植物生理生化测定.doc

2.1.8转基因植株在盐胁迫下的超氧化物歧化酶(SOD)活性测定将转基因植株与非转基因对照植株继代于含有0.5% NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养，培养条件为271，每天13 h、3000 lux光照。胁迫培养4 w后，取其叶片测定其SOD活性，每个样品设3次重复，求其平均数，并进行多重比较。2.1.8.1主要试剂及配方（1）0.1 mol/l pH 7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液A液（0.1 mol/l Na2HPO4溶液）：称取Na2HPO412H2O 7.163 g，用少量蒸馏水溶解后定容至200 ml，4冰箱中保存备用；B液（0.1 mol/l NaH2PO4溶液）：称取NaH2PO42H2O 0.780 g，用少量蒸馏水溶解后定容至50 ml，4冰箱中保存备用；取上述A液183 ml与B液17ml充分混匀后即为0.1 mol/l pH 7.8的磷酸钠缓冲液，4冰箱中保存备用。（2）0.026 mol/l甲硫氨酸（Met）磷酸钠缓冲液称取甲硫氨酸（C5H11NO2S）0.388 g，用少量0.1 mol/l pH 7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，再用相同磷酸钠缓冲液定容至100 ml，现用现配，4冰箱中保存可用12 d。（3）7.5 10-4 mol/l NBT溶液称取NBT（C40H30Cl2N10O6）0.153 g，用少量蒸馏水溶解后，定容至250 ml，现用现配，4 冰箱中保存可用23 d。（4）含1.0 mol/l EDTA的20 mol/l核黄素溶液A液：称取EDTA 0.003 g，用少量蒸馏水溶解；B液：称取核黄素0.075 g，用少量蒸馏水溶解；C液：合并A液和B液，定容至100 ml，此溶液即为含0.1 mmol/l EDTA的2 mmol/l 核黄素溶液，避光保存（可用黑纸将装有该液的棕色瓶包好），4 冰箱中可保存810 d，当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0 mol/l EDTA的20 mol/l核黄素溶液。（5）含2% PVP的0.05 mol/l pH7.8磷酸钠缓冲液取0.1 mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液50 ml，加入2 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮），充分溶解后移入100 ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀，4 冰箱中保存备用。2.1.8.2提取及测定方法（1）称取1.0 g样品叶片于预冷的研钵中，加入4 ml预冷的提取介质（含2% PVP的0.05 mol/l pH7.8磷酸钠缓冲液），冰浴研磨匀浆，转入10 ml离心管，并用提取介质定容至5 ml；（2）4 10000 rpm离心10 min，取上清即为酶液提取样品；（3）取透明度好的10 ml离心管，每个株系3次重复，按照下表加入试剂：试剂用量（ml）0.05 mol/l磷酸缓冲液（2% PVP）0.8750.026 mol/l Met缓冲液1.5750 mol/l NBT0.31 mol/l EDTA及20 mol/l核黄素0.3酶提取液（对照管以磷酸缓冲液代替）0.025总体积3.0（4）设3个对照（CK1、CK2、CK3），将CK1包上铝箔避光，与其它样品管（包括CK2和CK3）同时置于4500 lux日光灯下反应25 min，反应温度28；（5）SOD活性测定与计算：至反应结束，立即用黑布遮蔽以终止反应。以遮光的对照管CK1作为空白调零，在560nm波长下测定各管的吸光度，CK2和CK3的平均值作为对照，按下例公式计算SOD活性（SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位）：SOD活性（U/g）=（OD0 -OD560）VT（OD00.5FWV1）OD 0光照对照管的光吸收值；OD 560样品管的光吸收值；VT样液总体积（ml）；V1测定时样品用量（ml）；FW样品鲜重（g）。2.1.9转基因植株在盐胁迫下的丙二醛(MDA)含量测定将转基因植株与对照植株继代于含有0.5%NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养，培养条件为271，每天13 h、3000 lux光照。胁迫培养4 w后，取整株测定其丙二醛含量，每个样品设3次重复，求其平均数，并进行多重比较。2.1.9.1主要试剂及配方（1）5%三氯乙酸（TCA）：称取5 g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，再定容至100ml；（2）0.5%硫代巴比妥酸（TBA）：称取0.5 g硫代巴比妥酸，用5%TCA定容至100 ml。2.1.9.2提取及测定方法（1）称取1.0 g材料，加入10 ml 5%三氯乙酸（TCA）和少量石英砂，研磨至匀浆；（2）3000 rpm离心10 min，取上清即为丙二醛提取液；（3）取1.5 ml上述提取液（对照管取1.5 ml 5% TCA），加入2.5 ml 0.5% TBA，混匀后于沸水浴中反应15 min，迅速冷却；（4）1800 g离心10 min；（5）取上清液测定532和600 nm波长处的吸光度，以蒸馏水调零；（6）含量计算：丙二醛含量（nmol/g）=（OD532-OD600）AV /（0.155FWa）OD532样品管在532 nm处的光吸收值；OD600样品管在600 nm处的光吸收值；A反应液总体积（ml）；V提取液总体积（ml）；FW样品鲜重（g）；a测定用液总体积（ml）。2.1.10转基因植株在盐胁迫下的脯氨酸含量测定将转基因植株与对照植株继代于含有0.5%NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养，培养条件为271，每天13 h、3000 lux光照。胁迫培养4 w后，取其叶片测定其脯氨酸含量，每个样品设3次重复，求其平均数，并进行多重比较。2.1.10.1主要试剂及配方（1）6 mol/l 磷酸：量取102.5 ml 85%的磷酸，定容至250 ml；（2）2.5% 酸性茚三酮：称取2.5 g茚三酮，加入60 ml冰醋酸和40 ml 6 mol/l磷酸，于70 下加热溶解，冷却后贮存于棕色瓶中尽快使用，4可保存3 d。2.1.10.2提取及测定方法实验分为脯氨酸标准曲线的制作和植物样品的提取及测定两个部分，具体步骤如下：脯氨酸标准曲线的制作：（1）称取10 mg脯氨酸溶于少量无水乙醇中，用蒸馏水定容至100 ml，配成100 g/ml的母液；（2）取上述母液0，1.25，2.5，5.0，7.5，10，12.5，15 ml分别放入8个25 ml的容量瓶中，再分别加入蒸馏水定容至25 ml，配制成0，2.5，5.0，10，15，20，25，30 g/ml系列浓度的溶液；（3）分别取上述溶液2 ml，加入2 ml冰醋酸，2 ml酸性茚三酮（注意不要接触皮肤），摇匀，沸水浴显色15 min，冷却后于520 nm处测OD值；（4）以OD值为横坐标，脯氨酸含量为纵坐标，绘制标准曲线。植物样品中脯氨酸的提取及测定：（1）称取胁迫处理过的植株叶片1.0 g，剪碎，加入5 ml 80% 乙醇于研钵中研磨成匀浆；（2）将匀浆液体全部转移至25 ml刻度的试管中，加水补足25 ml，混匀，80水浴提取20 min；（3）加入0.5 g人造沸石，0.2 g活性炭，于振荡器上振荡1 min混匀，过滤；（4）取2.5 ml滤液，按制作标准曲线的方法测定各个样品的OD值；（5）从制作得到的标准曲线上检出被测样品中脯氨酸的含量，最后换算得到游离脯氨酸的平均含量：脯氨酸含量（g/g）=（CV/a）/FWC曲线查C值（g）；V提取液总体积（ml）；a测定液体积（ml）；FW样品质量（g）。2.1.11转基因植株在盐胁迫下的叶绿素含量测定将转基因植株与对照植株继代于含有0.5%NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养，培养条件为271，每天13 h、3000 lux光照。胁迫培养4 w后，取其叶片测定其叶绿素含量，每个样品设3次重复，求其平均数，并进行多重比较。2.1.11.1主要试剂及配方80% 丙酮：量取80ml丙酮，定容至100 ml。2.1.11.2提取及测定方法（1）称取胁迫处理过的植株叶片0.2 g，剪碎至研钵中，加入 5 ml 80% 的丙酮，研成匀浆；(2) 用一层加丙酮润过的滤纸过滤，再用少量丙酮将滤纸和研钵上的色素冲洗干净，定容至 10 ml，摇匀；(3) 吸取 2 ml 含有叶绿素的丙酮提取液，加 80% 的丙酮 2 ml 稀释后，倒入比色杯中，用分光光度计分别在 645 nm、663 nm、652