(完整)HIV-P24蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备-8.24修改.doc

HIV 1HIV 1 P24P24 蛋白的原核表达及单克隆抗体的蛋白的原核表达及单克隆抗体的 制备制备 汪龚泽 刘朝奇 杨建林 覃晓琳 吕佰瑞 姚佳红 三峡大学分子生物学研究所 湖北 宜昌 443002 摘要 目的 制备 HIV 1 P24 蛋白及单克隆抗体 建立 ELISA 方法用于检测 HIV 感染 方法 用 PCR 方法扩增 P24 基因 将其克隆到原核表达载体 PET 28a 中 经大肠杆菌表达并纯化 HIV 1 P24 蛋白 以纯化的 P24 蛋白抗原 免疫 Balb c 小鼠 取其脾淋巴细胞与 SP2 0 细胞融合 制备能产生 P24 单克隆 抗体的杂交瘤细胞株 进一步采用 Western blotting ELISA 等技术对制备的单 克隆抗体进行初步鉴定 建立了 P24 的 ELISA 竞争法 结果 原核表达重组质 粒在大肠杆菌中能高效表达 P24 蛋白 并进一步从杂交瘤细胞中选取了能稳定分 泌 P24 单抗的杂交瘤细胞株 应用 ELISA 竞争法测定的 HIV 1 阳性病人血浆 P24 与病毒载量显著相关 结论 成功制备了 P24 蛋白及特异性单克隆抗体 建立了 P24 的 ELISA 竞争法 关键字 HIV 1 P24 原核表达 单克隆抗体 ELISA Expression of HIV 1 P24 protein and Preparation of its monoclonal antibodies WANG GONG ZE LIU CHAOQI YANGJIANLIN QINGXIAOLIN LVBAIRUI Institute of Molecular Biology Three Gorges University Yichang HUBEI 443002 China ABSTRACT Objective To construct Prokaryotic expression plasmid of HIV 1 P24 purify recombinant HIV 1 P24 protein and prepare its monoclonal antibodies Methods HIV 1 P24 cDNA was cloned into prokaryotic expression vector pET28a and was further transformed into E coli BL21 DE3 The recombinant HIV 1 P24 protein was used to immunize Balb c female mouse The splenocytes were fused with SP2 0 hybridoma to produce monoclonal antibody against HIV 1 p24 protein Western blotting and ELISA were carried out to identify the monoclonal antibody produced by these hybridomas Results HIV 1 P24 plasmid was successfully constructed and identified by enzyme digestion and sequencing HIV 1 P24 protein was expressed in the E coli BL21 DE3 and purified by affinity chromatography After the immunized murine splenocytes were fused with SP2 0 hybridoma we selected hybridoma cell lines which were able to produce monoclonal antibodies against HIV 1 P24 stablely Competition ELISA assay was established and the p24 protein of HIV 1 positive plasma was significant correlated with the HIV 1 viral load Conclusions We successfully expressed HIV 1 p24 and prepare hybridomas which can stablely produce monoclonal antibodies against HIV 1 P24 KEY WORDS HIV 1 P24 prokaryotic expression monoclonal antibody ELISA HIV 是艾滋病的病原体 主要通过性接触 血液和母婴传播 近年来 HIV 感染患者数量一 直呈上升趋势 根据卫生部统计 中国自 1985 年发现第一例艾滋病病人以来 截至 2009 年 10 月底 累计报告艾滋病病毒感染者和病人 319 877 例 2009 年当年新发艾滋病病毒感染者 4 8 万人 我国艾滋病疫情形势依然严峻 性传播正在成为主要传播途径 1 而目前测定血清 HIV 抗体是诊断 HIV 感染的常规实验方法 但是测定 HIV 抗体有局限性 有超过 70 的 HIV 感染者在 感染 6 个月后才能检测出抗体 在同性恋群体 这个数字超过 80 检测抗体方法增加了 HIV 窗 口期 传播的危险 2 另外新生儿产生抗体需要出生 1 年后 来自母亲的 HIV 抗体会致使假阳 性产生 由于 HIV 抗体在疾病过程中持续存在 只是到艾滋病晚期时消失 无法作为治疗监测的稳 定指标 3 P24 是 HIV 病毒颗粒的主要结构蛋白 是结构基因 gag 的产物 在病毒的包装和成熟过程中 起重要作用 4 P24 蛋白的氨基酸序列在 HIV 各毒株之间高度保守 缺失 P24 会导致病毒无法正 常组装 P24 蛋白特异性很强 与多数其他逆转录病毒无交叉反应 HIV 感染人体 感染者血液 中首先出现的病毒标志物为病毒 P24 蛋白 从病毒感染到检出抗 HIV 抗体之间存在较长的窗口 期 因此检测 HIV 1 P24 抗原已在 HIV 感染的早期诊断 患者的预后判断 筛选和评价抗 HIV 的药物 以及发现母 婴传播等方面发挥了重要作用 5 6 且大量科学家不断探索和建立提高 HIV P24 抗原敏感性的方法 Dos Ramos Farias 等 7 对婴儿的血浆样品离心后再进行检测 导 致 P24 抗原检测的敏感性显著增加 瑞士国家逆转录病毒中心 SNCR 报道了一种缓冲液 在 检测过程中使用该缓冲液可以提高 P24 抗原的检测能力 8 本课题组由此克隆表达 p24 蛋白 并 获得 p24 的单克隆抗体细胞株并进行了临床样本检测 为检测 HIV 感染提供实验基础 1 材料和方法 1 1 材 料 实验所需限制性内切酶 T4 连接酶及 TaqDNA 聚合酶均购自 Fermentas 公司 菌株 E coli DH5 E coli BL21 DE3 质粒 pET28a 和 HIV 1 HBX2 重组质粒由本研究所保存 鼠源的抗 HIS 标签抗体 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司 Balb c 小鼠购自湖北省实验动物中心 RPMI 1640 次黄嘌呤 H 胸腺嘧啶 T HEPES ABTS MBS 购自 Sigma 氨基蝶呤 A PEG MW1500 购自 Fluka SP2 0 细胞本研究所保存 1 2 方 法 1 2 1 pET28a p24 基因重组质粒的构建 以 HIV 1HBX2 基因为模板 PCR 方法扩增 P24 基因 设计引物为 5 CAGGATCCCTATAGTGCAGAACATCCAGG 3 5 CGACTCGAGCAAAACTCTTGCCTTATGG 3 其引物中分别引 入酶切位点 BamHI XhoI 原核表达载体 PET28a 用 BamHI XhoI 双酶切将其线性化后 与 P24 段目的基因的酶切产物于 16 连接过夜 5 l 连接产物转入大肠杆菌 DH5a 中 接种 LB 卡 那霉素抗性固体培养基 37 培养过夜 挑取单克隆至 1 5ml 卡那霉素 LB 培养基中 37 220 r min 培养过夜 次日提取质粒用于酶切和测序鉴定 1 2 2 pET28a P24基因原核表达与鉴定 将构建好的重组质粒 pET28a P24 转化到宿主菌 BL21 DE3 中 经 IPTG 终浓度 1 0mmol L 诱导表达 收集的细菌加入等体积 2 SDS 凝胶上样缓冲液 100 煮沸 3min 冰浴 4min 室温下离心 12000r min 1min 取 20 l 进行 SDS PAGE 电泳 9 考马斯亮蓝染色 通过凝 胶成像系统测定表达产量 Western blot 检测重组 pET28 a P24 蛋白 SDS PAGE 电泳后转 移硝酸纤维素膜 用 5 脱脂奶粉封闭 加抗 HIS 标签单克隆抗体 1 500 室温轻摇作用 2 h TBST 洗涤 3 次 每次 5min 加入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 1 2000 室温反应 2 h 同上洗涤 ECL 显色 1 2 3 PET28a P24 蛋白的纯化 质粒 PET28a P24 阳性菌 BL21 DE3 经 IPTG 诱导表达 5000 r min 离心收集菌体 将细菌 重悬于 BufferA 中 0 5mol LNaC l 20mmol LTris HC l pH 8 0 4 条件下超声波破碎细菌 离心洗涤包涵体 8mol L 尿素变性增溶后经 Ni NTA agarose 亲和柱分离纯化目的蛋白 纯化 蛋白使用透析方法复性 尿素浓度梯度依次为 6mol L 4 mol L 2 mol L 1 mol L 0 25 mol L 0 1mol L 0 mol L 每个浓度透析时间为 12h 1 2 4 制备p24 单克隆抗体 以 50 g P24 蛋白抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剂 经皮内多点注射进行免疫 1 个月后 用 相同剂量的抗原加弗氏不完全佐剂经尾静脉进行加强免疫共 3 次 每次间隔 2 周 经免疫后小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤 Sp2 0 细胞以 50 PEG 促融 培养至第 10 d 以间接 ELISA 法筛选阳性孔 有限稀释法克隆化 3 次至克隆生长孔 100 阳性 克隆化后的细胞株经传代 确定为稳定的细胞株后 液氮保存 Balb c 小鼠腹腔注射液体石蜡 0 5 ml 鼠 10 d 后腹腔 注射杂交瘤细胞 1 106个 鼠制备腹水 取腹水 mAb 经饱和硫酸铵分级沉淀后 用 ddH2O 溶解收 集加等量的无菌丙三醇 20 保存 1 2 5 Western blotting鉴定P24单克隆抗体及ELISA法测定抗体效价 Western blotting 鉴定 P24 单克隆抗体 取 P24 蛋白及阴性和阳性对照蛋白 进行 SDS PAGE 电泳 转移硝酸纤维素膜 制备成抗原条带 用 5 脱脂奶粉封闭 分别以 HIS 标签抗体或 p24 单克隆抗体或正常鼠血清为一抗 1 500 室温轻摇作用 2 h TBST 洗涤 3 次 每次 5min 加 入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 1 2000 室温反应 2 h 同上洗涤 ECL 显色 ELISA 法测定抗体效价 使用碳酸盐缓冲液包被 P24 抗原 浓度为 1ug ml 每孔 100ul 4 包被 16 小时 使用 PBST 洗涤液洗涤 ELISA 板三次 1 BSA 37 封闭 1 小时 在每条 ELISA 板分别以 1 100 1 500 1 2500 1 12500 1 62500 1 312500 1 162500 的稀释抗体作为一 抗加入 ELISA 板 其中以 PBST 代替 P24 单克隆抗体作为阴性对照 37 孵育一小时后 使用 PBST 洗涤液洗涤 ELISA 板三次 并在洗涤后加入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 1 2000 作为二抗 37 孵育一小时后 同样洗涤 TMB 显色 2M H2SO4终止反应 在 450nm 波长测定吸光度值 1 2 6 ELISA法检测艾滋病病人血浆P24含量 标准曲线制备 应用竞争抑制 ELISA 方法 使用碳酸盐缓冲液包被 P24 抗原 浓度为 1ug ml 每孔 100ul 1 BSA 37 封闭 1 小时 然后每孔加入一抗为 1 200 倍稀释的 P24 单 克隆抗体和不同浓度的 P24 蛋白 37 孵育一小时 其中阴性对照为不加 P24 单克隆抗体 阳性 对照为不加 P24 蛋白 洗涤后加入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 1 2000 37 孵育一小时后 同 样洗涤 TMB 显色 测定吸光度值 绘制标准曲线 以 P24 蛋白为抗原包被 包被浓度同上 使用 0 5 Tritonx 100 将 HIV 1 阳性的血浆样本 处理 50 倍稀释后 与 1 200 倍稀释的 P24 单克隆抗等体积混合 37 孵育一小时 使用 PBST 洗涤液洗涤三次 加入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 1 2000 37 孵育一小时 洗涤 TMB 显色 测定吸光度值 2 结 果 2 1 重组质粒 pET28a p24 片段的构建 应用 PCR 方法从 HIV 1 基因中获得 p24 基因片段 经过内切酶 连接酶将其插入 pET28a 载体中 获得 pET28a p24 重组质粒 构建的重组质粒 pET28a p24 经 BamHI XhoI 双酶 切鉴定 得到 693bp 的目的条带 1 琼脂糖凝胶电泳结果如图 1 所示 与预期大小相同 DNA 测 序鉴定结果与我们设计的 HIV 1P24 HBX2 获取片段的核苷酸序列一致 ab 图 1 重组质粒 pET28a p24 的构建 Fig 1 Construction of recombinant plasmid pET28a HIV 1p24 a Amplification of p24 fragment by PCR 1 1kb DNA Marker 2 PCR product of p24 fragment b Identification of pET28a HIV 1p24 by enzyme digestion 1 1kb DNAMarker 2 pET28 a p24 digested with BamHI XhoI 2 2 SDS PAGE 电泳和 Western blot 分析 将重组质粒 pET28a p24 质粒转化至大肠杆菌 BL21 DE3 感受态细胞内 1 0mmol L IPTG 诱导 4 6h 后 表达蛋白经 12 SDS PAGE 电泳 诱导后的菌液在约 26kDa 处出现明显的目 的条带 未经诱导的菌液无相应条带 图 2a 蛋白凝胶分析图表明 pET28 a p24 蛋白表达 量约占全菌体总蛋白的 19 电泳分离的蛋白转印到硝基纤维膜条 以抗 HIS 标签抗体为一抗 HRP 标记的羊抗鼠抗体为二抗 对表达产物进行 Western blot 分析 得到的特异性蛋白的分子量 约为 26kDa 的蛋白 图 2b ab 图2 HIV 1 p24重组蛋白的鉴定 Fig 2 Analysis of HIV 1 p24 recombinant protein a Analysis of recombinant protein p24 expression by SDS PAGE 1 protein Marker 2 non induced bacteria of BL21 DE3 p24 3 induced bacteria of BL21 DE3 p24 4 5 purified protein b detection of recombinant protein p24 by Western Blot 1 non induced bacteria 2 induced bacteria 3 purified protein 2 3 p24 单克隆抗体效价及特异性测定 将纯化的 p24 蛋白包被 ELISA 板 将纯化后单克隆抗体进行梯度稀释 经 ELISA 检测抗体 具有较高的效价 最高可达到 3 万多倍 具有良好的量效关系 图 3 阴性对照孔 OD 值为 0 136 将 IPTG 诱导的 p24 菌 未诱导的菌作为阴性对照组及 HIS 标签蛋白为阳性对照的三个 样品经 SDS PAGE 电泳 转印到硝基纤维膜条上 分别用 p24 单克隆抗体 HIS 标签抗体以及正 常血清为一抗 HRP 标记的羊抗鼠抗体为二抗 结果显示单克隆抗体 p24 能够特异性结合 p24 蛋白 具有很好的特异性 图 4 0 0 0 0 5 5 1 1 1 1 5 5 2 2 2 2 5 5 3 3 3 3 5 5 4 4 5 50 02 25 50 01 12 25 50 06 62 25 50 03 31 12 25 50 0 抗抗体体稀稀释释倍倍数数 吸吸光光度度值值 4 45 50 0n nm m 图 3 ELISA 测定 HIV 1 p24 单克隆抗体效价 Fig 3 Detection of HIV 1 p24 antibody with ELISA 图 4 HIV 1 P24 抗体特异性的 Western blot 鉴定 Fig4 Identification of the specificity of HIV 1 P24 antibody with Western blot 1 4 7 His postive protein 2 5 8 p24 antigen protein 3 6 9 bacteria protein 2 4 ELISA 法检测艾滋病病人血清的病毒载量 应用 p24 蛋白和制备的单克隆抗体建立竞争抑制 ELISA 法 首先建立标准曲线 其结果显示 随 p24 蛋白浓度的增加其吸光值逐渐降低 二者呈高度的负相关性 R2 0 9717 图 5 应用 建立的 ELISA 方法测定 HIV 1 阳性病人血浆 p24 含量 并与 RT PCR 法检测的病人血浆病毒载量 进行相关性分析 结果表明 ELISA 的吸光值与病毒载量也呈高度的负相关性 R 0 9207 这些 结果提示制备的单克隆抗体具有很好的识别病毒 P24 抗原作用 图 6 y 1 024x 2 6076 R2 0 9717 1 1 5 2 2 5 3 0 500 511 5 P24 浓度 log10 ug ml 吸光度值 450nm 图 5 HIV 1 p24 蛋白竞争抑制 ELISA 标准曲线 Fig 5 Standard curve of p24 antigen by competitive ELISA y 0 5645x 5 8665 R2 0 8477 1 1 5 2 2 5 3 3 5 4 44 555 566 577 5 病毒载量 log10 copies ml P24 吸光度值 450nm 图 6 病毒载量与 ELISA 吸光值的相关曲线 Fig 6 Correlation analysis of HIV 1 p24 protein and virus load 3 讨论 目前临床可以用于检测 HIV 感染 并监测疾病进展的方法有 HIV 抗体检测 P24 抗原检测 HIV 核酸检测以及 T 淋巴细胞计数 总的来说 ELISA 检测抗体和 P24 抗原的方法是比较经济 省 时 同时也比较节省人力资源的 美国 FDA 已规定 自 1995 年 8 月起 所有全血 成分血 白细 胞和原料血浆的献血员 在献血前必须进行 HIV 1 抗原的筛查 P24 抗原更适合作为治疗何时开 始以及治疗是否有效的标志物 美国艾滋病临床实验组认为 血浆 P24 浓度下降一半表明抗病毒 治疗有效 P24 浓度持续升高表明缺乏有效治疗 10 P24 蛋白质作为结构基因 gag 的编码产物 分子结构及其对机体的免疫作用机理已得到阐 明 多种检测方法已应用于临床 尤其是 P24 蛋白检测的试剂盒已经得到广泛的应用 但由于起 检出的假阳性率高 一直未能应用于普查并和作为艾滋病的治疗的有效手段 本实验成功制备 了 P24 抗原蛋白及其单克窿抗体 并检验了抗体的效价 特异性 结果都显示制备的单克隆抗体 具有很高的特异性 并通过建立的 ELISA 竞争法检测 HIV 阳性病人血浆 并与检测的病毒载量 进行相关性分析 验证两者具有显著的相关性 论证了我们建立的检测方法可以和 PCR 检测的 效果相当 进一步说明制备的单克窿抗体特异性和敏感性 也提示我们本实验制备的 P24 蛋白 及相应的单克隆抗体将为 ELISA 试剂盒检测爱滋病提供实验基础 REFERENCES 1 卫生部介绍中国艾滋病疫状 2 Puchhammer Stockl E Schmied B Rieger A SarclettiM et al Low Proportion of Recent Human Immunodeficiency Virus HIV Infections among Newly Diagnosed Cases of HIV Infection as Shownby the Presence of HIV Specific Antibodies of Low Avidity Journal of Clinical Microbiology 2005 43 1 497 498 3 Ledergerber B Flepp M Boni J et al Human immunodeficiencyvirus type 1 p24 concentration measured by boosted ELISA of heat enatured plasma correlates with decline in CD4 cells progression to AIDS and survival comparison with viral RNA measurement JInfect Dis 2000 181 1280 1288 4 Jacqueline DR RobertW D Human immunodeficiency virus type J Gen Virol 2002 83 1253 65 5 Ondoa P Dieve TN Vereecken C et al Evaluation ofHIV 1 p24 anti genemia and level of CD8 CD38 T