2型糖尿病大鼠心肌中HGF的表达及替米沙坦的干预作用.doc

替米沙坦对糖尿病大鼠肝细胞生长因子的影响 王小华，殷士良，赵玉萍，刘晓峰，赵春艳，周凤娟河北省唐山市滦县人民医院 内分泌科 河北 滦县 063700摘要: 目的 探讨替米沙坦对糖尿病大鼠肝细胞生长因子的影响。方法 雄性SD大鼠40只,单纯随机分为：正常组(C组), 糖尿病模型组(D组),替米沙坦干预组(T组)。D和T组高糖高脂饲料喂养4周后以25mgkg链脲佐菌素（STZ）尾静脉一次性注射，C组常规饲料喂养4周后以等剂量的枸橼酸盐尾静脉注射。给予STZ后一周， T组给予替米沙坦8.34 mgkg/d，C和D组等剂量温水灌胃。所有大鼠继续原饲料喂养，给药l2周末结束实验。双抗体夹心ELISA法和western blot法分别检测血清和心肌中HGF的表达。结果 血清和心肌中HGF水平D组，T组高于C组 ，T组高于D组。结论 替米沙坦能够增加糖尿病大鼠HGF的表达。关键词：2型糖尿病；心肌；肝细胞生长因子；替米沙坦Effects of telmisartan to Expression of hepatocyte growth factor in type 2 diabetic ratsWangxiaohua, Yinshiliang, Zhaoyuping, Liuxiaofeng, Zhaochunyan, ZhoufengjuanDept. of Endocrinology, People Hospital, Luan County，Tangshan City, Hebei Province, Luanxian 063700, China王小华，女，河北省唐山市滦县人民医院，硕士。通讯地址：河北省唐山市滦县人民医院内分泌科，063700，联系电话E-mail:Abstract: Objective To explore the effects of telmisartan to hepatocyte growth factor (HGF) in type 2 diabetic rats. Method Forty male SD rats were randomly divided into the normal group (C group), diabetes model group (D group), telmisartan intervention group (T group). Rats of D and T groups were injected by the tail vein with streptozotocin(STZ) 25mg/kg after 4- week fed with high calorie diet; C group were injected by the tail vein with the same volume citric acid buffer after 4- week fed with common diet. After 1 week injected the STZ, rats of T group were given with telmisartan 8.34 mg/kg/d and rats of C, D groups with the same volume water. The experiment ended until l2 weeks given telmisartan. Blood samples were obtained to measure the levels of HGF by double-antibody sandwich ELISA method, The semiquantitative expressions of HGF protein of myocardium were determined by western blot method. Results The levels of HGF of serum and myocardium of D, T groups were evated statisically significant compared wiht C group; The levels of HGF of T groups were evated statisically compared wiht D group. Conclution Telmisartan can increate expression of HGF in type 2 diabetic rats. Key words： Type 2 diabetes mellitus; Myocardium; Hepatocyte growth factor; Telmisartan糖尿病心肌病变是糖尿病慢性并发症之一，独立于冠状动脉粥样硬化之外，以微血管为主要病理改变的心肌病变1。可能与心肌细胞能量代谢紊乱，细胞功能改变，凋亡增加，促使心肌纤维化的一些细胞因子和炎症因子异常表达有关。HGF通过抗凋亡，促血管新生，修复内皮细胞等方面对心肌具有保护作用。但提高心肌中HGF的表达，目前多采用外源性注射，由于其半衰期较短且价格昂贵，在治疗方案的选择上仍然存在较大分歧。替米沙坦是一种新型的AT1拮抗剂，在2型糖尿病心肌中能降低TGF-1的表达，从而对糖尿病心肌起保护作用,但能否升高HGF国内外少见报道。实验通过复制2型糖尿病动物模型，探讨替米沙坦对糖尿病大鼠血清和心肌中HGF表达的影响。材料和方法1 材料1.1 实验动物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重(18020)g，由实验动物研究中心提供。批号：SCXK(辽)2003-0007。饲养条件为温度1825，相对湿度为40%60%，34只为一笼，自由饮水。1.2 试剂 链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ,Sigma公司)。替米沙坦（美卡素，德国勃林格殷格翰公司）。血清HGF试剂盒(双抗体夹心ELISA法,上海森雄科技实业有限公司)。兔抗大鼠多克隆HGF抗体(武汉博士德公司)。1.3 实验仪器 EIO-RAD电泳槽及电泳仪 美国RAD公司2 方法2.1动物模型复制雄性SD大鼠40只,单纯随机分为正常组(C组，n10),糖尿病模型组(D组, n15),替米沙坦干预组(T组, n15)。D组和T组高糖高脂饲料喂养4周后，分别以25mgkg链脲佐菌素(STZ)尾静脉一次性注射，注射1周末测非禁食血糖16.7 mmolL，且有多饮、多食、多尿现象，为2型糖尿病大鼠3。C组大鼠10只常规饲料喂养4周后,以等体积的枸橼酸盐缓冲液尾静脉一次性注射。造模成功后T组给予替米沙坦8.34mg/kg/d(相当于人80mg/d), C组和D组用等剂量温水灌胃。所有大鼠继续原饲料喂养12周结束实验。每两周测非禁食血糖一次,N组随机血糖7.8mmol/l,D和T组随机血糖16.7mmol/l排除实验。2.2标本制备 实验结束时, 分别将各组大鼠用20乌拉坦(0.5ml/100g)腹腔注射麻醉,心内采血测HGF;取左心室游离壁中部组织, western blot备测心肌HGF。2.3血清HGF测定: 测完心功能后,自心内采血3毫升,放置离心管中离心，3000转/分,10分钟,吸出血清置EP管中,双抗体夹心ELISA法测血清中HGF。操作严格按说明进行，应用芬兰生产的Wellscan MK-3型酶标仪测OD492值，根据不同浓度标准血清的OD492值作标准曲线，计算待测标本血清HGF浓度。2.4 取左室心尖部心肌组织黄豆粒大小,用PBS 缓冲液洗净, 样本剪碎,匀浆, 应用BCA法，酶标分析仪测定各样品的吸光度,根据标准曲线计算出各样品总蛋白浓度。电泳,转膜,杂交,显色,利用Gene Genius生物图像凝胶分析仪测定目的蛋白条带亮度，以-actin作为内参照。并以对照组样品条带亮度为100，计算出各样品的相对值作为各蛋白质的相对表达量。本实验重复3次。3 统计学处理数据均采用SSPS 13.0统计软件包处理。定量资料以均数标准差(s)表示，多组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较用S-N-K检验，P0.05认为有统计学差异。结果各组空腹血清和心肌HGF的比较与C组比较，D，T组血清和心肌HGF表达量升高；与D组比较，T组血清和心肌HGF显著升高(见表1,表2)。表1各组血清HGF(pg/ml)和心肌中HGF（n=3)比较组别HGF(pg/ml)组别HGFC 组(n=9)35.33.17C 组(n=3)1.000.00D 组(n=7)149.86.10 aD 组(n=3)2.730.07aT组(n=8)194.66.01 a,bT组(n=3)3.590.09a,b注：C组：正常对照组；D组：糖尿病模型组；T替米沙坦干预组。与C组相比，aP0.01；与D组相比，bP0.01。表2空腹血清HGF各对比组的q值和P值对比组q值q界值(P=0.01)P值C与D62.454.02P0.01C与T90.044.64P0.01D与T23.724.02P0.01 讨论 HGF是一种多功能的多肽，通过抗凋亡和抗纤维化、保护心室重塑促进新血管形成参与糖尿病性心肌病的保护作用。目前有关HGF与糖尿病的关系尚存在争议。研究发现3高血糖环境里过氧化状态促进增多的低密度脂蛋白形成具有细胞毒性的氧化型低密度脂蛋白，后者诱导白细胞介素-1及肿瘤坏死因子的表达，这些炎症因子能进一步使HGFmRNA的表达升高。研究发现4-5HGF转基因可缓解心功能障碍及缺血再灌注损伤。扩张型心肌病大鼠给予HGF转基因治疗后，发现大鼠心肌纤维化程度及心肌细胞凋亡程度均有所减轻6。Nobuaki7等发现利用血管紧张素转化酶抑制剂和Ang受体-1阻断剂治疗6周后，心脏、血管局部的HGF含量明显上升。给予HGF可部分抑制Ang的作用，Ang可使各脏器局部的HGF合成分泌减少，给与Ang1型受体拮抗剂治疗后，HGF合成分泌增多，Ang是HGF的强抑制剂。HGF在糖尿病中的浓度变化趋势可能是在病程早期，机体为了代偿心肌纤维化和心肌细胞凋亡，产生大量HGF，随着病程进展，HGF失代偿又有所降低。同时糖尿病组中由于Ang表达增加，抑制HGF使心肌中表达减少。李虎英等8发现1型糖尿病大鼠心肌组织于12周TGF-1表达明显增加，HGF的表达出现下降,考虑TGF-1和HGF的失衡可能参与了糖尿病心肌病的发生发展过程。替米沙坦可能通过抑制Ang而解除对HGF的抑制，使心肌中HGF升高。至于HGF抑制纤维化的具体机制尚未十分明确，可能通过抑制TGF-19，CTGF这些下游因子拮抗Ang的作用。另外由于Ang引起的血管内皮损伤或心肌损害通过恢复后的HGF得到改善，对糖尿病心肌起保护作用。在实验中糖尿病模型组HGF的产生明显受到抑制而降低，替米沙坦干预组中被抑制的HGF有所恢复而高于糖尿病模型组。考虑可能与升高心肌中HGF蛋白表达有关。胡钢英等10研究发现用缬沙坦后，抑制了Ang的作用，Ang对HGF的负性调节作用减弱，HGFmRNA的表达水平增高，增高的HGF，又可通过抑制TGF-1，即抑制胶原的合成途径，刺激基质金属蛋白酶-1的活性，即诱导胶原的分解途径，从而使胶原的合成量减少,对心肌起保护作用。综上所述，替米沙坦可以升高糖尿病大鼠血清及心肌HGF。替米沙坦诱导的HGF生成恢复对糖尿病心肌功能的修复可能起到重要作用，为替米沙坦在糖尿病心肌病变治疗和一级预防中提供一个新的依据。参考文献1 Hamby RI, Zoneraich S, Sherman L. Diabetic cardiomypathy. JAMA 1974, 229 (13)：1749-54.2 周迎生,高妍,李斌，等高脂喂养联合链脲佐菌素注射的糖尿病大鼠模型特征 中国实验动物学报，2005,13(3)：154-158.3 于晓华,张锦,周一军,等. 2型糖尿病合并大血管病变患者肝细胞生长因子水平观察中国综合临床2006,22（2）：140-142.4 Esaki M, Takemura G, Kosai K, et a1. Treatment with an adenoviral vector encoding hepatocyte growth factor mitigates established cardiac dysfunction in doxorubicin-induced cardiomyopathy. Am J physiol Heart Circ Physiol, 2008, 294(2): H1048-57.5 Chen XH, Minatoguchi S, Kosai K, et a1. In vivo hepatocyte growth factor gene transfer reduces myocardial ischemia-reperfusion injury through its multiple actions. J Card Fail, 2007, 13(10): 874-83.6 Tang Q, Shen D, Huang Z, et a1. Potential role of N-cadherin in hepatocyte growth factor (HGF) mediated improvement of the cardiac function of dilate