PCR技术.doc

聚合酶链式反应（PCR）技术是现代分子生物学核心技术之一，研究提高PCR扩增效率的方法具有重要意义。传统提高PCR扩增效率的方法具有较多局限性，使得PCR扩增仍不能达到理想的效果。随着纳米技术的发展，纳米材料具有特殊的表面效应和尺寸效应，表面能进行多种修饰，易与生物大分子蛋白质、核酸等相互作用，对生物分子的结构和功能产生特别的影响。研究利用纳米材料来提高PCR扩增效率的技术和方法，具有非常重要的理论意义和应用价值。本文引用文献41篇，综述了近年来纳米材料在PCR体系中应用的现状，并展望了今后纳米材料在PCR体系中应用的发展方向及其前景。关键词 聚合酶链式反应；纳米材料；特异性；扩增效率；评述 Application Progresses of Nanomaterials on Polymerase Chain ReactionLI Na，QIAO Guang-Ming，ZHUO Lin-Hai，T Bo*(College of Chemistry，Chemical Engineering and Materials Science，Key Laboratory of Molecular and Nano Probes，Ministry of Education，Engineering Research Center of Pesticide and Medicine Intermediate Clean Production，Ministry of Education，Shandong Normal University，Jinan 250014)Abstract Polymerase chain reaction possesses very important academic and application meanings to study the ways and technologies of improving the efficiency of PCR based on nanomaterials.In this review，recent application status of nanomaterials on PCR was summarized with 41 references.Particularly，the developing trends and prospects in the future were also discussed. Keywords Polymerase chain reaction； anomaterials； pecificity； mplication efficiency； eview 1 引言引言引言引言 1983年Mullis发明了聚合酶链式反应(PCR)1，并因此荣获1993年诺贝尔化学奖。PCR可使目的DNA分子的合成量呈指数增长，因此微量的遗传物质在数小时内即能扩增数百万倍2，3达到检测水平，进而可进行测序4、DNA探测5，6、基因分析79、食品检验10，11、环境监测12，13等。PCR技术具有特异、敏感、快速、易自动化等突出优点，彻底改革了分子遗传学，成为现代生物学和药物科学最流行的技术之一，与克隆、DNA序列分析方法构成了整个现代分子生物学研究工作的基础。尽管PCR已发展成为一项相当成熟的技术，但在实际操作中，PCR扩增始终存在一些难以克服的问题，如假阴性、假阳性、非特异性扩增以及片状拖带或涂抹带等，寻找解决PCR中这些问题的方法至关重要，通常的办法有向PCR体系中添加各种增效剂14，15，优化PCR体系的各种参数16，17，改进PCR的扩增策略18，19等，这些方法虽然在一定程度上提高了PCR的特异性、产量以及效率，但是并未彻底解决上述难题，PCR扩增仍达不到理想的预期效果。近年来，人们试图从新兴学科与技术中寻找优化PCR的方法。纳米生物技术由于其独特的优势性越来越受到人们的关注20。尺寸小于100 nm（与生物分子的尺寸相当）的纳米材料在生物医学中得到了广泛的应用21，22，人们已将多种纳米材料引入传统的PCR技术中。 2 纳米材料对PCR体系的影响 2.1 金纳米粒子对PCR体系的影响Li等23将10 nm的金纳米粒子作为一种新型的优化剂添加到PCR体系中，考察了金纳米粒子对PCR特异性的影响。实验结果发现，当金纳米粒子的浓度介于0.40.8 nmol/L之间时，随着金纳米粒子浓度的不断增高，PCR的特异性越来越好；但当金纳米粒子浓度大于1.0 nmol/L时，PCR的特异性又被抑制。而且，加入金纳米粒子在保持PCR产量和特异性的前提下，可以拓宽PCR体系的退火温度范围，退火温度即使低至25 ，PCR仍具有较好的特异性。Li等23认为金纳米粒子模拟了体内DNA复制过程中单链结合蛋白SSB的作用，选择性地结合了单链DNA，而不是双链DNA，从而显著降低了DNA复制过程中引物和模板的错配。此前，Perales等24通过模拟生物体内的扩增策略，成功地将耐热的SSB蛋白引入到PCR体系中，提高了PCR的特异性。 Vu等25深入探讨了金纳米粒子对PCR体系特异性的影响。发现金纳米粒子的作用不是增加PCR的特异性，而是更有利于小片段产物的产生，抑制大片段产物的产生，不论该小片段产物是特异性产物还是非特异性产物。而且，随着金纳米粒子浓度的增加，这种作用越来越明显。他们认为金纳米粒子能促进小片段的扩增，是因为纳米金与聚合酶发生了非特异性结合，是表面化学作用起到重要作用。 Li等26研究了13 nm的金纳米粒子对PCR体系效率的影响。实验表明，金纳米粒子能使PCR体系的产量提高104106倍，反应时间越短，金纳米粒子对PCR体系产量的提高就越明显。而且，相同量的金纳米粒子对不同升降温速度的PCR体系的影响不同。与不加金纳米粒子的PCR体系相比，金纳米粒子对升/降温速度为20 /S的实时PCR产量的提高可高达104倍， 而对升/降温速度为2 /S的普通PCR体系， 金纳米粒子对其产量的提高只有510倍，PCR体系的热循环越快，金纳米粒子对PCR产量的提高就越大。Li等26认为，金具有良好的热传导性，改善了快速升降温PCR体系的热传导性，有利于模板与引物更高效的配对，从而提高了PCR的产量，优化了PCR体系。 对于金纳米粒子与PCR各参数的相互作用，文献27，28报道了引物共价键合到金纳米粒子表面的PCR。结果表明，一条引物（上游引物或者下游引物）或者两条引物连接到金纳米粒子上，在一定范围内，退火温度对PCR体系几乎没有影响，PCR特异性均较好。 米丽娟等29研究PCR体系中纳米金与DNA聚合酶的相互作用机制时发现，过量的纳米金之所以会抑制PCR扩增，是因为纳米金与聚合酶发生了相互作用。若提高聚合酶用量，可有效消除金纳米粒子的这种抑制作用。在PCR体系中，纳米金通过与游离的DNA聚合酶的可逆结合，动态调节聚合酶的浓度，进而影响PCR的扩增结果。但该机理仅从纳米金与聚合酶的相互作用出发，考虑到PCR体系的复杂性，纳米金还有可能与模板、引物等发生了复杂的相互作用，更为确切的调控机制有待深入研究。 纳米金还可以优化PCR的扩增策略。 Pan等30研究基于纳米金的多轮扩增发现，由于纳米金可以抑制PCR的非特异扩增，可以将PCR的有效扩增极限推到第7轮，即使在第6轮扩增中也能得到单一明亮的目标条带。而在常规PCR多轮扩增中，无论对DNA模板如何稀释，有效扩增只能进行到第3轮，且随着扩增轮数的增加，目标产物的量也呈下降趋势。纳米金辅助的PCR再扩增和多轮扩增在一定程度上可取代巢式PCR，避免了巢式PCR需要设计两对引物的繁琐。实验还发现，表面修饰了BPS、茎环DNA、以及Triton-100的金纳米粒子，虽然表面性质发生了改变，但是仍然能提高PCR的特异性和产量。2.2 银纳米粒子对PCR体系的影响 王群等31探讨了银纳米粒子对PCR体系长片段DNA反复扩增的特异性的影响。实验结果表明，对长度为36 kb的较长片段基因，银纳米粒子在一定程度上保持了其PCR反复扩增的特异性；而对10 kb以上更长片段的反复扩增，银纳米粒子对其特异性的影响比较小。他们认为，可能是银纳米粒子性改善了常规PCR体系溶液的导热性能，缩短了整个体系达到温度平衡所用的时间，从而抑制了非特异扩增；也可能是银纳米粒子与不同状态DNA分子发生了选择性结合，从而提高了扩增的特异性。 2.3 磁性纳米粒子对PCR体系的影响 Shen等27，32研究了将引物共价键合到SiO2包覆的-Fe2O3磁性纳米粒子表面的PCR。实验结果表明，引物连接到-Fe2O3磁性纳米粒子表面，在合适的条件下，PCR反应能顺利进行。当一条引物（上游引物或下游引物）连接在-Fe2O3磁性纳米粒子表面，而另一条引物（下游引物或上游引物）未连接时，PCR几乎不受退火温度的影响；但当两条引物都连接在-Fe2O3磁性纳米粒子表面时，PCR受退火温度的影响较大。在一定温度范围内，退火温度越高，PCR产物特异性越好。而且，将引物与磁性纳米粒子连接，产生了新的基于磁性纳米粒子的不对称PCR和对称PCR。一条引物连接到磁性纳米粒子表面的不对称PCR扩增可以产生大量磁性纳米粒子-单链DNA复合物，由于单链DNA产物连接在磁性纳米粒子的表面，所以利用外磁场作用可以很容易地将其分离；而两条引物均连接到磁性纳米粒子表面的对称PCR扩增，产生了一种生产纳米结构聚合物的新方法。 2.4 纳米碳对PCR体系的影响 2.4.1 纳米碳管对PCR体系的影响 Cui等33发现单壁碳纳米管（SWNTS）能对PCR产生积极的影响。当SWNTS浓度小于3 g/ L时，能增加PCR扩增的产量；而当SWNTS浓度大于3 g/L时，又会抑制PCR反应。此外，SWNTS还可以在一定程度上模拟PCR缓冲液中Mg2+的重要作用。当PCR反应液中没有Mg2+时，加入SWNTS能得到与Mg2+存在时相似的效果，PCR的产量没有太大的差别，都是在SWNTS浓度为3 g/L时得到最大产量。为了探求实验的机理，他们将SWCNTS分别与DNA、Taq酶进行了孵育，结果发现这些反应成分聚集在SWCNTS周围，能更好的接触而发生反应，因而能提高PCR的效率，增加PCR反应的产量。当SWNTS浓度过高时，因其对PCR反应成分的过多连接而破坏了DNA，Tag酶以及引物的反应条件，从而抑制了PCR反应。而且通过X-射线电子光谱图分析发现，在PCR反应后，SWCNTS的结合能增加，说明其与DNA模板、Taq聚合酶发生了强烈的反应，SWCNTS与PCR各反应成分发生了电子转移，充当了电子受体和聚合酶的稳定剂。 2.4.2 纳米碳粉对PCR体系的影响 Zhang等34发现纳米碳粉（CNP）的水悬浮溶液能提高重复PCR和长片段PCR扩增的特异性。在没有CNP的情况下，重复PCR在第4轮扩增就开始出现非特异性条带。第5和第6轮扩增出现了明显的拖尾，几乎没有目标条带。而加入适量的CNP悬浮液后，PCR即使到了第6轮扩增也能得到单一的目标条带。同时，在长片段PCR扩增中加入CNP悬浮液可以使拖尾现象显著减少，非特异条带逐渐消失。但是，CNP的浓度必须在一定范围内才会有效，浓度太低不能有效提高PCR的特异性，浓度过高又会抑制PCR反应。原子力显微镜结果说明CNP与双链DNA之间存在潜在的结合力，因此反应的机理可能是这种结合力减少了引物与DNA模板之间的错配以及引物二聚体的产生，因而可以提高PCR的特异性。但过高浓度的CNP会产生过高的结合力，又会阻碍PCR的反应。但是CNP对PCR有这样的影响，还有可能是CNP与DNA聚合酶发生了相互作用，反应机理尚需进一步探讨。 2.4.3 富勒烯（C60）对PCR反应的抑制作用 张捷等35研究了富勒烯(C60)对PCR的影响。随着C60浓度的增加，PCR扩增被显著抑制。C60一方面会抑制DNA聚合酶的活性，且浓度越高，抑制作用越大，另一方面又会损伤DNA单链模板，降低DNA单链模板起始浓度，从而造成PCR产物量的降低。他们认为，这是C60与DNA聚合酶的酶活性位点发生了相互作用，导致DNA聚合酶活性降低，同时C60还会结合到DNA单链模板上，干扰引物、底物与模板之间的精确配对，另外，C60可在PCR实验条件下活化生成多种活性氧或自由基，进而造成DNA聚合酶构象的改变以及DNA模板的损伤，抑制了PCR反应的进行。 2.5 半导体纳米材料对PCR体系的影响 Nie等36发现表面带氨基的SiO2包覆的四足状ZnO纳米结构能提高PCR扩增的产量。由SiO2包覆的四足状ZnO，当表面有氨基修饰并且加入量由0.01 g逐渐增大到0.5 g时，PCR产物的量不断增多；当加入量0.5 g时，PCR产物的量却不再增加。表面修饰了氨基的ZnO纳米结构在一定浓度范围内能提高PCR扩增的产量。当表面没有氨基修饰，ZnO纳米结构的量0.06 g时，PCR产物的量变化不大；而当ZnO纳米结构的量0.12 g时，PCR产物的量减少。其反应机理还不明确。 Wang等37考察了表面修饰了羧基的CdTe量子点对PCR体系特异性的影响。实验结果表明，在不同的退火温度下，CdTe量子点能提高PCR体系的特异性，而且在扩增短片段时，量子点对PCR体系特异性的提高比扩增长片段时提高的更明显。同时，CdTe量子点不能提高PCR的效率。CdTe量子点可以作为常规PCR的优化因子，尤其是对多重PCR，因而可以拓宽PCR的应用范围，同时也对基因诊断具有重要的意义。他们认为反应机理可能有两方面：（1）与金纳米粒子相似，CdTe量子点模拟了体内DNA复制过程中单链结合蛋白SSB的作用，选择性地结合了单链DNA，从而显著降低了DNA复制过程中引物和模板的错配，有利于提高PCR的特异性；（2） CdTe量子点可能与DNA聚合酶发生了相互作用，聚合酶吸附到量子点的表面，使PCR体系中聚合酶的有效浓度降低，从而有利于目标产物的产生，提高了PCR的特异性。但随着量子点的不断增多，聚合酶浓度不断降低，当聚合酶浓度小于特异扩增需要的有效浓度时，量子点的加入又会对PCR产生抑制作用。 另外，还有不少学者研究了半导体纳米材料对PCR体系的抑制作用。早期有学者将微米级的硅颗粒以及表面经过处理的硅加入到PCR体系中38，39，发现微米级的硅对PCR过程有较明显的抑制作用。王玮等40将纳米级的硅引入PCR体系中，探讨了表面氧化程度不同的硅纳米颗粒对PCR扩增的抑制作用及其机理。实验结果表明，随着硅材料表面积与PCR反应体系体积比的增大，核酸扩增效率明显下降；并且在所研究的范围内，表面氧化程度越高的硅纳米颗粒对PCR的抑制作用越强。对抑制作用机理的初步研究表明， 硅纳米颗粒对PCR反应液中Taq酶的吸附是导致抑制现象产生的主要原因。而对模板的吸附对PCR的影响较小，而且，硅纳米颗粒本身对PCR没有明显的直接化学抑制作用。 李世强等41考察了在避光条件下，锐钛矿型纳米TiO2对PCR体系的影响，结果表明，纳米TiO2对PCR体系有抑制作用。随着纳米TiO2量的增加，对DNA合成的抑制也越强，且抑制作用强于微米级的TiO2。将预先分别与纳米TiO2作用的聚合酶、引物和模板加入到PCR体系中，聚合酶的上层清液、引物的沉淀、模板的上层清液与沉淀均有 DNA的合成，但合成量均小于纳米TiO2直接加入PCR的DNA的合成量。他们认为在避光下，锐钛矿型纳米TiO2抑制DNA合成的主要原因是纳米TiO2具有高的比表面积，对聚合酶、引物和模板存在较强的吸附作用， 对引物的吸附作用最强，对聚合酶的吸附最弱。 3