southern杂交标准步骤.doc

1、 试剂的选用和配置：不同种类的尼龙膜其所采用的转移缓冲液和洗膜液不同。本实验标准采用带正电荷的尼龙膜。变性液/碱性转移缓冲液（应用于带正电荷尼龙膜的碱性转移）0.4mol/L NaOH1mol/L NaCl配2母液1L。中和缓冲溶液（只用于碱性转移）0.5mol/L Tris-Cl (pH 7.2)1mol/L NaCl20SSC800ml H2O溶解175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，用几滴14mol/LHCl调pH至7.0，用水定容至1L。分装后高压灭菌，试剂终浓度为3.0mol/L NaCl和0.3mol/L柠檬酸钠。10%(m/V) SDS配制时68加热助溶，浓盐酸调pH至72，定容室温保存。（pH极易调过，需小心！）二、技术操作步骤：、DNA酶切和低压电泳：概述：酶切所需DNA的量为10g30g，所需限制性内切酶量为10Unit酶/1g DNA，neb公司的限制性内切酶的最佳酶切条件为50l体系酶切12gDNA。为了避免型号活性，注意所加酶的甘油含量和盐分含量（glycerol concentration 5%, or pH 8.0 may result in star activity酶储液含50% glycerol，因而酶最大用量不能超过酶切体系的10%），同时，选择内切酶时要注意其可能因甲基化的敏感性导致基因组酶切效果不好。1、400l的酶切反应体系：（1030g）30 g DNA 酶300 U 37酶切16h。电泳检测酶切效果。1/10体积（40l）3mol/L醋酸钠2.5倍体积的冷无水乙醇（或0.61倍体积的遇冷异丙醇）-20沉淀DNA，70%乙醇洗涤沉淀，溶解于25l 1TE。2、荧光定量测定浓度后，加入5l 6上样缓冲溶液，56水浴5min，迅速置于冰上2min，以破坏粘性末端可能形成的碱基对。1TAE或0.5TBE电泳缓冲液和0.8%的琼脂糖凝胶以小于1V/cm的电压电泳12h。由于DNA在凝胶中会扩散，因而最好不要将凝胶放置超过一天。（楼下电泳仪一般用30V）3、修去凝胶边缘和加样孔上不平整的无用部分，加样孔端朝下，凝胶左下角Marker侧，切去一小三角，作为凝胶方位的标记。对于大于15kb的条带，可采用将凝胶置于0.2mol/L的HCl中数分钟，直到溴酚蓝变黄，二甲苯青变成黄色/绿色后，迅速将HCl倒入废液缸，去离子水洗涤数次。（强酸导致DNA脱嘌呤，而有利于转膜。但是，过度会导致DNA断裂成较小片段。）、DNA的变性、转膜装置组装和转膜：1、带电荷的尼龙膜：将凝胶浸入数倍体积的碱性转移缓冲溶液中，室温振荡15min。更换一次碱性缓冲溶液继续浸泡20min。2、切一张每边比凝胶大1mm的尼龙膜，并剪两张同样大小的厚吸水纸。（注意：需带一次性PE手套和钝头镊子，沾有油污的膜不易浸湿。）3、将膜飘浮于盛有去离子水的平皿中，直到其完全浸湿后，将其浸入适当的转移缓冲溶液中至少5min，用干净的解剖刀切下膜的一角，与凝胶所切下的角一致。（注意：膜的浸湿完全与否，对DNA的转移至关重要。浸湿的膜可保存在高压的2SSC饱和的3MM滤纸中，4保存。）4、将一张厚的吸水纸放在一片树脂玻璃板或平皿上，形成比凝胶长且宽的支持物。将支持物或皿放入一个大的干烤皿中，吸水纸两端从板边缘垂下。5、干烤皿中加入适当的转移缓冲液，直到液面几乎与支持物表面平齐。当支持物上的吸水纸完全浸湿后，用玻璃棒赶走吸水纸下的气泡。6、将凝胶从变性液/碱性缓冲液中取出，倒转使原来的底面向上。放在支持物上，并位于吸水纸中央。用玻璃棒赶走凝胶与吸水纸间的气泡。7、用Parafilm膜包绕凝胶四周，不要覆盖凝胶。以屏蔽转移缓冲液从凝胶周围短路流入吸水纸。8、用适当的转移缓冲溶液将凝胶湿润。将湿润的尼龙膜放置于凝胶上并使两者的切角相重叠。为避免产生气泡，当先使膜的一角与凝胶接触再缓慢的将膜放到凝胶上。膜的一边应恰好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。膜一旦放在凝胶上就不要再移动了。9、在尼龙膜上放置两张与膜大小相同的吸水纸，切一叠略小于吸水纸的纸巾（58cm高），将纸巾放在吸水纸之上，在纸巾顶部放一块玻璃板然后用一400g重物压实。10、转移824h，当纸巾湿润后更换新的纸巾。11、除去凝胶上的纸巾和吸水纸，翻转凝胶以及与之接触的尼龙膜，凝胶向上平放于干燥的吸水纸上。用极软的铅笔或圆珠笔标记加样孔的位置。12、将凝胶从膜上剥离，弃去凝胶。13、紫外成像检测凝胶上DNA的残留量，用以确定转移效率。、DNA的固定：带正电荷的尼龙膜的碱性转移：碱性缓冲溶液会使DNA共价结合于带正电荷的尼龙膜上，因而不需要固定，直接将膜浸入中和缓冲溶液，室温15min。浸泡以除去膜上的凝胶碎片，同时使膜中和。不带电荷的中性尼龙膜的中性转移：1、将膜浸入6SSC，室温放置5min，以除去粘附在膜上的凝胶碎片。2、真空烘烤固定：将膜从6SSC中取出，并使多余的液体流净。将膜放在纸巾上室温晾干30min，将膜夹在两张干燥的吸水纸中间，真空炉中80烘烤2h。 微波炉烘烤固定：将潮湿的膜放在一张干燥的吸水纸上，将微波炉调到最大功率（750900W）对膜加热23min。（直接进行杂交，或将膜干燥后吸水纸中保存） 紫外照射交联：将潮湿的膜放在一张干燥的吸水纸上。254nm的紫外线照射使DNA交联到膜上。（其原理是紫外线照射使DNA中的一小部分胸腺嘧啶残基与膜表面带正电荷的氨基基团之间形成共价交联，但过量照射将导致大部分的胸腺嘧啶共价结合而降低杂交信号。同时，紫外线照射可能增强某些带正电荷的尼龙膜的杂交信号背景，因而应当使膜上带有DNA的一面朝向紫外。建议对潮湿的膜采用总量1.5J/cm2，干燥的膜采用0.15J/ cm2。）3、对于不立即用于杂交的膜都应充分干燥，松弛的包于铝箔纸或吸水纸中，室温下最好保存在真空条件。或待膜冷却后，用保鲜膜包好以后保存在-20备用。地高辛显色系统方案：、探针的合成：（300bp1kb）一、PCR法标记探针：概述：为了减少探针的非特异性扩增，最好不要以基因组DNA为模板直接合成探针。需要对合成探针的片段进行PCR扩增并胶回收目的片段，回收后浓度一般为2040ng，可做为探针合成模板使用。 PCR法合成探针采用莱伯克生物科技公司的DIG DNA标记试剂盒，引物浓度为10pmol/l，反应体系为：正向引物（50100pmol） 5l反向引物（50100pmol） 5lcDNA模板（1020ng/l） 1 l 10 PCR缓冲溶液 2lMgCl2 2lDig-dUTP标记混合物 2lH2O XlTaq DNA聚合酶 0.5lTotal: 20lPCR反应程序：94 4min94 30s60 30s72 1min30s72 10min4 紫外分光光度计测浓度后，保存在-20。（DNA探针杂交需525ng/ml，RNA探针杂交需100ng/ml，寡核苷酸探针，0.110pmol/ml。CDP-star为底物时，探针浓度应减少一半。）经验量：取5l电泳，条带清楚的话，每次杂交需23l。500ng/l的探针。、杂交：概述：标准杂交液的杂交温度在6568，加有50%的formamide的杂交液或High SDS Buffer的杂交温度为3742。1、探针变性：95煮沸5min（PCR仪中操作），立即置于冰上5min。2、将膜放入杂交管中，DNA一面朝里，不能有气泡。3、加入65预热的Hyb高效杂交液（美季）5ml（0.1ml/cm2），65 815转/min预杂交1h。4、倒出预杂交液，另取适量预热的高效杂交液（5ml），加入变性的探针混匀（此步可以用1ml的杂交液将探针稀释后再加）。加入杂交管中，65杂交过夜20h。洗膜：1、取出杂交管，倒弃杂交液至废液缸中，夹住露出瓶口的膜的一角将多余的杂交液晾干。2、将膜没入含有数百毫升的2SSC及0.5%SDS的皿中，室温轻轻振荡5min。切忌将膜干燥！3、将第一次洗液倒入废液缸中，加入数百毫升2SSC及0.1%SDS。室温下放置15min，期间轻轻振荡数次。4、将浸泡的溶液换成数百毫升新鲜的含有0.1%SDS的0.1SSC。65下放置30min1h。并轻轻振荡。5、室温下，0.1SSC洗去膜上的泡沫。显色：概述：NBT（四唑硝基蓝）为碱性磷酸酶的最佳底物之一，在碱性磷酸酶催化下，BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐）被水解，BCIP脱磷并聚合而变蓝，过程中放出的H+使NBT还原形成不溶性深蓝色的NBT-Formazan。 一般Dig1配置900ml后600ml用于配Dig3，100ml配Dig2（需加热溶解），Dig5配200ml，Dig6显色配50ml。1、Dig1 冲洗膜面 1/10体积的10Dig1 Buffer2、Dig2封闭1h 1% digoxin block reagent in Dig1 （需提前65加热溶解）3、Dig3 洗涤30min 1% BSA和0.3% Triton-X 100 in Dig14、Dig4 杂交2h 1:2000 anti-dig-AP in Dig3(现用现加)5、Dig3 洗涤4次 每次10min6、Dig1 冲洗并洗涤10min7、Dig5 冲洗并洗涤10min 1/10体积的10Dig5A和1%的六水和氯化镁 in water8、Dig6 锡箔纸包裹避光4显色过夜（切勿振荡）1/50体积NBT和1/50 BCIP in Dig5（NBT和BCIP有毒，应戴手套操作。）9、蒸馏水冲洗终止显色后保鲜膜包裹扫描。不要显色过头。10、1525干膜存放，其颜色会减淡，可在TE溶液中湿润。生物素显色系统方案：采用North2South Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit探针标记试剂盒。、biotin标记探针按照说明书上操作。、预杂交 将4取出的North2South Hybridization Buffer放置至室温。 将膜放入杂交管中，加入杂交液0.1ml/cm2膜。 DNA在55下孵育至少30min。、探针变性 100加热探针10min后，迅速放在冰上5min，变性探针。、杂交 预杂交后，加入变性的生物素标记探针。（约30ng/ml杂交液） 55杂交过夜。、严格洗膜 将North2South Hybridization Stringency Wash Buffer(2)37水浴溶解。 待Wash Buffer完全溶解后，加入等体积的ddH2O稀释为1Buffer。（含有2SSC/0.1 SDS） 0.2ml/cm2膜的1Strigency Wash Buffer 55洗1520min，共洗三次。、亲和素杂交注意用干净的镊子夹起膜的一角，不要夹其他部位，并用乙醇冲洗镊子。 到出Strigency Wash Buffer，加入足够的Blocking Buffer（至少0.25ml/cm2膜），室温孵育15min30min。 以1:300倍稀释的比例加入Streptavidin-HRP到杂交管的底部的Blocking Buffer，注意不要与膜接触，摇动杂交管，待混匀后，室温孵育15min。 ddH2O稀释Wash Buffer（4）为1。洗膜4次，每次5min，室温。 将膜转入干净的平皿中，加入Substrate Equilibration Buffer（0.25ml/cm2膜），室温平衡5min。、显影： 1:1体积