和氨基糖苷类分子分别溶于TE缓冲溶液中，最终浓度分别为1030mg/mL和50100mg/mL。 罗丹明B或脂质体溶液与DNA溶液共混形成被包载液。 0029实施例10030采用1TE缓冲液，将鱼精DNA溶于缓冲液中，浓度为10mg/mL；将Kanamycin溶于缓冲液中，浓度为100mg/mL；利用100L移液枪将DNA液滴加入Kanamycin溶液，得到复合物壳层。 如图1所示，用肉眼可以看到明显的宏观小球泡状结构。 小球泡状结构的形成过程如图3所示，kanamycin和DNA的复合物是随着时间而逐渐形成的。 将DNA液柱加入Kanamycin溶液，则可以形成管状包覆物，见图2。 0031将形成的泡状结构冷冻干燥，然后用SEM测其表面的形貌，如图4所示，可见形成的泡状结构尺寸在毫米级别(图4A)。 A图中框中的区域b、c、d分别对应放大后的B、C、D图区域，分别为复合物断裂面、复合物壳层以及小泡内部这三个部分。 从放大的图上看，形成的复合物壳层为光滑的表面(图4C)，而小泡内部是DNA与Kanamycin形成的网络状结构(图4D)。 在小泡结构断裂处可以明显看到，壳层与内部之间界面的形貌变化(图4B)。 0032实施例20033采用1TE缓冲液，将鱼精DNA溶于缓冲液中，浓度为20mg/mL；将Kanamycin溶于缓冲液中，浓度为100mg/mL；利用100L移液枪将DNA液滴加入Kanamycin溶液，得到复合物壳层，形成小泡结构，类似于图1。 0034实施例30035采用1TE缓冲液，将鱼精DNA溶于缓冲液中，浓度为30mg/mL；将Kanamycin溶于缓冲液中，浓度为100mg/mL；利用100L移液枪将DNA液滴加入Kanamycin溶液，得到复合物壳层，形成小泡结构，类似于图1。 0036实施例4说明书103272238A54/4页60037采用1TE缓冲液，将鱼精DNA溶于缓冲液中，浓度为10mg/mL；将Kanamycin溶于缓冲液中，浓度为50mg/mL；利用100L移液枪将DNA液滴加入Kanamycin溶液，得到复合物壳层，形成小泡结构，类似于图1。 0038实施例1-4说明，DNA和Kanamycin的复合物小泡可以在较广的浓度范围内得到。 0039实施例50040采用1TE缓冲液，将鱼精DNA溶于含有罗丹明B(浓度0.1mg/mL)的TE缓冲液中，浓度为10mg/mL；将Kanamycin溶于TE缓冲液中，浓度为100mg/mL；利用100L移液枪将DNA液滴加入Kanamycin溶液，得到复合物壳层，液滴中包埋了罗丹明B分子。 将DNA-罗丹明B分子混合液直接加入TE缓冲液作为参照。 加入大量NaCl盐(c4M)可以破坏整个包载小泡，将其中包载的分子完全放出，以这个总量作为样品荧光归一化总量。 0041用荧光光谱跟踪小泡包埋罗丹明B分子的效率和释放过程。 光谱用550nm激发，在560-700nm测量发射荧光，最大发射在574nm。 从图5可以看到，不加Kanamycin的参照体系，荧光信号随时间增长，而加Kanamycin体系的小泡有一个较慢的释放，最终能够包裹近50的罗丹明B小分子。 0042这一实验证明，通过简单的混合，我们的材料就可以包载水溶性的小分子。 0043实施例60044采用1TE缓冲液，将鱼精DNA溶于含有脂质体)，的TE缓冲液中，DNA浓度为10mg/mL，其中脂质体的组成为二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)11，且在囊泡内加入0.1二棕榈酰磷脂酰-N-磺化丽丝胺罗丹明的铵盐(Rh-DPPE)作为荧光基团，浓度为33