第四章 细胞培养与代谢调控

第四章细胞培养与代谢调控 生物科学与技术学院 动物的细胞培养是指从活的机体中取出细胞 模拟机体内生理条件 在体外建立无菌 适温和一定营养条件等 使之生长和生存 并维持其结构和功能的技术 从生物体内取出细胞 模拟体内生理环境 在无菌 适当温度和一定营养条件下 使之生存 生长并维持其结构和功能的方法 将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞 做成细胞悬液 再培养于固体基质上 成单层细胞生长 或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养 第一节细胞培养 体外细胞培养物的生长类型 按生长方式划分 1 粘附型细胞 也叫贴壁型 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞 2 悬浮型细胞 不必附着于固相支持物表面 而在悬浮状态下即可生长的细胞 3 半贴壁型细胞 细胞可在悬浮状态生长 也可以在一定条件下贴壁生长 基本上植物细胞都是悬浮型细胞培养方式 动物细胞是粘附型细胞培养方式 绝大多数动物细胞属粘附型细胞 只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长 细胞贴壁过程 贴附 接触抑制 密度抑制 细胞呈贴壁生长 梭形或不规则形 在粘附因子的作用下 细胞生出伪足 伪足越多 贴壁越好 细胞在生长过程中达到相互接触时停止分裂的现象 因此 贴壁细胞通常都是单层细胞培养状态 细胞接触后 虽发生接触抑制 但只要营养充分 细胞仍会增殖分裂 细胞数量仍在增多 但当细胞密度进一步增大 培养液中营养成分减少 代谢产物增多时 细胞因营养的枯竭和代谢物的影响 则发生密度抑制 导致细胞分裂停止 粘附型细胞分为 1 成纤维细胞型 似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2 3个长短不等的突起 中有卵圆形核 生长时排列成放射状 漩涡状 并不紧靠连成片 细胞 细胞接触易断开而单独行动 游离的单独的成纤维样细胞 常有几个伸长的细胞突起 2 上皮型细胞 类似体内的上皮细胞 扁平 不规则多角形 中有圆形核 生长时易相连成片 相靠 紧密相连 成薄层 铺石状生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动 3 游走细胞型 呈散在生长 一般不连成片 胞质常突起 呈活跃游走或变形运动 方向不规则 此型细胞不稳定 有时难以和其他细胞相区别 4 多形型细胞 有一些细胞 如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态 可统归于此类 细胞培养的条件 1 无菌 无毒 1 对培养液和所有用具进行无菌处理 2 添加一定量的抗生素 防治培养过程中的污染 3 定期更换培养液 以便清除代谢产物防治细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害2 全部的营养物质 葡萄糖 氨基酸 无机盐 促生长因子 微量元素 动物血清等 3 适宜的温度和PH值 36 5 0 5度 PH值7 2 7 44 必要的气体条件 O2 细胞代谢所必需的CO2 维持培养液的PH通常采用培养皿或松盖培养瓶将其置于含95 空气和5 CO2的培养箱中进行培养5 其他 光照 湿度等 细胞培养的方式 根据细胞生长方式分为贴壁培养和悬浮培养两大类 根据细胞代次分为原代培养和传代培养 根据细胞培养操作方式分为 1 固定化培养 通过一些固相的交联化合物将细胞固定于小格中 或者通过共价键交联住细胞 在培养基中进行培养 2 分批培养 将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养 此后细胞不断增长 产物不断形成和积累 最后将培养基连同细胞一并取出 培养结束 3 流加培养 在分批培养的基础上间断地或连续地补加培养基 4 半连续培养 当细胞和培养基一起加入反应器后 在细胞增长和产物形成过程中 每间隔一段时间 取出部分培养物或细胞 然后补充同样数量的新鲜培养基 继续培养 5 连续培养 连续性加入新鲜的培养基 同时取出相同量的旧培养基和细胞 6 灌流培养 当细胞和培养基一起加入反应器后 在细胞增长和产物形成过程中 不断地将部分条件培养基取出 同时不断地补充新鲜培养基 通常用于被固定后的细胞培养 原代培养 从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞 培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养 传代培养 将原代细胞从培养瓶中取出 配制成细胞悬浮液 分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养 称为传代培养 特殊的概念 永生化细胞 正常细胞的生长代谢处于增殖 分化 衰老及凋亡的动态平衡 体外增殖是有限的 培养细胞生命的自然极限称为海弗利克极限 细胞内控制这一系列过程的是一个庞大复杂的细胞调节网络 其中任何一个环节发生错误 都有可能触发细胞内相互关联的一系列信号分子的表达和功能异常 使细胞跨越海弗利克极限 获得不死性 发生永生化 细胞系 指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体 无限细胞系 细胞永生性也称不死性 即细胞获持久性增殖能力 这样的细胞群体称无限细胞系 也称连续细胞系 有限细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞系的生存期限有限 为有限细胞系 原代培养和传代培养 细胞悬液 10代细胞 50代细胞 无限传代 原代培养 传代培养 原代培养和传代培养 多数组织细胞固定在表面生长和分裂 随细胞增多 细胞就会停止分裂增殖 遗传物质改变 遗传物质未改变 人工诱导癌化 细胞传代及培养方法 通常选用幼龄动物组织或胚胎细胞 细胞分化程度低 增殖能力强 更易于培养 动物贴壁细胞培养过程 1 弃掉培养瓶中的培养液 2 加入0 25 的胰蛋白酶液 以消化液能覆盖整个瓶底为准 静置2 10min 显微镜下动态监测 3 吸去胰蛋白酶液 加入一定量的培养液 以能覆盖整个瓶底为准 4 用吸管吸取瓶内培养液 反复吹打瓶壁细胞 形成细胞悬液 5 吸取细胞悬液 300g离心2 5min 用新鲜的培养基重悬制备细胞悬液 6 分瓶接种于新的培养瓶内 加适量新鲜培养液 7 培养箱中培养 贴壁细胞传代培养方法 胰酶消化法 胰蛋白酶的消化功能 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散 不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样 胰酶分散细胞的活性还与其浓度 温度和作用时间有关 在pH为8 0 温度为37 时 胰酶溶液的作用能力最强 使用胰酶时 应把握好浓度 温度和时间 以免消化过度造成细胞损伤 植物悬浮细胞培养过程 1悬浮生长细胞传代 离心法传代 离心 300 500g min 去上清 沉淀物加新培养液后再混匀传代 直接传代法 悬浮细胞沉淀在瓶壁时 将上清培养液去除l 2一2 3 然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代 2半悬浮生长细胞传代 Hela细胞 此类细胞部分呈现贴壁生长现象 但贴壁不牢 可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来 进行传代 悬浮型细胞传代培养方法 离心法 植物组织培养和动物细胞培养的比较 正常细胞生命期是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间 包括原代培养期 传代培养期及衰退期 1 原代期 也称初代培养 即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段 一般持续1 4周 细胞呈活跃移动 可见细胞分裂 但不旺盛 与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大 2 传代期 体内细胞生长在动态平衡环境中 生存空间和营养是有限的 当细胞增殖达到一定密度后 则需要分离出一部分细胞和更新营养液 否则将影响细胞的继续生存 这一过程叫传代 传代期在细胞全生命期中的持续时间最长 细胞增殖旺盛 3 衰退期 此期细胞仍然生存 但增殖很慢或不增殖 最后衰退凋亡 体外培养细胞 一代 生存期细胞 一代 系指从细胞接种到分离再培养时的一段时间 这已成为培养工作中的一种习惯说法 它与细胞世代或倍增一代非同一含义 如某一细胞系为第153代细胞 即指该细胞系已传代153次 它与细胞世代或倍增不同 在细胞一代中 细胞能倍增3 6次 细胞 一代 生存期包含潜伏期 指数增生期 停滞期和衰退期 1 潜伏期 1 游离 悬浮 胞质回缩 全部细胞变为圆球形 约10分钟至4小时 2 吸附 贴附底物 一般24小时内贴壁 细胞株平均在10分钟至4小时后贴壁 3 潜伏 可有运动活动 基本无增殖 少见分裂相 一般为6 24小时 2 指数增生期细胞增值最旺盛的阶段 细胞分裂相增多 群体均一是理想的实验用细胞 指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志 指数增长期末期会出现接触抑制和密度抑制现象 3 停滞期细胞数量达饱和密度后 细胞遂停止增殖 进入停滞期 细胞数量不再增加 故也称平台期 Plateau 停滞期细胞虽不增殖 但仍有代谢活动 继而培养液中营养渐趋耗尽 代谢产物积累 pH降低 此时需做分离培养即传代 否则细胞会中毒 发生形态改变 重则从底物脱落死亡 潜伏期 指数生长期 停滞期 影响潜伏期长短的因素 1 细胞种类传代培养的细胞之潜伏期比原代培养的细胞短 传代培养期的细胞6 24h 原代24 96h或更长 连续细胞系 6 24h 比有限细胞系与正常细胞系的潜伏期短 2 接种的细胞密度密度越大 数量越多 细胞群体越容易适应体外环境 潜伏期就短 相反 即便是在很小的培养空间内 如接种的细胞数量不够大 潜伏期仍会较长3 培养条件培养液 pH 底物 污染 有毒 诱导转化 有限系 无限系 练习 动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于 A 培养基不同 B 动物细胞培养不需要在无菌条件下进行 C 动物细胞可以传代培养 而植物细胞不能 D 动物细胞能够大量培养 而植物细胞只能培养成植株 作业 1 原代培养与传代培养的区别 2 传代培养细胞的特点 3 简述动物细胞培养过程 4 动物细胞培养的条件 5 离体培养的动物细胞分为那些类型及各自特点 第四节细胞代谢与调控 1 糖代谢与脂肪代谢的相互关系2 糖代谢与蛋白质代谢的相互关系3 脂肪代谢与蛋白质代谢的相互关系4 核酸和其他物质代谢的相互关系 一 糖代谢与脂肪代谢的相互关系 延胡索酸 琥珀酸 苹果酸 草酰乙酸 3 磷酸甘油 三羧酸循环 甘油 乙酰CoA 三酰甘油 脂肪酸 糖原 或淀粉 1 6 二磷酸果糖 磷酸二羟丙酮 磷酸烯醇丙酮酸 丙酮酸 合成 植物或微生物特有 氧化 糖异生 糖酵解 乙醛酸循环 二 糖代谢与蛋白质代谢的相互关系 草酰乙酸 乙酰CoA 柠檬酸 酮戊二酸 糖原 或淀粉 1 6 二磷酸果糖 磷酸二羟丙酮 磷酸烯醇丙酮酸 丙酮酸 糖酵解 甘油 丙氨酸 天冬氨酸 谷氨酸 脱氨基 琥珀酸 乙醛酸途径三羧酸途径 糖异生 三 脂肪代谢与蛋白质代谢的相互关系 氨基酸碳架 氨基酸 3 磷酸甘油 甘油 乙酰CoA 三酰甘油 脂肪酸 合成 氧化 磷酸二羟丙酮 磷酸烯醇丙酮酸 丙酮酸 四 核酸和其他物质代谢的相互关系 核酸 磷酸核糖 双糖或多糖 磷酸戊糖途径 葡萄糖 能量和磷酸基团的供应 单糖的转变和多糖的合成 参与卵磷脂的合成 给蛋白质合成提供能量 代谢调控总论 代谢调节的三级水平 细胞 酶水平调节激素水平调节神经水平调节 多细胞整体水平调节 代谢物通过影响细胞内酶活力和酶合成量的变化 改变合成或分解代谢过程的速度 内分泌腺所分泌的激素通过体液输送到一定组织 作用于靶细胞 改变酶活性而调节代谢反应的方向和速度 CNS的控制下 通过神经递质对效应器发生直接影响 或者改变激素的分泌 酶水平调节 酶活性调节 酶结构调节 变 别 构调节 快速调节 微调 酶合成的诱导与阻遏 长期调节 粗调节 酶含量调节 基因表达水平调节 化学修饰调节 酶的降解 细胞 酶水平调节 酶活性调节 变构调节 某些代谢物能与变构酶分子上的变构部位特异性结合 使酶的分子构象发生改变 从而改变酶的催化活性以及代谢反应的速度 被调节的酶称为变构酶或别构酶使酶发生变构效应的物质 称为变构效应剂 其中引起酶活性增加的变构效应剂成为变构激活剂 引起酶活性降低的变构效应剂称为变构抑制剂 变构调节的生理意义 1 代谢终产物反馈抑制反应途径中的酶 使代谢物不致生成过多 长链脂酰CoA 2 变构调节使能量得以有效利用 不致浪费 3 变构调节使不同的代谢途径相互协调 G 6 P 糖原磷酸化酶 抑制糖的氧化 糖原合酶 促进糖的储存 柠檬酸 6 磷酸果糖激酶 抑制糖的氧化 乙酰辅酶A羧化酶 促进脂酸合成 酶活性调节 共价修饰调节 酶蛋白肽链上某些残基在酶的催化下发生可逆的共价修饰 从而引起酶活性改变 这种调节称为酶的共价修饰 共价修饰的主要方式 1 磷酸化 去磷酸2 乙酰化 脱乙酰3 甲基化 去甲基4 腺苷化 脱腺苷5 单价巯基 二硫键 H2O Pi 磷蛋白磷酸酶 ATP ADP 蛋白激酶 共价修饰的特点 1 酶蛋白的共价修饰是可逆的酶促反应 在不同酶的作用下 酶蛋白的活性状态可互相转变 2 具有放大效应 效率较变构调节高 3 磷酸化与脱磷酸是最常见的方式 4 同一个酶可以同时受变构调节和化学修饰调节 酶含量调节 酶合成的诱导 阻碍和降解 DNA水平的调控转录水平的调控转录后水平的调控翻译水平的调控翻译后水平的调控 举例 乳糖对乳糖操纵子的表达的影响 没有乳糖存在时 lac操纵子不表达 mRNA protein I DNA Z Y A O P 阻遏基因 有乳糖存在时 lac操纵子基因表达 mRNA protein I DNA Z Y A O P 激素水平调节 高等生物内分泌腺分泌的激素通过体液转运到靶细胞而对代谢进行调节 激素 激素 激素 靶细胞受体 细胞内 信号 跨膜传递 细胞内的化学反应 生物学效应 按激素受体在细胞的部位不同 可将激素分为两大类 1 膜受体激素 膜受体是存在于细胞表面质膜上的跨膜糖蛋白 2 胞内受体激素 大多数位于细胞核内 有的在胞液中的特异受体结合蛋白 第一信使 受体 信号 第二信使 产生级联方法效应 E0 E1 或 反馈 或 正作用 凡反应物能使代谢过程速度加快者称为正作用 负作用 凡反应物能使代谢过程速度变慢者称为负作用 代谢调控的基本类型 前馈 S0 S1 S2 Sn 1 前馈作用 feedforward 在代谢途径中前面的底物对其后某一催化反应的调节酶有作用 分为前馈激活和前馈抑制 相当于前馈正作用和前馈负作用 2 反馈作用 feedback 代谢产物对前面的某一酶有作用 分为反馈激活和反馈抑制 相当于反馈正作用和反馈负作用 丙酮酸激酶 前馈激活 乙酰CoA羧化酶 前馈抑制 1 前馈作用 G 6 P G 6 P F 1 6 2P F 磷酸烯醇丙酮酸 PEP 丙酮酸 1 前馈激活 feedforwardactivation 2 前馈抑制 feedforwardinhibition 乙酰CoA CO2 H2O ATP 丙二酸单酰CoA ADP Pi E1 E2 E3 E4 反馈抑制 2 反馈作用 1 一价或单价反馈抑制 即直线式反馈控制 只有一个末端代谢产物的途径 A B C D P E1 E2 E3 E4 反馈抑制 A B C D P b 协同反馈控制 分支代谢过程中 任何终产物都不能单独地反馈该途径 而当所有终产物都过剩时才能协同地反馈控制该途径 E1 E2 E3 X Y A B C D E4 E5 2 二价或多价反馈抑制a 合作式反馈控制 又称增效型反馈 任何终产物单独过剩时都能较弱的产生反馈控制 而当所有终产物都过剩时能强烈产生反馈控制 E1 E2 E3 X Y A B C D E4 E5 E1 E4 E5 X Y c 顺序式反馈控制 又称逐步反馈调节 分支代谢途径中的一种通过逐步有顺序的方式达到的反馈调节方式 E1 E2 E3 E4 A B C D P A B C D E2 E3 d 累积反馈控制 每一种终产物只能单独地 部分地反馈共同代谢途径中的一种酶 当几种终产物共同存在时 此反馈作用是累积的 A B C D P E1 E2 E3 E4 代谢途径调控在细胞工程中的应用 1 加速速度限制反应 第一步 确定代谢途径中限速的关键酶 第二步 在该代谢途径中增加该关键酶量 第三步 加速该代谢途径的速度 E1 E2 E3 E4 A B C D P 限速关键酶 E3 E3 E3 E1 E2 E3 E4 A B C D P 限速关键酶 E3 E3 E3 限速关键酶 E1 E1 2 改变分支代谢途径的流向第一步 确定代谢途径中分支代谢途径的关键酶 第