叶绿体的提取及ATP酶活性的测定

叶绿体的提取及ATP酶活性的测定 摘要：在本实验中通过测定常青藤叶片组织中叶绿体的含量以及ATP酶的活性，间接的探讨该植物的光合作用强度。关键字：叶绿体 ATP酶活性 光和作用前言 叶绿体是植物细胞中由双层膜围成，含有叶绿素能进行光合作用的细胞器。组织中叶绿体的含量多少，能够间接的反应植物在这一段时间内的光合作用强度，ATP是三磷酸腺苷，ATP的分子式可以简写成A-PPP，简式中的A代表腺苷，P代表磷酸基团，代表一种特殊的化学键，叫做高能磷酸键。ATP的水解实际上是指ATP分子中高能磷酸键的水解。高能磷酸键水解时能够释放出大量的能量，ATP分子中大量的化学能就储存在高能磷酸键中。试验中通过测量ATP水解出来的P+，通过这种循环往复的电子传递实现了光能向化学能的转化，在这一过程中叶绿体起到了至关重要的作用。1. 实验材料与方法1.1 实验材料 小麦幼苗 离心机 水浴锅 分光光度计 烧杯 容量瓶 试管 移液枪 铝纸 蒸馏水等 STN缓冲液 无机磷标准液 37水浴锅、照光设备（光源50000Lx）、台式低温冷冻离心机（配套的离心管）及冰箱、研钵、移液枪全套、小漏斗、容量瓶（500ml、100ml）等。1.1.1 试剂： Tris-HCl缓冲液1mol/L（pH8.0）：称60.57g Tris溶于400ml蒸馏水中，用浓盐酸调至pH8.0，再加蒸馏水至500ml。10硫酸钼酸铵溶液：称10g钼酸铵溶于100ml5mol/L 硫酸中5mol/L 硫酸溶液：取27.8ml（比重1.84）浓硫酸，慢慢加入到70ml蒸馏水中，冷却后定容至100ml。STN缓冲液，将0.05mol/L Tris-HClpH7.8缓冲液（内含0.4mol/L 蔗糖、0.01mol/L NaCl)放入冰箱中预冷。硫酸亚铁钼酸铵试剂：称14.2857g硫酸亚铁，加入7.14ml硫酸钼酸铵，再加蒸馏水稀释到100ml，直至溶解为止（由于亚铁极易被氧化，因此要先配现用）。1.1.2 材料及预处理 取新鲜的干净植物茎叶于光照培养箱（光照22）处理30min，随后移入冰箱冷处理10min，待用。1.2 试验原理 ATP酶可催化ATP水解生成ADP及无机磷的反应，在生物学研究中，常通过测定酶促反应释放的无机磷量或ATP的减少量以及pH变化等来测定这一生理反应中ATP酶的活力高低。本实验通过测酶促反应过程中无机磷的释放量来测定叶绿体偶联因子ATP酶的活力。1.3 试验步骤1.3.1 叶绿体的制备及叶绿素含量测定 准备好的试样，用去除叶柄和中脉同时用剪刀剪碎，准确称取4.17g，置于是事先在冰箱中处理的研钵中，加入10ml预冷的STN缓冲液，很快研磨或捣碎（0.5min完成，研磨的手法了力度要适当，过轻过重均会导致实验的失败），使之成为匀浆，以四层纱布过滤去粗渣，滤液于02下，1500g离心约5min。去除将上清液，加入少许（0.3ml）STN（pH7.8）于沉淀中配成叶绿体悬浮液（使叶绿素的含量在0.5mg/ml左右），待用。1.3.2 叶绿素含量的测定取从上述悬浮液0.1ml，加0.9ml水和4ml95%的乙醇于干净的试管中于652nm测其吸光度（吸光度值因保证在0.34以上才有意义），吸光度事先用95%乙醇标定调零并按Arnon公式计算：叶绿素含量A65210005/(34.510000.1)A6521.45mg/ml；式中：A652652nm处的吸光值；经测定实验的叶绿体吸光度值为0.698，因此，具有继续测定ATP酶的意义。1.3.3 ATP酶的激活激活过程：将上述经检验符合要求的试液，加入一定量的STN（pH7.8）配成4ml的悬浮液（实验在检验的基础上加入STN3.8ml），震荡并置于于照光设备（白炽光50000Lx）22下进行光激活6min。反应过程：取三支干净的试管，编号（分别为对照、处理1、处理2）分别加入上述激活后的叶绿体悬浮液各1ml，再加入1ml的反应液，用1ml蒸馏水作对照。将三支试管置于37水浴中保温10min，快速顺次（以先放先加为原则）加入0.5mlTCA终止液。比色阶段：再在上述试液中加入1ml显色液，充分震荡。在事先用STN标定调零的655nm波长下比色，测其吸光值，结合标准曲线，求其无机磷的含量；2.实验结果与分析2.1叶绿素含量的测定在实验开始时确称取新鲜植物叶片4.17g，经叶绿素测定器吸光度值为0.750，符合实验要求，按Arnon公式计算：叶绿素含量A65210005/(34.510000.1)A6521.45mg/ml；得叶绿素含量为1.0875mg/ml0.5mg/ml，符合实验要求：叶绿体悬浮液中叶绿素的含量在0.5mg/ml左右，实验具有可操作性，能够经行下一步的测量。 试验中取6支试管编号，1-6号管分别加入无机磷标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml及蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再加入0.5ml终止液和1ml显色液，混匀后于655nm出测定吸光值，绘制吸光值-无机磷含量标准曲线。2.2 叶绿体ATP酶活性的测定表2 在655nm下测得的吸光度的测定值编号123平均对 照0.7400.7350.7450.740处理10.8450.8460.8470.846处理20.8250.8250.8130.821在实验中常常用单位时间单位质量无机磷物质的量的多少来间接反映ATP酶活性的高低，所以通过测定无机磷的的含量，来确定ATP酶的活性，为实际的农业生产提供理论指导。表3 ATP酶活性指数的测定数据表Table 3：The ATP enzyme vigor index measured value 吸光度值对应的Pi含量/ug测得的有效Pi含 量/ugATPase活力/umol.(mg.h)-1处理0.7453.005360.2148310对照0.6872.28503：讨论ATP 酶的活性与光合磷酸化活性的关系非常密切,如果 ATP酶活性下降,则光合磷酸化活性下降,叶片中ATP含量减少,这样势必影响到叶片的光合作用速 率。可见ATP酶活性与光合作用的关系是紧密相连的。经过光照预处理的植物叶片，最终测得的叶绿体的酶活力为312umol/(mg.h)。叶绿体将光能转化为活跃的化学能, 并贮存在ATP中,产生的ATP的数量就越多, 为光合作用的暗反应提供的“同化力”就越多, 有利于光合作用CO2的固定和同化, 产生较多的光合产物, 从而其光合效率高。参考文献1李良壁,张正东,谭光辉等.植物叶绿体互补作用的研究.遗传学报,1978,3: