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酶工程复习大纲第一章绪论酶的概念：酶是具有生物催化功能的生物大分子。酶与酶工程发展简史（1）消化1777年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验。1822年，美国外科医生 Beaumont 研究食物在胃里的消化。19世纪30年代，德国科学家Schwann获得胃蛋白酶。（2）发酵1684年，比利时医生Helment提出ferment引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）。1833年，法国化学家Payen和Person用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶（diastase）。1878年，德国科学家Khne提出enzyme从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。酶学的迅速发展（理论研究）（1） 酶的化学本质1926年,美国康乃尔大学的“独臂学者” Sumner博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质。1930年，美国的生物化学家Northrop分离得到了胃蛋白酶（pepsin）、胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）结晶，确立了酶的化学本质。（2） 酶学理论研究1890年，Fisher锁钥学说。1902年，Henri中间产物学说。1913年， Michaelis 和 Menten米氏学说。1958年， Koshland诱导契合学说。1960年，Jacob 和 Monod操纵子学说。（二) 酶工程研究简史（应用研究）1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备得到淀粉酶，开创了酶技术走向商业化的先例。1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，用于皮革的软化及洗涤。1908年，法国的Boidin制备得到细菌淀粉酶，用于纺织品的褪浆。1911年，Warlerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。1949年，用微生物液体深层培养法进行a淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕。1960年，法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量。固定化技术的发展经历1916年，Nelson和Griffin发现蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性。1969年，日本千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L氨基酸。1971年，第一届国际酶工程会议在美国召开，会议的主题是固定化酶。按分子中起催化作用的主要组分不同酶分为两大类：蛋白类酶（P酶）：起催化作用的主要组分为蛋白质的一类酶 核酸类酶（R酶）：起催化作用的主要组分为核糖核酸的一类酶 根据酶所催化的反应类型，按照国际系统分类方法，将蛋白类酶分为六大类：1、氧化还原酶类：催化氧化还原反应，涉及H 和电子的转移。如脱氢酶类。2、转移酶类：催化分子间功能基团的转移。如转氨酶类。3、水解酶类：催化水解反应。如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶等。4、裂合酶类：催化一个化合物裂解成两个较小的化合物及其逆反应的酶。如醛缩酶 脱氨酶 脱羧酶等。5、异构酶类：催化分子内部基团位置或构象转换的酶。6、合成酶或连接酶：伴随着ATP 等的水解，催化两个分子进行连接反应的酶。如天冬酰胺合成酶 丙酮酸羧化酶等。核酸类酶：核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。分为：1分子内催化的R酶：自我剪切酶；自我剪接酶 2分子间催化的R酶：RNA剪切酶；DNA剪切酶；多糖剪切酶；多肽剪切酶；氨基酸酯剪切酶；多功能R酶。酶的命名：（一）习惯命名方法 （1）根据作用底物来命名，如淀粉酶、蛋白酶等。（2）根据所催化的反应的类型命名，如脱氢酶、转移酶等。（3）两个原则结合起来命名，如丙酮酸脱羧酶等。（4）根据酶的来源或其它特点来命名，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。(二)国际系统命名法：该命名法规定，每种酶的名称应明确标明底物及所催化反应的特征，即酶的名称应包含两部分：前面为底物，后面为所催化反应的名称。 若前面底物有两个，则两个底物都写上，并在两个底物之间用“：”分开，若底物之一是水，则可略去。 国际酶学委员会（EC）规定，每个酶都有唯一的特定标码，其书写方式是：例如：乙醇脱氢酶的编码是： EC1.1.1.1 第一个“1” 第1大类，即氧化还原酶类； 第二个“1” 第1亚类，供氢体为CHOH； 第三个“1” 第1亚亚类，受氢体为NAD+； 第四个“1” 在亚亚类中的顺序号。P酶和R酶的分类与命名有何异同？总原则相同，都是根据酶的作用底物和催化反应的类型进行分类和命名由于P酶和R酶具有不同的结构和催化特性，所以各自的分类与命名又有所区别。显著区别之一是P酶只能催化其它分子进行反应，而R酶却可以催化酶分子本身，也可以催化其它分子进行反应，由此R酶的分类中出现了分子内催化R酶、分子间催化R酶等名称。酶活力（enzyme activity） ：酶催化底物发生化学反应的能力。测定酶活力，实际上就是测定酶促反应进行的速度。酶活力单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。酶含量用每克酶制剂或与每毫升酶制剂含多少酶单位来表示（U/g或U/m1）。国际单位 IU：在25、最适pH、饱和底物浓度的反应条件下， 每分钟内催化1微摩尔（mol）底物转化为产物所需的酶量，即IU=1mol /min。酶活力的测定方法：化学测定法、光学测定法、气体测定法第二章 微生物发酵产酶一个优良的产酶菌种应具备以下几点： a 繁殖快,产酶量高，有利于缩短生产周期 b 容易培养和管理 c 产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭 d 产生的酶容易分离纯化 e 安全可靠、无毒性微生物酶的类型：1.胞外酶：细胞内合成而在细胞外起作用的酶。包括位于细胞外表面或细胞外质空间的酶，也指释放入培养基的酶。2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，这些酶在细胞内常与颗粒体结合并有着一定的分布。酶合成调节的类型：1.诱导 (induction) 组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。 2.阻遏 (repression) 分解代谢物阻遏(catabolite repression) 反馈阻遏(feedback repression)新菌种分离与筛选的步骤：定方案：先要查阅资料了解所需菌种的生长培养特性采样：有针对性地采集样品增殖：通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养分离：利用分离技术得到纯种发酵性能测定：进行生产性能测定酶生物合成的模式：1生长偶联型：同步合成型、中期合成型 2部分生长偶联型：延续合成型3非生长偶联型：滞后合成型产酶动力学第三章 动、植物细胞培养产酶动、植物细胞培养产酶三者之间的差异主要有：植物细胞动物细胞微生物细胞。动物细胞和植物细胞的生产周期比微生物长。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。（植物细胞：色素、药物、香精、酶等；微生物细胞：醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等；动物细胞：疫苗、激素、单克隆抗体、酶等）一、植物细胞培养的特点1.提高产率2.缩短周期3.易于管理、减轻劳动强度4.提高产品质量5.其他三、植物细胞培养方法悬浮细胞培养外植体： 从植株取出，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。愈伤组织四、培养条件的影响与控制： 1.温度； 2.pH ； 3.溶解氧的调控； 4.光照的控制； 5.前体的添加； 6.诱导子的应用。一、动物细胞培养的特点：1.细胞生长速度慢（需添加抗生素）2.细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感3.反应过程成本高，产品价格贵4.细胞具有锚地依赖性5.原代细胞一般繁殖50代二、培养基 1.天然培养基 2.合成培养基 3.无血清培养基三、动物细胞培养方式：悬浮培养、贴壁培养、固定化细胞培养动、植物细胞培养的目的及其在研究工作中意义： 目的：是获得细胞产物意义：1.能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动。2.便于使用各种不同的研究技术对细胞进行研究。3.易于附加物理、化学、生物药物等实验因素。4.能同时提供大量生物性状相似的实验材料。四、培养条件的影响与控制1.温度：一般控制在36.5.2.pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。3.渗透压: 应与细胞内渗透压相同。4.溶解氧：根据情况随时调节。细胞株：是通过选择或克隆化培养，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、生化特性或特异标记的细胞群。细胞系：是由原先组成原代培养物的所有细胞类型组成。研究无血清培养的意义：血清不易获得、培养细胞时所用血清批次不同、血清中含有病毒。第四章 酶的提取与分离纯化酶的分离纯化：指从微生物的发酵液或动、植物组织提取液及细胞培养液中得到高纯度、高质量的酶产品。酶分离纯化的方法是根据酶的蛋白质特性而建立的。酶的提取：把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。 影响酶提取的主要因素：1.温度：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温下（0-10）操作。2.pH：远离等电点的pH值，溶解度增加3.提取液的体积：提取液的总量一般为原料体积 的3-5倍提取目标：a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。离心分离：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术。总结： 等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度。 差速离心是一种动力学方法，关键在于选择适合于各分离物的离心力。 密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关键在于制备优质的密度梯度溶液。层析分离的基本原理：利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。双水相萃取技术： 又称水溶液两相分配技术。指用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%90%），故称“双水相”系统。 第五章 酶分子修饰酶分子修饰概念：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程。酶化学修饰分类：（一） 金属离子置换修饰：通过改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。金属离子置换修饰的目的：a.阐明金属离子对酶催化作用的影响； b.提高酶活力； c.增强酶的稳定性； d.改变酶的动力学特性。（二） 大分子结合修饰：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。大分子结合修饰的作用：a.通过修饰提高酶的活性及催化效率； b.可以增强酶的稳定性（通过半衰期表示）； c.降低或消除酶蛋白的抗原性。（三） 肽链有限水解修饰：利用肽链有限水解，使酶的空间结构发生精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。（四） 酶蛋白侧链基团修饰：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链基团修饰的作用：a.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性质和数目； b.用于酶蛋白的纯度的分析与鉴定； c.探索酶蛋白作用的化学机理； d.用于酶蛋白分子的固定化。酶化学修饰的目的：1. 研究酶的结构与功能的关系（50年代末）2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）；2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）；3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）；4）产生新的催化能力。酶化学修饰的应用： 在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。 在生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适pH等酶学性质。在酶结构功能研究中：1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；2.确定氨基酸残基的功能；3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。第六章 酶、细胞、原生质体固定化酶与细胞固定化的概念：借助各种物理或化学方法，将酶或细胞固定于水不溶性载体上的过程，称为酶与细胞固定化。为什么对天然酶进行固定化？1、酶稳定性差，易变性失活2、酶和底物只能反应一次，难于回收利用，不仅成本高，而且难于连续化生产。3、反应液中混入酶蛋白，使产品的分离纯化复杂化。固定化酶特点：1、不溶于水:反应完成后，经过滤或离心等简单分离，就可以回收，以重复使用，降低酶制剂成本。2、具有一定的机械强度: 可将其装成酶柱，当底物溶液缓缓流经酶柱时，就能发生酶促反应，流出液中，即含有酶促反应产物，其产物不易带杂质，收率高，易精制。3、稳定性提高:一根酶柱往往可以连续使用数十次，而酶活力并无明显下降。固定化酶的应用1、固定化酶在工业生产中的应用：(1) 氨基酰化酶、(2) 葡萄糖异构酶、(3) 天门冬氨酸酶、(4) 青霉素酰化酶2、固定化酶在传感器方面的应用（1）酶传感器、（2） 酶电极、（3）葡萄糖氧化酶电极、（4）青霉素酶电极3、固定化酶在医疗上的应用： （1）作为治疗药物、（2）作为“人工脏器”细胞固定化：通过各种方法，将细胞与水不溶性载体结合，制备固定化细胞的过程。固定化原生质体：将微生物细胞和植物细胞去细胞壁后，可得原生质体，将此原生质体用多孔凝胶包埋，即为固定化原生质体。第七章 酶的非水相催化酶的非水相催化概念：酶在非水相介质中进行的催化反应称为酶的非水相催化。酶的非水相催化特点：a.提高非极性底物和产物的溶解度，从而提高反应速度；b.使某些原本在水相不能进行的反应顺利进行，如肽的合成、 酯的合成等； c.有利于反应后酶与产物的分离；d.解除和减少某些产物对酶的抑制作用；e.提高酶的稳定性;f.无微生物污染.酶非水相催化的几种类型：有机介质中的酶催化； 气相介质中的酶催化；超临界介质中的酶催化；离子液介质中的酶催化。酶非水相催化优点归纳为：1.有利于疏水性底物的反应，能催化在水中不能进行的反应；2.可提高酶的热稳定性；3.可改变反应平衡移动方向；4.可控制底物专一性；5.酶和产物易于回收。酶非水相催化应用：手性药物的拆分；手性高分子聚合物的制备；酚树脂的合成；导电有机聚合物的合成；发光有机聚合物的合成；食品添加剂的生产；生物柴油的生产。第八章 酶反应器酶反应器（Enzyme reactor）：以酶或固定化酶作为催化剂进行酶促反应所需的装置。或者用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。酶反应器特点： 不同于化学反应器：在低温、低压下发挥作用，反应时的耗能和产能也比较少； 不同于发酵反应器：因为它不表现自催化方式。常见的酶反应器类型按结构区分：n 搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor, STR）n 鼓泡式反应器(bubble column reactor, BCR )n 填充床式反应器(packed column reactor, PCR )n 流化床式反应器( Fluidized Bed Reactor, FBR)n 膜反应器(Membrane Reactor, MR) 按操作方式区分：n 分批式反应(batch )n 连续式反应(continuous )n 流加分批式反应(feeding batch ) 混合形式：n 连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor,