酶法分析(生科院2015年)

酶法分析 是利用酶作为工具对特定物质 底物 辅酶 抑制剂和激动剂等 进行定量分析的方法 酶法分析与酶活力测定的异同 相同点 二者均使用了酶促反应不同点 测定的目的物不同 实验设计不同酶活力测定中待测物为酶 因而酶必须是限速因素 而底物和辅酶等必须过量 酶法分析中待测物不是酶 而是底物或辅酶或抑制剂或激动剂等等 因而必须使待测物成为该反应的限速因素 因此二者是不相同的 不能混为一谈 终点法 总变量法 终点法是以下述原理为基础的 先借助酶反应 单个酶反应或者几种酶构成的偶联酶反应 使被测物质定量地进行转变 然后在转变完成后 测定底物 产物或辅酶物质 第二底物 等的变化量 因此称为终点测定法 终点法是酶法分析中最普遍 最广泛的定量法 终点法的条件 必须有专一地作用该被测物质的酶 并能得到它的制品 能够确定使这种酶反应接近进行完全的条件 反应中底物的减少或产物的增加或辅酶物质的改变等可以借助某种简单的方法进行测定 在能满足这些条件的情况下 最好是采用单一酶反应就能进行定量检测 使用终点法应注意的问题 1 酶的底物专一性 绝对专一性相对专一性立体异构专一性对于酶法分析来说 最理想的酶是具有绝对专一性的酶 2 反应的平衡对于终点法来说 要求反应接近进行完全 故对不同的酶反应须采取不同的措施使反应进行到接近完全 若酶反应平衡十分偏向进行方向 则可方便的用终点法进行检测 不需进行任何处理 若反应的平衡并不十分偏向进行方向 或偏向逆方向 那么由于反应不能完全 因而也就不能正常定量 为了解决这一问题 通常采取以下一些措施 对于双底物反应尽可能提高第二底物的浓度对氧化还原之类与H 有关的反应要选择适当的pH设法除去产物用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原有的辅酶和第二底物的再生系统偶联 则第一底物可能完全转化为反应产物 3 反应液中的酶量 对于一个具体的测定来说不同的酶反应有不同的Km值 通过米氏方程和均相溶液反应的动力学推算和分析 可以大致得到如下的结论 对于单酶反应的酶法分析 所加入的酶量 u ml 相当于Km mmol 对于偶联反应的酶法分析 所加入的酶量如下 第一反应为酶量 u ml 相当于Km1 mmol 第二反应为酶量 u ml 相当于 1 2 Km2 mmol 4 反应产物抑制 终点法的种类 一 单酶反应定量法 在这种单酶反应中 不需指示反应 可以直接测定S的减少量或P的增加量和辅酶的变化量 1 底物减少量的测定可定量的物质有 胞嘧啶 280nm 腺嘌呤 280nm 和尿酸 293nm或297nm 尿酸的定量 2 产物增加量的测定此法可定量的物质有 1 各种氨基酸和草酸 2 黄嘌呤 次黄嘌呤以及CoA3 辅酶变化量的测定条件 测定以NAD或NADP为辅酶的脱氢酶的底物的量 此法适用范围很广 原理 NADH和NADPH在340nm有特征最大吸收峰 而NAD和NADP在340nm却无这一吸收带 故可应用于NAD或NADP为辅酶的脱氢酶反应 通过测定340nm吸光度的变化 就可以对作用相应脱氢酶底物的物质进行定量分析 羟基丙酮酸定量 可用两种酶 甘油酸脱氢酶 专一性强 乳酸脱氢酶 丙酮酸干扰 二 和指示酶反应偶联的定量法 常用在下面两种情况 指示酶反应 1 以脱氢酶为指示剂 A2 A1代表了G 1 P的量 例2 样品中同时含有G和果糖 利用酶法分析测定G的量 利用己糖激酶 例3 在一个比色杯中同时定量丙酮酸 磷酸烯醇式丙酮酸和D 2 磷酸甘油酸 2 以脱氢酶以外的酶作为指示剂 过氧化物酶作为指示剂 心肌黄酶作为指示剂 492nm有强吸收 例 L 谷氨酸的定量测定 测定反应 L Glu NAD H2O 谷氨酸脱氢酶 酮戊二酸 NADH H 指示反应 NADH INT H 心肌黄酶 NAD 甲臜 NADH H INT 碘代硝基四唑 NAD 甲臜 心肌黄酶 酶循环放大分析法 酶循环放大法的原理 步骤 超微量前列腺素的定量为例 三步 第一步 转换反应 第二步 循环反应 第三步 指示反应 利用终点法测Glu 或3磷酸甘油酸 的量 如何测得循环数n 用已知量的NADH已知作为NADH转在相同条件下进行循环反应和指示反应NADH已知 NADH指示 nn NADH指示 NADH已知 即用已知量的NADH已知平行做循环反应 指示反应 在这种方法中应注意的几个问题 1 在进行循环反应之前 必须设法除去转换反应中剩余的辅酶 在上例中就是设法除去NAD 除去的方式 NAD和NADP的氧化型和还原型在不同的pH值下其稳定性不同 可通过调节pH来达到目的NAD NADP 氧化型 NADHNADPH 还原型 pH2 25 1h稳定5min99 9 被破坏pH13 60 10min99 9 被破坏1001h仍稳定 2 在循环反应中 底物 不是辅酶 需够量 3 要用已知量的循环底物 上例中NADH 平行做循环反应和指示反应以求得循环数n 单酶循环 二 应用范围 1 有循环底物参加的酶反应的底物或酶可测定NAD NADP CoA等2 能与以上反应偶联的酶反应的底物或酶可测定 酶法分析 一章的要求1掌握终点法的测定原理 终点法的条件2使用终点法测定时应注意的问题3掌握通过测定辅酶变化量的单酶反应定量法 学会如何进行实验设计和分析 4掌握以脱氢酶为指示剂的偶联定量法 学会如何进行实验设计和分析 5掌握酶循环放大分析的原理和步骤6使用循环放大分析法时应注意的问题7掌握循环放大分析法的应用 学会如何进行实验设计和分析 反应速度法 辅酶的测定 抑制剂的测定 S E P 抑制剂 抑制剂的量与反应速度的