阿维菌素生产研究发展.doc

阿维菌素生产研究发展摘要：本文介绍了阿维菌素的菌株诱变、培养及生产工艺，分析了国内阿维菌素的生产现状、应用和前景。关键词：阿维菌素、生产情况、研究情况及未来发展前景中途分类号：TQ459阿维菌素，英文名称Avermectins，是由日本北里大学大村智等和美国Merck公司首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，由链霉菌中灰色链霉菌Streptomyces avermitilis发酵产生。天然Avermectins中含有8个组分，主要有4种即A1a、A2a、B1a和B2a，其总含量80%；对应的4个比例较小的同系物是A1b、A2b、B1b和B2b，其总含量20%。我国20世纪80年代末由上海市农药研究所开发的从广东揭阳土壤中分离筛选得到7051菌株，后经鉴定证明该菌株与S.avermitilis Ma-8460相似，与avermectin的化学结构相同。1993年北京农业大学新技术开发总公司立项研究并生产开发此药。Avermectin是一种新型抗生素类，具有结构新颖、农畜两用的特点。1阿维菌素国内外发展概述阿维菌素是1975年日本北里研究所从日本静岗县的一个土壤样品中分离得到的，研究人员发现这种菌株的发酵液具有很高的驱肠道寄生虫活性，后来这种菌株被送到美国默克公司做进一步研究。1976年，美国默克公司组织100多位科研人员开始研发，科学家分出这组具有驱虫活性的物质，并将其命名为Avermectin。当时默克公司的原始菌株的发酵单位只有9mg/L，原始菌株经紫外线诱变，从中筛选出一株突变株，发酵单位可达500mg/L。1981年阿维菌素作为兽药投入市场。1985年阿维菌素作为农药投入市场。之后以阿维菌素为原料药的新药相继被开发出来并投入市场，让美国默克公司赚了不少钱。自阿维菌素及其系列产品上市以来，世界各国科学家及研究人员都认为它的发现及应用是继青霉素以来抗生素科学对人类的又一巨大贡献，并认定阿维菌素的出现和发展对全世界的农牧业生产起了巨大作用。在我国，上海农药研究所、北京农业大学等单位对阿维菌素进行了大量研究。1993年北京农业大学农兽药研究室开始阿维菌素的工业化研究工作。1994年，我国第一个阿维菌素产品-北农爱福丁(生物杀虫杀螨剂)在京农公司诞生，这是我国完成的阿维菌素从微药到制剂的第一个高科技产品。1995年，“阿福丁”在京农公司研制成功，包括注射液、片剂、粉剂等在内的4个产品均获准产文号。这是我国自行研制最先问世的阿维菌素兽药用产品。京农公司已研制开发阿维菌素及系列农兽药产品41个，其中16个产品通过了农业部的鉴定，并获准产文号，已投放市场，为我国生物农药开发应用，为农牧业发展做出了重要贡献。2菌株的改造 在工业生产中，阿维菌素菌株的优劣对生产有很重要的影响。阿维菌素原始菌株发酵单位非常低，最先发现的菌株MA-4680的发酵单位只有9ug/ml,经改变发酵条件后有较大的提高，但也仅为120ug/ml,不适合大规模发酵生产。该菌株经过紫外线诱变，从中选出一株诱变株，发酵单位可达到500ug/ml，相比原始菌株有了长足的提高。冯军等通过对原始菌株进行紫外线诱变，得到一株耐链霉素的突变株，发酵单位提高了1.6倍。另一突变株发酵单位提高了2.5倍；再采用亚硝基胍进行诱变，发酵效价提高了1.6倍。并且发酵产物中的Bla和Blb的比之由原来的8提高到20.于秀莲等在亚硝基胍诱变过程中加入质量浓度为1g/L的阿维菌素时，取得最佳诱变效果，正变率达到13.3%。增加阿维菌素质量浓度则孢子的死亡率增加，正变率降低，负变率增加；当质量浓度达到3g/L时，正变率为零；以含甲硫氨酸质量浓度为1g/L的分离培养基作为定向筛选的平板，得到的突变株产B组分含量显著提高；阎浩林等对原始菌株进行紫外诱变，得到一株突变株，发酵单位较原始菌株提高10倍，对此菌株再进行亚硝酸诱变和亚硝基胍诱变，在含有L-异亮氨酸的平板上进行连续筛选，得到突变菌株较原始菌株发酵单位提高100倍以上，通过比较，从诱变后的正变率看，亚硝酸的诱变效果最好，亚硝基胍和紫外线次之。攸德伟等在对菌株进行紫外线诱变中发现，当紫外线照射使菌株致死率为90%时，能取得较好诱变效果的几率较大；在用亚硝基胍诱变时，缓冲体系PH为6.0时效果最好；将孢子在亚硝基胍溶液中进行紫外线照射，效果好于单一的诱变剂。任超等采用紫外线和诱变剂氯化锂、亚硝基胍并结合甲硫氨酸诱导筛选，与出发菌株相比可以获得阿维霉素总效价及Bla组分显著提高的菌株。采用紫外线诱变和化学诱变能使菌株的发酵单位提高，但由于一些因素如紫外线诱变可能使很多菌株被杀死、B1成分的含量不高，或Bla和Blb的比值偏低等，故在原来的基础上又提出了一些改进和一些新的方法。宋渊等采用高频电子流诱变，得到发酵单位高于原始菌株的突变菌株，主要分布在致死率为99.6%-99.7%的范围内；王海彬在对初始菌株，进行Co诱变后，发现回复突变株的高产频率和幅度均高于常规的突变菌株，筛出缬氨酸缺陷性回复突变株，其效价比出发株高33%，且Blb组分质量分数降低了21.3%，有效地提高了产品的质量。有变育种作为一种经常采用的育种手段存在很多不足，其中最大困难在于菌株筛选工作量大。徐志南等提出了一种循环筛选的方法，大大减少了诱变育种中目标菌株筛选的工作量，提高了诱变育种的工作效率。目前通过诱变育种和培养基的优化，我国阿维菌素的发展水平又有很大提高，发酵单位已接近10000ug/ml。3.发酵培养基的研究发酵培养基是一个发酵产品工业化中非常重要的一环，其组分直接影响阿维菌素的产量和生产成本。目前用于工业发酵的培养基种类很多，由于各种培养基成分产地不同，特别是天然组分对发酵产量的影响很大，因此选择一种较好的培养基组合及培养条件是非常必要的。3.1碳源的选择 碳源是组成培养基的主要成分之一，常用的碳源有糖类、油脂、有机酸、和低碳醇等。汪嵘等。在对阿维菌素培养基的 选择上，在以硫酸铵、酵母粉、氯化钴、番茄浆、PH7.0-7.2为基础培养基的条件下，分别以葡萄糖、蔗可溶性淀粉、小麦粉、黄玉米粉、马铃薯浆作碳源进行发酵培养，当培养基的成分适合菌丝生长时，并不一定同时适合目标产物合成。以葡萄糖作碳源时，虽然能得到较高的发酵产量，菌丝生长量也最大，可以作为最佳碳源，但所得干丝量小于以小麦粉作碳源时的干丝量，因此小麦粉时较理想的碳源。发酵前期葡萄糖会明显抑制阿维菌素的生成，后期加入则会增加菌丝的产量。宋渊等在培养基优化时选择了170多种不同配比的发酵培养基进行发酵试验，选择了淀粉为阿维菌素的最合适碳源物质。3.2氮源的选择 常用的氮源分为两大类：有机氮源和无机氮源。有机氮源由花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、鱼粉、酒糟等。汪嵘等在对氮源进行选择时，分别以硫酸铵、蛋白胨、酵母粉、黄豆粉、牛肉膏、酒糟作为唯一氮源测定产物生成量来选择最佳氮源，认为黄豆粉作为氮源最为合适。3.3盐类的影响 微生物在生长时需要某些无机盐和微量元素，以作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物。这些物质一般在低浓度时对微生物生长和产物合成有促进作用，在高浓度时常表现出明显的抑制作用，而各种不同的微生物及同种微生物在不同的生长阶段对这些物质的浓度要求均不同。宋渊等在研究中发现，碳酸钙是在发酵培养基中必须加入的成分，如果在发酵培养基中不加入碳酸钙，则阿维菌素合成产率非常低。一般而言，磷酸盐抑制次级代谢产物的合成，但实验中发现，在发酵液中即使加入质量浓度为2.0g/L的三水合磷酸氢钾，也不会抑制阿维菌素的合成。Burg研究表明，在培养基中加入磷酸氢钾，对阿维菌素的生成具有抑制作用，加入氯化钠则无影响，某些微量元素则可能具有刺激产量作用。王琳慧研究了金属离子在阿维菌素生产中对菌丝的生长及代谢产物的积累作用，研究表明，钾离子对菌丝生长无影响，锌离子刺激菌丝的生长，铜离子抑制菌丝的生长；钾离子、锌离子、铜离子对发酵单位无显著提高，且随离子浓度的升高，抑制发酵单位的作用越明显。微量元素钴作为生长因子对阿维菌素的菌丝生长及代谢产物的积累起着双向调节作用；添加质量浓度为0.02mg/ml的钴离子起最大的促进作用，质量浓度过高则起抑制作用。4生产工艺阿维菌素属于微生物发酵产品，其工业生产基本工艺路线如下：菌种培养发酵过滤萃取结晶成品决定阿维菌素生产成本的关键是发酵液的发酵单位，目前国内大多数企业发酵水平仅达到2500mg/L而国外的发酵水平可稳定在3500mg/L以上，这样导致国内生产阿维菌素的成本高于国外400600元/千克。虽然国内众多企业和科研机构从事阿维菌素高产菌株培育，但绝大多数研究仅小试取得成功，吨级放大后效果不理想。有些偶尔可以达到较高水平，但发酵水平很不稳定，或者在发酵液中杂质含量高，给后处理带来极大的困难，由此造成国内阿维菌素生产成本难以真正降低。最近从中国发明专利技术信息网发现一公司研发出一套阿维菌素生产新工艺。其100吨发酵罐内阿维菌素发酵单位平均可达3500mg/L，阿维菌素精粉提取率70%以上，每公斤阿维菌素生产成本控制在千元以内，年产20吨阿维菌素原药，固定资产投资2000万元左右，并经过百吨级生产装置验证，成熟可靠。如果应用该技术新建或改造国内阿维菌素装置，可以提高国内阿维菌素产品在国际市场上的竞争能力。5阿维菌素的应用5.1农药领域阿维菌素最主要的用途是作为农药用于烟草、蔬菜、果树、棉花、花卉等作物防治相应的虫害。阿维菌素对多种农作物的害螨和害虫具有很高的生物活性，它是一种优良的抗生素杀虫、杀螨剂，广泛用于杀灭寄生于植物上的螨类、小菜蛾、菜青虫、潜叶蝇、木虱、线虫等，具有广谱、高效、安全、低残留、不易产生耐药性、与其他杀虫药无交叉抗性和对人畜及环境安全等特点，是目前农业害虫综合防治中较理想的农药品种之一。它的作用机理是抑制节肢动物神经传导，使害虫在几小时内迅速麻痹、拒食、缓动或不动，2 4小时内死亡。目前美国、日本、德国、台湾及其他一些发达国家普遍采用阿维菌素农药防治农作物虫害，美国80%的蔬菜和棉花都使用阿维菌素系列杀虫剂。在我国以阿维菌素为代表的生物农药受到农药界的高度重视和积极开发。近年来，在广东省东莞、深圳和惠阳等地的供港菜场，阿维菌素已经成为当地防治蔬菜重要害虫小菜蛾必不可少的首选农药。在云南省，阿维菌素被大量用于防治蔬菜、烟草、花卉的美洲斑潜蝇，由于防治效果显著，广受欢迎。从长远来看，我国对阿维菌素的需求正呈逐步上升的趋势。但由于阿维菌素的相对价格较高，目前的使用对象还限于经济作物上，而对于普通农作物，除少数经济发达地区如上海，政府通过财政补贴鼓励使用生物农药而外，生物农药在大部分地区的推广和使用较为困难。随着发酵技术的不断改进，生产成本的逐步降低，再加上登记作物和防治对象范围会日益扩大，阿维菌素的市场将不断拓展。另外从环保角度分析，随着甲胺磷、对硫磷、久效磷等高毒农药的禁用，特别是我国加入WTO后在国际农产品和食品贸易中，将面对苛刻的农药残留标准，无疑也为阿维菌素等生物农药的发展提供了巨大的机遇，使阿维菌素市场前景充满希望和光明。5.2兽药领域阿维菌素也广泛应用于治疗多种家畜体内外寄生虫病。阿维菌素对线虫、昆虫和螨均有驱杀活性，用阿维菌素制成的针剂、片剂主要用于治疗家畜的胃肠道线虫病、牛皮蝇蛆、纹皮蝇蛆、羊鼻蝇蛆、羊痒螨和猪、羊疥螨病等。6发展前景目前，生物农药在农业生产中的普及和应用步伐十分滞缓，生物农药的开发生产热与应用滞缓冷淡呈现出强烈的反差。截至2008年底，全国共有规模以上生物化学农药及微生物农药企业121家，亏损企业13家，企业亏损额为1760万元。2008年规模以上生物化学农药及微生物农药企业实现工业总产值76.95亿元，同比增长56.81%；共实现销售收入62.33亿元，同比增长45.19%；实现利润4.49亿元，同比增长31.06%。形成这样的反差是因为使用生物农药较化学农药成本高、见效慢，而且农民生产出来的绿色农产品在市场上并没有明显的价格优势，因而抑制了农民购买使用的积极性。而且农民还没有形成环境保护的意识，防治同种虫害的生物农药比化学农药价格要高，这些问题直接影响到其产业化的推进速度。尽管生物农药在整个农药市场中所占份额还不是很大，但其销售量在各地都有10%以上的增长，市场覆盖率也在逐步扩大。因为当前正是我国发展生物农药的黄金时期，由于人们越来越注重健康和环保，特别是在国际农产品和食品贸易中面对苛刻的农药残留标准壁垒，生物农药终于迎来了发展机遇。阿维菌素做为我国农药杀菌剂和杀虫剂销售和使用量名列前茅的品种，从综合产业化规模与其研究深度上分析，已成为我国生物农药产业中的拳头产品和领军品种，成为我国生物农药产业的中坚力量。它的发展趋势代表着我国未来生物农药产业市场的发展方向。参考文献1宋