分子技术在玉米遗传育种中应用的研究进展.doc

微生物遗传育种技术应用的研究进展摘要：本文主要介绍了遗传育种的几种技术，重点介绍了分子标记技术在遗传育种中的应用，分别又介绍了AFL P、RAPD、RFL P 和SSR 分子标记技术在遗传育种中的优缺点1，以及对目前分子标记用于育种存在的问题及解决方法进行了叙述。关键词：辐射与化学诱变选系法 离子注入法 分子标记技术 微生物学作为应用微生物学的一部分, 具有很强的应用性。当代生物技术特别是发酵工程技术的最终产品一般都是经过工业微生物生产得到的, 已取得了举世瞩目的经济效益和社会效益。20 世纪70 年代以来, 重组DNA 技术和原生质体融合技术开始用于菌种选育。各种外源基因在原核生物、真核细胞的克隆和表达研究取得了重大成就。使工业微生物育种技术进入了真正意义的分子水平育种时代。一、获取优良菌种的有效途径广义上说：菌种改良可描述为采用任何科学技术手段( 物理、化学、生物学、工程学方法以及它们的各种组合)处理微生物菌种3, 从中分离得到能显示所要求表型的变异菌种。菌种改良的基本途径: 突变和选择、 基因重组( 遗传重组) 、基因工程( 遗传工程) 和分子标记技术。二、常规选育法这种选育方法就是在一个分离的原始群体中选择个体自交系，经若干世代按目测自交选择之后，进行配合力的测定，最终选出优良的自交系。常规选系法的问题是早期入选的规模很难界定。目前，有的育种者在早期世代不分穗行种植，而是将入选的果穗的等量混合种植，到晚代才严格选择单株种成穗行，进行配合力测定。这种方法有效地增加了入选基因型的数目，同时增加了对单株的选择压力，可能对提高抗性和获得目标基因型有帮助。在育种规模不大的情况下，常规选育法，更多地依靠育种者的经验。三、单倍体选系法利用自然诱发、培育的单倍体植株经过人工的染色体加倍或自然加倍获得纯合的二倍体，然后再从中选育优良的单株，成为自交系。单倍体育种一般只需两年就能获得纯合的自交系，比常规方法缩短了育种的周期，对育种家有很大的吸引力。不过，单倍体选育省略了大田选择的步骤，对诸如抗性等性状通常还要进行加倍的选择。四、辐射与化学诱变选系法辐射诱变选系法是利用放射性同位素产生的辐射能量甚至宇宙射线诱发染色体产生结构变异或等位基因突变，根据表型变异选择有用的个体育成自交系。此种方法的诱变机理主要以损伤恢复，在恢复过程中发现有利的变异，因而在选择原始材料上要兼顾遗传基础丰富和抗损伤能力强，在选系过程中要注意淘汰各种畸形株和不利变异，选择突变性状明显的健康的植株。这种方法近年来被有些人移植为航天育种或太空育种。五、离子注入法离子注入也是一种新的诱变方法。国外自六十年代中、后期相继把离子注入技术应用于生物学领域的研究。我国在1986 年由中国科学院等离子体物理研究所余增亮等首次将氮离子注入水稻, 发现了离子注入对生物的诱变效应, 开辟了诱变育种的新途径。低能离子生物学在短短的十几年里取得了较大的进展。由于目前研究水平和研究手段的限制, 低能离子生物学的研究主要侧重于对离子注入引变机理的探索和对生物效应的研究两方面。低能重离子在生物诱变育种中的轻损伤、高突变率、突变谱广、安全等特点已逐渐为科研工作者所共识He2+ 、N + 、A r+ 、A r13+ 、Zn2+ 、Fe+ 、C5+ 、C4+ 等重离子被广泛试用于红霉素生产菌、之江菌素、纤溶酶、纤维素酶分解菌、糖化酶生产菌、维生素C、花生四烯酸生产菌等微生物中, 并取得了可喜的经济效益和社会效益。向砥(2002) 等用低能N + 注入壮观链霉菌(治疗淋病用抗生素M -141 产生菌) , 效价较出发菌株提高102. 3% , 培养时间比原菌株缩短48h。浙江农科院微生物研究所研究用离子束辐射糖化酶生产菌, 仅仅经过一、二年的时间, 糖化酶生产菌的活力已从平均发酵单1. 5 万提高到2 万, 其中最高一株达2. 6万。六、分子标记技术20 世纪80 年代初,Botestin等4 首次使用RFLP 作为遗传标记构建人类遗传连锁图,随后各种分子标记技术发展迅速,并在动、植物遗传的研究中得以广泛应用。1983 年第一个转基因植物问世,随后基因工程发展日新月异。迄今为止,全世界已分离目的基因100多个,获得转基因植物近200种,有的已进入或正在进入商业开发阶段,植物基因工程对高科技农业发展的重要性举世瞩目。1988 年以前,玉米组织培养只能用愈伤组织再生植株,原生质体再分化植株没有成功。直到1993 年,玉米基因工程研究才取得了一系列成绩。分子标记自1980 年以来发展迅速。多种DNA 分子标记技术的应用,解决了许多玉米遗传育种工程技术上的难题。转基因技术5 、分子标记技术6等基因工程技术被广泛应用于玉米自交系的遗传多样性分析,玉米优势群划分,玉米雄性不育系的研究,玉米品质改良,玉米病虫害抗性等方面。DNA分子标记类型已有30多种，不同类型各有特点7。玉米是利用分子标记最早的作物之一，目前应用较多的类型主要有8：1、RFLP(限制性片段长度多态性)标记9-10。主要优点是多态性丰富，检测效率高，结果稳定可靠，而且标记性状为共显性，易于区分杂合体和纯合体。缺点是构建和应用此种标记费时、费钱，常需要同位素，选用此种标记应考虑经费、技术和实验条件是否允许。该标记主要用于遗传连锁图的绘制和目标基因的定位RAPD随机扩增多态性DNA 标记。主要优点是建立和应用均简便、快速、费用低、无放射性。缺点是多数位点的标记带表现为显性特点，不能提供完整的遗传信息，在一些作物上扩增产物的稳定性差，建立稳定的辅助选择体系比较难。该标记已广泛用于种质资源鉴定和分类、玉米自交系杂种优势群划分、杂种优势预测。2、SSR（简单重复序列多态性)标记。主要优点是可靠性强，重复性高，多态性丰富，属于共显性标记，不使用同位素，具有PCR方法的优点。缺点是操作步骤较长，实验成本较高，耗费时间较长，不能完全适应实际检测的需要。SSB 标记由于其技术基础是PCR，只要标记选择的体系建立起来，很容易在育种上推广应用14。该标记已开始在资源鉴定、连锁图绘制及目标基因的标记等研究中应用，特别是在玉米杂交种的纯度鉴定和真伪鉴定方面具有明显优势。 3、RA PD 是1990 年由W illiam s 和W elsh 领导的2 个研究小组几乎同时发展起来的建立在PCR 基础上的一种新型的DNA 分子标记技术11-12。RA PD 技术具有其自身独特的优点: 不需要DNA 探针; 使用随机引物, 合成引物时无需预知被研究的生物的基因组序列, 一套引物可用于不同生物的研究; RA PD 技术操作简便、快速, 可免去RFL P 中的克隆制备、同位素标记、Sou thern 杂交等步骤; RA PD 分析所需DNA 量少, 每个反应仅需几十纳克的DNA , 但RA PD 技术也有自身的局限性, 主要表现在两个方面。第一,RA PD 标记为显性分子标记, 因此不能在F2 代区分纯合体与杂合体, 必须进行F3 分析; 第二, RA PD 扩增中退火温度较常规的PCR 反应低, 一般为36 左右, 这样能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对并允许适当的错配, 增大了引物在基因组DNA 中配对的随机性, 提高了对基因组的分析效率, 但是由于采用的引物短, Tm 值低, 扩增结果易受外界因素的影响, 实验的重复性较差, 因此在实验中要严格控制实验条件, 才能得到可重复、理想的扩增效果。4、ALFP(扩增片段长度多态性)标记13。该标记被认为是兼有RFLP和RAPD两种标记的长处，能提供更多的多态性信息，是DNA多态性检测的一种非常有用的技术。缺点是该标记需要较好的仪器设备，建立和应用标记比较费时费钱，同时对DNA纯度和内切酶的质量要求较高。七、目前分子标记用于育种存在的问题及解决方法有人认为，分子标记为育种者提供了关于自交系与杂交种表现之间的关系及自交系选择的有用信息。尽管同一标记在自交系与杂交种水平测定之间存在着显著相关， 但不足以预测杂交种的表现。Stuber和Thomas等为了克服分子标记上的一些局限，进行了QTL方面的研究。、遗传图谱目前所绘制的作物遗传图谱都是以RFLP绘制，在育种中不易利用。应把该图转化为以PCR为基础的RAPD和SSR等分子标记，尽快建立简便的RAPD遗传图谱。、多态性频率与育种目标性状连锁分子标记的多态性频率较低，应提高标记多态性的频率和稳定性，注意新标记技术的发现及应用，并进行更多重要农艺性状基因的精细定位。、操作性及费用在DNA提取、定量和PCR扩增以及数据处理等方面的自动化程度较低，所需仪器设备及试剂价格昂贵。应提高标记过程中各步骤的自动化程度，设法降低试剂价格，即降低标记所需成本，并建立一个包括基因鉴定、标记和作图的高效、经济又简便的监测系统。、应用性展望以前，分子标记技术同常规育种相脱节，大多数分子标记仍停留在实验室阶段，分子标记技术用于大规模育种和种质鉴定还有一段距离。现在，应把分子标记技术同常规育种的丰富经验相结合，充分利用国外研究成果，不做重复工作，结合我国实际情况，搞好我国特有种质资源分子标记及与高产、优质和高抗有关新基因的发现、鉴定和利用，并进行相关的标记和定位工作，拥有自己的知识产权，并将其转化成一定的经济效益15。参考文献：1 张鹏. 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